Retina hücrelerinin in vivo görüntülenmesi için kullanılan bu yöntem, oftalmolojik hastalıkların araştırılmasına ve retinanın normal fonksiyonlarının anlaşılmasına olanak sağlar. Bu yöntem, iki foton mikroskopisi ile retinanın in vivo görüntülenmesine basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Fareyi düzgün bir şekilde stabilize etmek, in vivo görüntülerde kaliteli görüntüler elde etmenin anahtarıdır.
Fareyi baş tutucuya yerleştirme alıştırması yapın ve görüntü almaya çalışmadan önce prosedürle rahat olun. Onaylanmış hayvan kullanım protokolüne göre hayvanı sakinleştirin. Öğrenci dilatasyon çözeltisi uygulayın ve öğrencilerin genişlemesine izin vermek için fareyi beş dakika karanlıkta bırakın.
Alt kulak kanalı pimini içe doğru uzatılmış pozisyonda ve üst kulak kanalı pimini çekilmiş pozisyonda sabitleyin. Kulaklık çubuğu yataydan aşağıya 60 derecelik bir açıyla eğilene kadar kafa tutucunun ana kolunu döndürün. Fare ısırık çubuğuna bakarken, bir kulağınızı, pimi kulak kanalına takılı olacak şekilde genişletilmiş alt pime monte edin.
Üst kulak kanalı pimini sabitleyen vidayı gevşettikten sonra, pimi diğer kulak kanalına uzatın ve kafayı sabitlemek için vidayı yeniden sıkın. Farenin baş tutucusunda güvenli olduğundan emin olun. Başın üstüne bastırın.
Fare kulak çubuklarında güvenli bir şekilde kalmalı ve başı kulak kanallarının ekseni etrafında serbestçe dönmelidir. Isırma çubuğu farenin başına doğru konumlandırıldığında, maksiller kesici dişlerin ısırık çubuğu tutucusuna indirilmesine izin vermek için farenin başını yavaşça kaldırın ve kafayı sabitlemek için ısırık çubuğunu yumuşak bir kuvvetle geri çekin. Isırık çubuğunu yerine sabitlemek için vidayı kullanın ve fareyi ve tutucuyu mikroskop aşamasına yerleştirin.
Farenin her iki gözüne de kayganlaştırıcı göz damlaları uygulayın. Bir gözün göz bebeği ışık yoluna göre yönlendirilene kadar kafa tutucunun ana kolunu döndürün ve kompakt filtre tutucusuna 1,5 numaralı bir kapak kayışı yerleştirin. Tutucuyu mikroskop aşamasına sabitledikten sonra, örtü kapağını korneaya dokunmadan yağlayıcı göz jeline temas edene kadar indirin ve geniş alan uyarma ışığı korneayı tamamen kaplayana kadar sahneyi X-Y boyutunda ve objektif Z konumunda ayarlayın.
Retinadaki floresan hücreler veya yapılar odaklanana kadar Z-pozisyonunu ayarlamaya devam etmek için göz merceğini kullanın ve ilgilenilen tek tek hücreleri veya yapıları çözmek için gerektiğinde epifloresan aydınlatıcıyı artırın. Retinanın görüntüleme ışığı yolu ile hizalanmasına ince ayar yapın. Odak düzlemini değiştirirken odak dışı ışıkta yalnızca genişleme veya büzülme meydana gelene kadar kafa açısını ayarlayın ve X-Y bozulmalarını en aza indirin.
Ardından, epifloresan aydınlatıcıyı kapatın ve aydınlatıcı deklanşörünü kapatın. İki fotonlu görüntüleme için, tüm kurumsal lazer güvenlik protokollerini izleyin. Tüm ortam ışığını kapatıp örtün ve uyarma ışığı yolunu lazere ve emisyon ışığı yolunu PMT'lere çevirin.
Görüntü alma yazılımında, kare boyutunu 512 x 512 ve kare ortalamasını üç olarak ayarlayın. Z-adımını yığının tepesinden başlayacak ve aşağıya doğru ilerleyecek şekilde ayarlayın, böylece fotoreseptörlerin iki fotonlu lazer aktivasyonunu en aza indirin. PMT'leri açıp etkinleştirin ve voltajı 680 volta ayarlayın.
Görüntüleme ve emisyon panjurlarını etkinleştirin. Hedef dokunun %1 lazer gücünden başlayarak canlı görüntü önizlemesine başlayın ve ilgilenilen hücreleri veya yapıları görselleştirmek için ekran parlaklığını otomatik olarak ayarlayın. Hedef doku loş veya belirsizse, yapılar 45 miliwatt'ı geçmeden görünür hale gelene kadar lazer güç yüzdesini artırın.
İstenilen bir görüntüleme alanını ortalamak için mikroskop aşamasını X-Y yönünde manevra yapın ve odakta ilgilenilen yapılarla Z-düzlemine gidin. Kronik bir hızlandırılmış deney için, daha önce elde edilmiş bir görüntüyü, geçerli görüntüdeki görüntüleme açısının önceki görüntülerinkine benzer olmasına dikkat ederek, ilgili hücreler için referans olarak kullanmak üzere açın. Ardından, görüntüleme yığınının Z sınırlarını ayarlamak ve görüntüyü almak için ilgilendiğiniz en üstteki ve en alttaki Z düzlemlerine gidin.
Tüm görüntüler elde edildiğinde, PMT'leri ve lazer deklanşörü devre dışı bırakın. Uyarma ışığı yolunu epifloresan aydınlatmaya ve emisyon ışığı yolunu göz merceğine geri döndürün. Ardından, görüntü alma yazılımından çıkın, bilgisayar arabirimindeki lazeri kapatın ve her zaman açık olan donanım dışında donanımı ters başlatma sırasına göre kapatın.
Analizin sonunda, fareyi baş tutucudan çıkarın ve göz jelini nazikçe çıkarmak için tüy bırakmayan bir doku kullanın. Daha sonra, her iki göze de kayganlaştırıcı göz merhemi uygulayın ve fareyi, fareyi muhafazasına geri döndürmeden önce, tam yaslanıncaya kadar izleyen, 37 santigrat derece ılık su sirkülasyonlu bir ısıtma yastığına yerleştirin. VGlut-2-Cre farelerde, retinal ganglion hücreli somalar açıkça fark edilebilir ve akson fasikülleri sıklıkla belirgindir.
Aksonların yörüngesi ve vaskülatürün negatif görüntüsü, VGlut-2-Cre farelerde optik sinir başının tanımlanmasını kolaylaştırır ve bu da kronik görüntüleme deneylerinde bir dönüm noktası olarak yararlıdır. Retinal ganglion hücrelerinin aksine, amakrin hücre nöritleri iç pleksiform tabakalarda daha sık görülür. Göz içi NMDA enjeksiyonundan bir gün sonra, retinal mikroglia önceki raporlara göre kısa süreçler veya amip morfolojisi gösterir.
Evans mavi boyasının, görüntülemeden 30 ila 60 dakika önce tek bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilmesi, optik sinir kafasından çıkan ve en az yedi gün boyunca devam eden kan damarlarının güçlü bir şekilde etiketlenmesine neden olur. Fiksasyondan sonra, düzleştirilmiş retinal bütün montajlardaki hücre çiftleri arasındaki gerçek mesafe, konfokal taramalarda ölçülebilir ve in vivo görüntülerin ortalama piksel boyutunu belirlemek için in vivo piksel mesafeleriyle eşleştirilebilir. Farelerin gözlerine enjekte edilen floresan mikrosferler, mikrosfer çapının in vivo olarak ölçülmesine izin verir, bu da biraz daha büyük bir piksel boyutu tahmini verir, ancak daha fazla varyans ile.
İn vivo görüntüleme, immün boyama ve in situ hibridizasyon gibi histolojik analizlerle eşleştirilebilir. Bu yöntemler spesifik hücre tiplerini tanımlayabilir ve görüntülenen hücrelerin gen ekspresyonunu inceleyebilir.
