Körlük Engellenir Research Kariyer Geliştirme Ödülü tarafından desteklenen, NIH hibe EY19312 ve EY19543 (VJK) yanı sıra, Körlük ve EY02687 (Washington Üniversitesi Göz Hastalıkları ve Görsel Bilimleri Bölümü) Engellenir Research tarafından sınırsız ödenekle.

1. Elektrotlar yapma <ol><li> Cam elektrotlar hazırlayın. 120 mg agar tartılır ve 10 mL distile su (nihai agar konsantrasyonu% 1.2) karıştırın. Sıcak su banyosunda agar çözüm eritin. Plastik şırınga kullanılarak agar solüsyonu: cam kapilerleri (uzunluk = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm ve iç hacmi = 44 uL biz aşağıdaki boyutlara sahip TW100-4 kılcal Kelime Presision Aletleri kullanın) doldurun. 10 dakika oda sıcaklığında agar katılaşmaya. Böylece, en çok 200 ~ kılcal (agar karışımının geri kalanı -4 ° C ve yeniden kullanılabilir birkaç kez de muhafaza edilebilir) doldurulabilir. </li><li> Bir elmas bıçak kullanarak parçaya kılcal kesin. </li><li> 4 ° C&#39;de en az 24 saat için fare elektrot çözüm sonuçlanan cam elektrot Soak 4 ° C&#39;de elektrotlar saklayın ve 3-4 ay boyunca bunları kullanın. </li></ol> 2. Deneme Kurulumu <ol><li> Gecede bir fare koyu adapte. (Örneğin, C yabani türü kullanınÇubuk odaklı transretinal kayıtları ve T α için 57Bl / 6) farelerde - / - farelerde yoksun çubuk koni transretinal kayıtları için 8 sinyalizasyon. </li><li> 1 L perfüzyon çözeltisi, 100 mL elektrot çözümü ve 20 ml inkübasyon solüsyonu (aşağıya bakınız) hazırlayın ve perfüzyon çözüm çukur bir Millipore 0.45 mikron veya filtre 0.22 mikron (isteğe bağlı) filtre. </li><li> Retina düzlemine yerleştirilmiş olan bir fotometre kullanılarak ışık kaynağı (505 nm LED veya halojen ampul optik stimülatör) kalibre. LED ışık kaynağının durumunda, ışık homojenlik elde etmek için bir optik difüzör kullanabilir. </li><li> Deneme (hazne inşaatları değişebilir) için perfüzyon odası hazırlayın. Odamızca küçük bir plastik Petri tabağı kapağı yapılmış bir taban ile 3 mm Pleksiglas yapılmış ve ~ aktif bir perfüzyon hacmi 400 uL (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm) sahiptir. 2 BaCl 2 mM L-glutamat ve 10 mM içeren elektrot çözeltisi ile odasının alt elektrot boşluğu doldurmak. Plastik boru ve cam bir kapiler kullanarak, düşük elektrot alanı (oda altına yapıştırılmış plastik boru bağlantısı yapılmış) ve elektrot tutucu çözümü arasında bir bağ kurmak. Elektrot kabarcık bağlayan boru veya elektrot tutucu (gerekirse plastik şırınga kullanarak çözüm temizlemek) olmadığından emin olun. </li><li> Mikroskobun aşamasında (: mikroskop bir anti-vibrasyon masaya monte edilmiş ve mekanik ve elektromanyetik gürültü en aza indirmek için bir Faraday kafesi içinde korumalı olabilir isteğe bağlı) kayıt odasına monte edin. Diferansiyel amplifikatör (örneğin Warner Instruments DP-311 amplifikatör) pozitif headstage direğe alt elektrot tutucu bağlayın. Merkezi ve uyarıcı ışık spot açılması odasının alt elektrot hizalayın. Kayıt odasına perfüzyon hattı bağlayın ve perfüzyon açın. </li><li> % 95 O 2 /% 5 CO 2 ile Kabarcık perfüzyon solüsyonu 40 içinde kuluçkaya ederken ° C water hamamı. CO 2 7,2 üzere çözeltinin pH ayarlar. Çözüm 36-37 onu yeniden ısıtma seramik bir direnç üzerinden geçen yerçekimi ° C ile şişeden kayıt odasına akar Isı kaybını azaltmak için, ısıtıcı ideal mikroskop sahnede, mümkün olduğunca kayıt odasına yakın bir yerde olmalıdır. </li><li> Bir akış regülatörü ile yaklaşık 1 ml / dak akış hızı ayarlayın. </li><li> Ikinci bir elektrot tutucu kullanarak headstage yılının ikinci (negatif) kutuplu Üst elektrodun bağlayın. O-ring kullanan üst elektrot için termokupl probu bağlayın. Elektrot ve termokupl uçları birbirine yakın sıcaklık okuması mümkün olduğunca retinanın merkezine yakın olarak alınır böylece olduğundan emin olun. Perfüzyon çözelti içinde üst elektrot ucu tutulur ve odasının merkezi yerleştirin. Başlangıç ​​stabilizasyonu için 10-15 dakika bekleyin. </li><li> Çözeltisinin sıcaklığı 36 böylece ısıtıcı DC gerilimini ayarlamak -37 ° C. </li></ol> 3. Fare Retina Ayırma <ol><li> Loş kırmızı ışık altında, CO 2 ve servikal dislokasyon ile karanlığa uyumlu fare euthanize. İsteğe bağlı: koter kalemi veya ısıtılmış diseksiyon iğne ile sklera en dorsal noktası dağlama her fare küresi üzerinde bir referans işareti yapmak. Tüm sonraki işlemler bir mikroskop için uygun kızılötesi görüntü dönüştürücüler kullanarak kızılötesi ışık altında yapılmaktadır. </li><li> Nazik bir basınç uygulayarak ve her gözün iki tarafındaki deri gerilerek eğri makas ile gözleri parçalara ayır. Microscissors veya jilet kullanarak kızılötesi aydınlatma altında hem gözbebekleri Hemisect. </li><li> Kornea ve lens çıkarın. Mümkün olduğunca vitreus kadar çıkarın. </li><li> Pigment epiteli tabakasından retinanın ilk soyun ve gerekirse, pigment epiteli kalan granülleri çıkarmak için forseps ile iyice temizleyin. Biz genellikle çubuk ve koni transret hem de bütün retinanın kullanıyorsanızİnal kayıtları. Ancak, özellikle retinanın bir referans olarak koter işareti kullanarak bir jilet veya microscissors ile Vizör adaptör ventral kısmı kaldırmak soyma önce, daha M / L-koniler 9 olan fare retinanın dorsal kısmından kaydetmek istiyorsanız. </li><li> İnkübasyon çözeltisi ile, küçük bir Petri tabağına yerleştirin ikinci hemisected küresi ve kullanılana kadar saf oksijen ile doymuş bir ışık geçirmeyen kutusuna hazırlanması inkübe edilir. Tipik olarak, bu şartlar altında ikinci fare Eyecup oda sıcaklığında birkaç saat boyunca saklanabilir ve kayıt için kullanılır. </li><li> Bir cam veya plastik pipet kullanarak bir Petri kabının kapağı perfüzyon bir damla (yaklaşık 300 ul) ile izole retina aktarın. BaCl 2 ile ön inkübe retinaya BaCl 2 elektrot içeren solüsyon 5-6 küçük damla ekleyin. Arka tarafında bir kare parça (yaklaşık 5x5 mm) köşe yağlanmış (Dow Corning 111 vana yağ ve dolgu maddeleri) yerleştirin Millipore filtre kağıdı (0.45 um aynı çözeltisi damla olan merkezinde önceden hazırlanmış deliği (çapı 2-2,5 mm) ile) tipi HArg. Filtre kağıdı (fotoreseptör tarafı) üstüne forseps pozisyon retinanın kullanma ve düz monte onu çevresine kenarlarından basın. Retina filtre kağıdındaki deliğinin üzerine ortalanarak yazılmalıdır. </li><li> Forseps kullanma perfüzyon odasına retina ile filtre kağıdı aktarmak ve uyarıcı spot hizalı alt elektrot alanı üzerinde yerleştirin. Biraz odası ile bağı ona filtre kağıdı yağlanmış kenarları basın. </li><li> Retinanın merkezi (biraz fotoreseptör tabaka dokunmayın) üzerinden Üst elektrodun yerleştirin. Retina üzerine Üst elektrodun Merkezleme sinyal genliği (retina kenarına yakın yerleştirerek kıyasla kadar ~% 20-40) arttırır. Böyle elektrot lokasyonu biraz retina (Yüzölçümünün ~% 12-15) küçük bir sektör ulaşan etkili aydınlatma uyaran yoğunluğu bozan olmasına rağmen, hala elektrik yerleştirme iyi yolbilek düzeyinden. Hazırlanması artık transretinal kayıtlar için hazırdır. </li></ol> 4. Transretinal Kayıtlar <ol><li> Farenizi hattı, LED ışık kaynağı ya da optik stimülatör temin kalibre 505 nm parlak ışık yoğunluğuna loş tarafından rekor çubuk veya M / L-koni-sürücülü bir test flaş yanıtları bağlı. Bizim LED ışık kaynağı durumunda, flaş yoğunluğu LED giriş gerilimi, değiştirilebilir dirençler ve nötral yoğunluk filtreleri bir dizi (biz E-Renk Rosco Laboratories # 211 0.9 ND filmi filtreleri kullanmak ve bilgisayarlı kontrol kombinasyonu tarafından kontrol edilir ) LED ve retina arasına yerleştirilir. LED testi flaş (20 ms) süresi, bir bilgisayar tarafından kontrol edilmektedir. Bir halojen ampul optik stimülatörü kullanıyorsanız, test flaş yoğunluğu ve dalga boyu ise nötral yoğunluk filtreleri ve dar bant girişim filtreleri, bir takım kontrol edilebilir. Testi flash süresi bilgisayar kontrollü kepenkler ile kontrol edilebilir. </li><li> İsteğe Bağlı: etkin korunması içinGün boyunca BaCl 2 photoresponse ve glial komponent bastırılması, taze solüsyon ile dolu plastik bir enjektör kullanarak tasfiye ederek (her retinaya test etmeden önce gibi) bazen de alt elektrot çözüm değiştirin. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Çözümler <ol><li> Fare retina perfüzyon solüsyonu: 112.5 mM NaCI, 3.6 mM KCI, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCI2, 10 mM HEPES (pH 7.2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na süksinat, 0.5 mM Na glutamat, 0.02 mM EDTA, ve 10 mM glükoz. Buna ek olarak, çözelti 2 mM L-glutamat ve photoresponse 10,11 arasında yüksek dereceden bileşenlerin blok 10 uM DL-AP-4 ilave edilir, ve% 0.1 MEM vitaminler ve MEM amino asitler çözeltileri (Sigma) ile retina iyileştirmek için canlılığı. </li><li> Fare elektrot solüsyonu: 140 mM NaCI, 3.6 mM KCI, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCI2, 3 mM HEPES (pH 7.4, NaOH). Düşük ele in solüsyonuctrode alanı da ek olarak, sinaptik 10 ve bloke etmek 2 mM L-glutamat içerir, 10 mM 2 BaCl photoresponse 3,12 arasında glial bileşeni bastırmak için. </li><li> Retina inkübasyon çözüm: 272 mg L-15 orta (Sigma) ve 20 ml deiyonize su içinde 20 mg BSA çözülür. Son L-15 ve BSA konsantrasyonları sırasıyla 13.6 mg / mL ve 1 mg / mL, bulunmaktadır. 1 M HCl ile pH 7.4 &#39;e ayarlayın. </li></ol><img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" /> Şekil 1. Transretinal ERG kayıtları için fare retinanın izolasyonu gösteren şematik diyagramı. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" /> Şekil 2. Perfüzyon odası ve onların sahipleri ile kayıt elektrotları Fotoğraf. Kırmızı oklar perfüzyon akış yönünü gösterir. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg"/&gt; Şekil 3. Transretinal ERG kayıtları için deney düzeneği şematik diyagramı. Kırmızı oklar perfüzyon akış yönünü gösterir. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" /> . Şekil 4 Temsilcisi sonuçları: fare çubuk güdümlü transretinal yanıtları ailesi kaydedildi. Photoresponses low-pass 1 kHz sayısallaştırılmış, 30 Hz (8 kutuplu Bessel) süzülmüş ve detaylı analiz için bir bilgisayarda depolanan vardı. Gösterilen izleri doyurarak ışık şiddetlerinde loş ışık yoğunlukları ve 2-3 tepkiler az 5-6 yanıtları ortalamasını temsil etmektedir. <img alt="Şekil 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" /> Şekil 5 Temsilcisi sonuçları:. Fare koni odaklı transretinal yanıtları kayıtlı aile. Photoresponses low-pass 1 kHz sayısallaştırılmış, 30 Hz (8 kutuplu Bessel) süzülmüş ve detaylı analiz için bir bilgisayarda depolanan vardı. Gösterilen izleri averag edilirdoyurarak ışık şiddetlerinde loş ışık yoğunlukları ve 3-5 cevaplara 5-10 tepkilerin es.

<ol>
	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M/L-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein.">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li><li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit.">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li><li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li><li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response.">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li><li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery.">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Çubuk ve koni güdümlü transretinal ERG kayıt yöntemi vahşi tipi ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar hem de fare fotoreseptörlerin fonksiyonlarını araştırmak için güçlü bir araç haline gelmektedir yukarıda anlatılan. Temel photoresponse özelliklerinin kolay karakterizasyonu ek olarak, bu basit bir teknik ile yakın-bozulmadan retina preparatlar üzerinde gerçekleştirilen deneyler, uzun süreli sırasında büyük müdahale stabilite sağlar. Vahşi tip farelerde koyu adapte çubuk maksimal tepki...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> Biyobilim TOCRIS </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Tüm reaktifler, diğer </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cam kılcal </td><td></td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> TW100-4 </td><td> Elektrotlar yapmak için </td></tr><tr><td> Filtre kağıdı </td><td> HArg </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Fotometre </td><td></td><td> UDT Aletleri </td><td> S350 </td><td> Işık kalibrasyonu için </td></tr><tr><td> Radyometrik silikon sensörü </td><td></td&gt; <td> UDT Aletleri </td><td> 221 </td><td> Işık kalibrasyonu için </td></tr><tr><td> Anti-vibrasyon tablosu </td><td></td><td> Teknik Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26.012-01 </td><td> Mekanik gürültü en aza indirmek için </td></tr><tr><td> Hava kompresörü Panter P 15TC </td><td></td><td> Werther Uluslararası </td><td> P 15TC </td><td> Anti-titreşim masa bağlandı </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Fareyi göz diseksiyon için </td></tr><tr><td> Kızılötesi görüntü dönüştürücüler </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Stereomikroskop bağlı </td></tr><tr><td> Diferansiyel amplifikatör DP-311 </td><td></td><td> Warner Aletleri </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon Digidata 1440A Sayısallaştırıcı </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Çift Kanal 8 kutuplu Filtre </td><td></td><td> Krohn-HITE Şirketi </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Seramik direnç </td><td></td><td> TE Bağlantı </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Perfüzyon çözümü yeniden ısıtılması için </td></tr><tr><td> Termokupl </td><td> T </td><td> Physitemp Aletleri </td><td> BT-18 </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık monitör </td><td></td><td> Omega </td><td> DPi32 </td><td> Termokupl bağlandı </td></tr><tr><td> LED 505 nm </td><td></td><td> TT Elektronik / OPTEK Teknoloji </td><td> Digi-tuşu P / N 365-1185-ND </td><td> Test yanıp / beyazlatma ışık uygulamak için </td></tr><tr><td> Koter kalem </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Dorsal parçası işaretleme içinfareyi göz küresinin </td></tr><tr><td> 10 Elektrofizyoloji Veri Toplama ve Analiz Yazılımı pCLAMP </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses

Çubuklar ve koniler: gözdeki görüntü oluşturan fotoreseptör iki ayrı sınıfı vardır. Konileri hızla parlak ışık koşullarında değişen altında sürekli faaliyet ise Çubuklar tek ışık fotonları tespit edebiliyoruz. Fotoreseptörlerin dış segmentlerinde çubuk ve koni-spesifik görsel pigmentleri tarafından ışığın emilimi sonunda plazma zarı ve hücre hiperpolarizasyon üzerinde siklik nükleotid kapılı kanallarının kapanmasına yol açan bir fototransdüksiyon basamaklarını tetikler. Mevcut ve potansiyel membran Bu ışık kaynaklı değişim ya klasik emme elektrot kayıt tekniği 1,2 veya farmakolojik olarak bloke postsinaptik yanıt bileşenleri 3-5 ile izole retina gelen transretinal elektroretinogram kayıtları (ERG) tarafından, bir photoresponse olarak tescil edilebilir. İkinci yöntem fare fotoreseptörlerin gelen ilaç-erişilebilir uzun süreli kayıtlar sağlar ve stabil photoresponses fr elde etmek için özellikle yararlı olduğuom kıt ve hassas fare konileri. Koni durumda, bu tür deneyler karanlık adaptasyonu 6,7 sırasında konik fotosensitivite iyileşme sürecini izlemek üzere, her iki esas olarak bütün görsel pigmenti karanlık açıcılar-adapte koşullar ve aşağıdaki yoğun ışık yapılabilir. Bu videoda, biz karanlığa uyumlu fare retinadan çubuk ve M / L-konik tabanlı transretinal kayıtları nasıl gerçekleştirebileceğimizi gösterecektir. Çubuk kayıtlar vahşi tip (C57BL / 6) farelerin retinanın kullanılarak yürütülecektir. 8 sinyal çubuğu yoksun fareler. Basitlik için, koni kayıtları genetiği değiştirilmiş çubuk transdusin gelen α-alt birimi nakavt - (- / Tα) elde edilecektir

Watch this Scientific Journal Video about Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses at JoVE.com

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.6K Görüntüleme.  Washington University School of Medicine. Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Video: Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the analysis of density and size gradients of retinal cell types, the direction tuning of direction-selective ganglion cells, and the examination of topographic degeneration patterns in some retinal diseases. However, there are many different ocular dissection methods reported in the literature that are used to identify and label retinal orientation in the mouse retina. While the method of orientation used in such studies is often overlooked, not reporting how retinal orientation is determined can cause discrepancies in the literature and confusion when attempting to compare data between studies. Superficial ocular landmarks such as corneal burns are commonly used but have recently been shown to be less reliable than deeper landmarks such as the rectus muscles, the choroid fissure, or the s-opsin gradient. Here, we provide a comprehensive guide for the use of deep ocular landmarks to accurately dissect and document the spatial orientation of an isolated mouse retina. We have also compared the effectiveness of two s-opsin antibodies and included a protocol for s-opsin immunohistochemistry. Because orientation of the retina according to the s-opsin gradient requires retinal reconstruction with Retistruct software and rotation with custom code, we have presented the important steps required to use both of these programs. Overall, the goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable set of methods for accurate retinal orientation that is adaptable to most experimental protocols. An overarching goal of this work is to standardize retinal orientation methods for future studies.

This protocol provides a comprehensive dissection and analysis guide for the use of deep ocular landmarks, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct, and custom code to accurately and reliably orient the isolated mouse retina in anatomical space.

Nerede konularda kesme: Bir diseksiyon ve fare Retina mekansal oryantasyon analiz Rehber'den oküler yerler

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel telemetric electroencephalography system in combination with standard self-adhesive hydrogel electrodes. The piglets are calmed down without the use of sedatives. After their release into the pigpen, the piglets behave normally&#8212;they drink and sleep in the same cycle as their siblings. Their sleep phases are used for the EEG recordings.

Here, we present a protocol to record telemetric electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen without the use of a sedative, making it possible to record typical EEG patterns during non-REM sleep, like spindle bursts.

Domuz yavruları serbestçe hareket noninvaziv EEG kayıtları

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &amp;#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

Tavuk Embriyolarının Retinasından Koni Zenginleştirilmiş Kültürler Çubuktan Koni Hücresel Etkileşimlerine

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

İn vivo Tekrarlanabilirliği Artırmak için Fare Retinasında Vasküler Yaralanma Okumaları

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Mouse Retina Isolation and Flattening

After fixing the enucleated eyeball of the euthanized mouse, transfer it to a glass slide and place it under a dissecting microscope. Using forceps, clamp the margin of the cornea to prevent eyeball movement. With the dissecting scissors, cut around the cornea at a depth of approximately one millimeter through the cornea scleral limbus, and then remove the lens and vitreous body.Holding the optic disc at the center, cut the retina radially along the four quadrants, reaching approximately 2/3 of the retina's radius. Clamp one of the scleral edges using toothed forceps. Hold the sclera edge with untoothed forceps and move from the toothed forceps toward the sclera base.Carefully peel the retina. Wet the retina with 200 microliters of PBS using a pipette. Remove excess PBS using absorbent paper, and flatten the retina with a small bristle brush if needed.Slowly add cold methanol drop-by-drop onto the retina's inner surface until it covers completely. Once the retina turns white and develops increased tenacity, gently flatten the retina and remove impurities, such as residual pigment membranes and the vitreous body, with a small bristle brush. After inverting the retina, treat it with methanol as previously demonstrated, and transfer it into a well of 24 well plate, Soak it in methanol and store it at 20 degrees Celsius for one to two hours for immediate immunostaining.Then rinse the retina with PBS after removing methanol from the plate. The retinol ganglion cells of the retinas before and after methanol treatment were visualized using confocal microscopy, which indicated that the 12 months of methanol preservation did not affect the RGC immunostaining.