Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).

1. iridyum Synthesis (III) kompleksi <ol><li> [2, -Cl Ir (polipirol)] 2 ve 53.6 mg (50 umol) tartılır ve metilen klorür, 5 ml içinde çözülür. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış 50 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi, bu solüsyonu ekleyin. </li><li> AgOTf 26.2 mg (100 umol) tartılır ve 5 ml metanol içinde çözülür. </li><li> Çözündürüldü için AgOTf [Ir (polipirol) 2, -Cl] 2 çözeltisi ilave edin ve 1 saat karışması sağlandı. Not: Krem renkli bulamaç, sonuçlanmalıdır. </li><li> 1 saat sonra, bir 25 x 95 mm dirhemlik bir ampule silika jel içinden bulamaç filtre edilir ve döner bir buharlaştırıcı (5-10 dakika) kullanılarak geri kalan çözücü buharlaştırılır. </li><li> Çözücünün çoğu çıkarıldıktan sonra, yağlı bir tortu, san bir şişede kalmasını kontrol edin. Bu kalıntıya, ürün yeniden çözülür ve sarı bir katı ürün elde etmek üzere 1-2 gün liyofilize metanolün 1 ml. </li><li> &lt;H Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + ürünü (IR1) karakterizesup&gt; 1 NMR ESI UV-Vis (CDCI3 içinde), daha önce tarif edildiği gibi. 23 </li></ol> Çeşitli Amino Asitler ile IR1 2. etkileşimler <ol><li> Metanol IR1 bir 2 mM solüsyonu (MW 537,10 g / Mol) hazırlayın. Girdap, katının tam olarak çözünmesini sağlamak için. </li><li> HEPES, aşağıdaki amino asit ve biyomoleküllerin 100 uM çözeltiler His, İle, Lys, Ser, Val deneyin tuzlu su (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCI, pH 7.4), Ala, Asp, Cys, tamponlu hazırlayın. </li><li> Siyah 96 oyuklu bir plakaya her bir amino asit, 100 ul pipet. Bir boş olarak hizmet etmek üzere plakaya HBS&#39;de 100 ul ekle. </li><li> Her bir örnek için, 2 mM IR1 çözeltinin 2.5 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde plaka sallayın. </li><li> 10 dakika sonra, 96 oyuklu bir plaka okuyucusu (365 ex / 400-700 em) kullanarak numune emisyon spektrumlarına sahip olur. <ol><li> Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın. </li><li> Yeni exp ayarlaeriment 365 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve en üst pozisyonda optik ile 9 nm bir yarık genişliğine sahip bir floresan tarama okuyun. </li><li> 5 nm&#39;lik bir adım büyüklüğü 300-700 nm emisyon okuyun. </li><li> Veri analizi için veri verir. </li></ol></li><li> Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanılarak emisyon örnekleri aktarın. </li></ol> BNT-II ile IR1 3. Titrasyon <ol><li> HBS&#39;de BNT-II (MW 8233,6 g / mol) &#39;in bir 1 mM stok solüsyonu olarak metanol içinde IR1 bir 2 mM çözelti hazırlayın. </li><li> Stok solüsyonu, HBS 100 mcM BNT-II 1 ml hazırlamak. Numune karışık olduğundan emin olmak için ependorf tüp Vortex. </li><li> Seri olarak 1.56 uM BNT-II &#39;nin nihai bir konsantrasyona kadar HBS&#39;de yarı yarıya 100 uM BNT-II seyreltin. </li><li> HBS 96 oyuklu bir plakanın kuyularına, boş olarak hizmet veren, üç kopya halinde, her seyreltme oranından 100 ul ekle. Her numune için, 2 mM IR1 2.5 ul ekleyin. </li><li> Shbir plaka karıştırıcısı üzerinde 10 dakika boyunca plaka ücadele. </li><li> Çalkalamadan sonra, 96 oyuklu bir plaka okuyucu kullanılarak 510 nm&#39;de (365 nm&#39;de uyanm) emisyon yoğunluğunun okuyun. <ol><li> Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın. </li><li> 510 nm, 365 nm ve emisyon dalga boyunda bir eksitasyon dalga boyunda bir flüoresan bitiş noktası okumak için yeni bir deney seti. Üst pozisyonda optik, 9nm hem dalga boyları için yarık genişliğini ayarlayın. </li><li> Plaka okuma ve analiz için veri ihracat. </li></ol></li><li> Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanarak titrasyon örnekleri aktarın. </li></ol> Biolayer İnterferometre kullanma IR1 / BNT-II Sistemi 4. Gerçek zamanlı Kinetik Analizi <ol><li> Kinetik tampon 200 ul ilave et; siyah 96 oyuklu plakanın birinci sütunda 8 oyuklara (KB 1x Fosfat% 0.02 Tween-20 ile tamponlanmış tuzlu su) ve plastik sensör içine plaka eklemetutucu. Dikkatli bir şekilde ipuçları tampon kuyu içerisinde süspanse edilir, öyle ki plastik tutucu ilk sütun 8, Ni (II) NTA biyosensörler aktarın. Interferometri enstrümanın sol tarafında plastik tutucu yerleştirin. </li><li> KB BNT-II &#39;nin, bir 0.5 uM çözeltisi 2 ml hazırlayın. </li><li> KB IR1 bir 10 uM solüsyon 500 ul hazırlayın ve seri KB cinsinden 0.156 mcM aşağı yarıya sulandırmak. </li><li> Yeni bir siyah 96 oyuklu bir plaka, bir pipet kolon A ve C sınırlarındaki 8 çukurlara KB 200 ul </li><li> Aynı plaka, sütun B&#39;de kuyulara 0,5 um BNT-II çözeltisi pipet 200 ul </li><li> Pipet kuyu D1 boş olarak KB ile başlayan kolon D içine IR1 her seyreltme, 200 ul. Kuyu sütununda aşağı aralıklı toparlanma seviye 1 konsantrasyonunda artış böylece dilüsyonları ekleyin. </li><li> Ön ıslatma sensörleri içeren plaka sağ cihazda bu plaka koyun. </li><li> Biolayer interferometri yazılımında, temel Kinet kurmakplaka, tahlil ve sensör ipuçları tanımlayarak ic deneyi. <ol><li> Plaka tanımlamak için, ekrandaki bir sütun seçin sağ tıklatın ve kuyular için uygun bir tanım seçin. Sütun D. sütun B sütunları A ve C için &quot;Buffer&quot;, &quot;Load&quot; ve &quot;Sample&quot; seçiniz </li><li> (&quot;Add&quot; düğmesine tıklayın) aşağıdaki adımları ekleyerek sonraki sekmesinde tahlil tanımlayın: Dengeleme (Özel), 60 saniye; Yükleniyor, 120 sn; Baseline, 60 saniye; Dernek, 120 sn; ve ayrışma, 300 sn. Dengelenme adımı seçin ve (B sütununu), Temel (sütun C), Derneği (kolon D) ve Ayrışma (sütun C) Loading sütun A. tekrarlayın çift tıklayın. Ni (II) NTA sensörleri seçin. </li><li> Bir sonraki sekmeye geçmek ve sensörler plastik sensör tutucu A sütununda olduğunu onaylayın. </li><li> Bir dosya adı eklemek, deney doğru özetlenen Onayla &quot;gecikme deneyi&quot; işaretli olduğundan emin olun ve basın &quot;gidin.&quot; NOT: kinetik deney özetlenen sonra programlandığı gibi enstrümanın otomatik doğası nedeniyle, adımlar meydana gelecektir. </li></ol></li><li> Kinetik çalışma tamamlandıktan sonra, verilen işleme yazılımı verileri işlemek. <ol><li> Soldaki panelinin alt kısmının ilgi dosya ile klasörü çift tıklatın. Ardından, panelin üst kısmında &quot;Kinetik&quot; başlığı altında gelen klasörü çift tıklatın. İşleme sekmesine geçin. </li><li> Sensör seçimi ekranını açmak için soldaki Çıkarma kutusunu işaretleyin. Sağ de A4 tıklayın ve Referans Well iyi türünü değiştirin. </li><li> Y ekseni hizalama yanındaki kutuyu işaretleyin ve seçilen adım Baseline olduğundan emin olun. Başlangıçta son beş saniye (yaklaşık 55-60 sn) olmak üzere zaman aralığını belirtin. </li><li> Inter-adım Düzeltme için kutuyu işaretleyin ve Ayrışma için Hizala&#39;yı seçin. Savitzky-Golay Filtreleme kutusunun işaretli ve basın &quot;Süreç Verileri emin olun! ̶1 &#39;dir; </li><li> Analiz sekmesine geçin. &quot;Dernek ve Ayrılma&quot; analiz adımlar için ve Model 1 olduğu seçim olduğundan emin olun: 1. Yerel Tam uyum seçiniz ve basın &quot;Fit Curves!&quot; </li><li> Tablodaki tüm eğrileri vurgulayın ve doğru bir renk tüm eğrileri ayarlamak için tıklatın. Sonraki, renk ve Rmax Sensör Unlinked göre gruplandırılmış Global (Full) uyum seçin. Basın &quot;Fit Curves!&quot; Küresel kinetik verileri elde etmek. </li></ol></li></ol> 5. On-boncuk IR1 ile BNT-II Algılama ve rcHRP-II <ol><li> 1 mi Tween ile HBS&#39;de BNT-II ve rcHRP-II &#39;nin bir 1 uM her bir çözelti hazırlayın (HBST; HBS% 0.025 Tween 20). </li><li> Seri olarak 15.6 nM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar HBST yarı yarıya her protein seyreltin. </li><li> Pipet yüksek konsantrasyon aşağı sütunu düşük sırayla seyreltileri ile beyaz bir 96-çukurlu plaka içinde üç kopya halinde her seyreltme oranından 100 ul,,,. </li><li> Pipet 50 um Ni 10 ul (IIHer bir seyreltme içine) NTA manyetik agaroz parçacıklar. <ol><li> Parçacıklar askıya kalmak emin olmak için her pipetleme sonra manyetik parçacıklar içeren ependorf tüp Vortex. </li></ol></li><li> 15 dakika parçacıklarla örnekleri inkübe için, bir plaka karıştırıcısı üzerinde plaka koyun. </li><li> Bu inkübasyon süresinden sonra, 96 oyuklu bir plaka mıknatıs üzerinde plaka yerleştirmek ve parçacıklar çözeltinin dışarı çekmek için 30 saniye bekle. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, özgün örnek çekin ve atık olarak atın. Mıknatıstan plakasını sökün. </li><li> Her bir kuyunun çok kanallı pipet kullanarak HBST 200 ul ekleyin. Manyetik parçacıkların yıkamak için yukarı ve aşağı birkaç kez tampon Pompa. </li><li> Geri mıknatıs üzerine plaka koyun ve parçacıklar çözümün çekin için 30 saniye bekleyin. </li><li> Çok kanallı pipet kullanarak, tampon 200 ul koparmak ve atık olarak atın. Mıknatıstan plakasını sökün. </li><li> Yineleyin 5.8 Throug adımlarıH 5.10, iki katı parçacıkların üç yıkamadan tamamlayın. </li><li> 2 mM IR1 2.5 ul ve ardından her bir oyuğa içeren manyetik partiküllere HBST 100 ul ekle. </li><li> 1 saat boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde IR1 ile parçacıklar inkübe edin. </li><li> 1 saat sonra, 96-çukurlu bir plaka okuyucusu kullanılarak 510 nm&#39;de (365 nm&#39;de uyanm) emisyon yoğunluğunun okuyun. <ol><li> Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın. </li><li> 510 nm, 365 nm ve emisyon dalga boyunda bir eksitasyon dalga boyunda bir flüoresan bitiş noktası okumak için yeni bir deney seti. Üst pozisyonda optik, 9 nm her iki dalga boyları için yarık genişliğini ayarlayın. </li><li> Plaka okuma ve analiz için veri ihracat. </li></ol></li><li> Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanarak titrasyon örnekleri aktarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+of+Care+Diagnostics:+Status+and+Future.">Point of Care Diagnostics: Status and Future.</a> Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+tracking+fluorescence+microscopy+in+mitochondria+reveals+highly+dynamic+but+confined+movement+of+Tom40.">Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40.</a> Scientific Reports. 1, (2011).</li><li>Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Biosensors+and+Microarrays.">DNA Biosensors and Microarrays.</a> Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).</li><li>Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Lighting+up+cells:+labelling+proteins+with+fluorophores.">Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores.</a> Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+protein+detection+using+enzyme-labeled+gold+nanoparticle+probes.">Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes.</a> Analyst. 135, 327-331 (2010).</li><li>Almeida, M., Carabineiro, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+nanogold+in+human+tropical+diseases:+research,+detection+and+therapy.">The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy.</a> Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).</li><li>Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Trends+in+the+Use+of+Transition+Metal&#8211;Ligand+Complexes+for+Applications+in+Electroluminescent+Devices.">New Trends in the Use of Transition Metal&#8211;Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices.</a> Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).</li><li>Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metal+centered+ligand+field+excited+states:+Their+roles+in+the+design+and+performance+of+transition+metal+based+photochemical+molecular+devices.">Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices.</a> Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).</li><li>Lamansky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Phosphorescent+Bis-Cyclometalated+Iridium+Complexes:+Synthesis,+Photophysical+Characterization,+and+Use+in+Organic+Light+Emitting+Diodes.">Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).</li><li>Ho, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis,+structure+and+oxygen-sensing+properties+of+Iridium(iii)-containing+coordination+polymers+with+different+cations.">Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations.</a> Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).</li><li>McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclometalated+Iridium(III)+Aquo+Complexes:+Efficient+and+Tunable+Catalysts+for+the+Homogeneous+Oxidation+of+Water.">Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).</li><li>Ma, D. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Selective+Luminescent+Switch-On+Probe+for+Histidine/Histidine-Rich+Proteins+and+Its+Application+in+Protein+Staining.">A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining.</a> Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).</li><li>Ma, D. -. L., He, H. -. Z., Leung, K. -. H., Chan, D. S. -. H., Leung, C. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+Luminescent+Transition-Metal+Complexes+for+Biomedical+Applications.">Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).</li><li>Leung, C. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Metal-Based+Inhibitor+of+Tumor+Necrosis+Factor-&#945;.">A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-&#945;.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).</li><li>You, Y., Nam, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photofunctional+triplet+excited+states+of+cyclometalated+Ir(iii)+complexes:+beyond+electroluminescence.">Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence.</a> Chemical Society Reviews. 41 (21), 7061-7084 (2012).</li><li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+Iridium(III)+Complexes+with+Tunable+Emission+Color+as+Phosphorescent+Dyes+for+Live+Cell+Imaging.">Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging.</a> Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nonemissive+Iridium(III)+Complex+That+Specifically+Lights-Up+the+Nuclei+of+Living+Cells.">A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).</li><li>Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histidine-rich+glycoprotein:+A+novel+adaptor+protein+in+plasma+that+modulates+the+immune,+vascular+and+coagulation+systems.">Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems.</a> Immunology, &amp; Cell Biology. 83, 106-118 (2005).</li><li>Panton, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+partial+characterization+of+an+unusual+protein+of+Plasmodium+falciparum:+histidine-rich+protein+II.">Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).</li><li>Schneider, E. L., Marletta, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+Binding+to+the+Histidine-Rich+Protein+II+from+Plasmodium+falciparum.">Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum.</a> Biochemistry. 44, 979-986 (2004).</li><li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tropical+infectious+diseases:+Diagnostics+for+the+Developing+World.">Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World.</a> Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).</li><li>Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-Antigenic+Peptides+of+Histidine-Rich+Protein+II+of+Plasmodium+falciparum:+Dendrimeric+Biomineralization+Templates.">Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates.</a> Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).</li><li>Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterizations+of+cyclometalated+iridium(III)+solvento+complexes.">Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes.</a> Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).</li><li>Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Resource+Method+for+Extracting+the+Malarial+Biomarker+Histidine-Rich+Protein+II+To+Enhance+Diagnostic+Test+Performance.">Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance.</a> Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).</li><li>Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drivers+of+biodiagnostic+development.">Drivers of biodiagnostic development.</a> Nature. 462, 461-464 (2009).</li><li>Li, M. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+electrochemiluminescence+of+a+new+water-soluble+iridium(iii)+complex+for+determination+of+antibiotics.">High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics.</a> Analyst. 136, 205-210 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Mikropartikül tabanlı tanılama araçları modern tanı teknolojinin ön plana gelmek gibi, doğrudan parçacığın yüzeyi üzerinde hedef biyomoleküllerin tespiti önemli bir avantajdır. ELISA ve PCR gibi geleneksel moleküler tanı yöntemleri, şöyle ki algılama 25 arasında çok düşük limitler elde edilebilir, avantajlıdır. Ancak, bu deneyler geniş reaktifler ve uzun protokoller gerektirir. Bu deney süresi ve reaktif koşulları (Şekil 5) olmadan, ELISA tipi bir sandviç etkileşimleri taklit etmek için tasarlanmıştır. Tipik bir ELISA için antikorların maliyeti numune başına $ 0,20-0,30 ise ek olarak, numune başına IR1 prob maliyeti, peni civarında olduğu tahmin edilmiştir. Yukarıda tarif edilen yöntemler, sıtma belirteç saptanması için bir cyclometalated iridyum prob dayandığı bu sondanın, diğer algılama yöntemlerinin ortak arıza modu (örn. Fluorofor quenchi duyarlı olmayacaktırNG ve antikor / enzim parçalanma). Histidin metal bağlanma özellikleri açısından benzersizdir. özetlenen işleme metal ihtiva eden kompleksleri ile, tipik bir ELISA sandviç antikorları değiştirerek bu fenomenin yararlanır. Ni (II), NTA, parçacığın yüzeyi üzerinde rcHRP-II &#39;yi yakalar ve IR1 proteinin varlığını işaret eder. tahlilde en kritik adım manyetik partiküller numune ve sonda ile karıştırmak için izin veriyor. 96 oyuklu bir plaka ELISA, biyomoleküllerin ve reaktifler de alt kısmının, iki boyutlu bir yüzey ile dengeye ulaşır. Manyetik parçacıklar nedeniyle mevcut bağlanma siteleri azaltacaktır onların yoğun demir-oksit çekirdek, çözümün dışında yerleşmek eğilimi var. Bu nedenle, parçacıklar maksimum bağlanma sağlamak için deney süresince karıştırılmalıdır. Hastalığın teşhis için bir ayıraç tasarlarken, akılda hasta numunesinin formu gibi bir belirteç fizyolojik konsantrasyon tutmalıdır. Içinmalarya, hastanın kanında pf HRP-II konsantrasyonu, yüksek nanomolar düşük pikomolardan değişebilir. Bu deney, enfeksiyonun daha yüksek seviyeleri için klinik olarak anlamlı iken, tespit limiti, düşük pikomolar HRP-II pf sirküle olan asemptomatik hastaların tespit etmek için geliştirilmiş olması gerekiyor. Yukarıda ana hatları çizilen yöntemler, in &quot;Çalıştırma&quot; IR1 tarafından üretilen sinyal histidin varlığında meydana gelir. Sıtma biyomarker histidin açısından zengin iken, insan serum albümini ve histidin bakımından zengin glikoproteinin gibi serum proteinleri, prob ile, bir sinyal tepkisine neden olacaklardır. Bu da yanlış pozitif tanılara yol açacak. Bu yararlı bir aşama olması ile ilgili protein hızlı bir hasta numunesinden elde edilebilir parçacığın yüzeyi üzerinde protein yakalama yapar. Ayrıca, iki fonksiyonlu prob tasarımı sağlam bir moleküler tanıma elemanına çiftler histidin zengin peptid (yani. Aptamer olduğunu) Tahlile özgüllük bir tabaka eklenebilir. peptid aptamer bağlanmadan önce iridyum yüklenmiş olacaktır. Aptamer hedef özgüllük elde ederken böyle bir tasarımda, istikrarlı IR1 prob hala kullanılabilir. Bu kompleks matris (örn., Plazma ya da bütün kan) yerli HRP II algılamak ve spesifik olmayan bağlanma etkilerini azaltmak için prob uygulanması için izin verecektir. Daha hızlı bir tanısal testlerin sinyalini geliştirmek için, deney pf HRP II elektrokimyasal okuma 26 ile RDTs tespit edilebilir bir elektrokemilüminesan (ECL) sistemi içine dahil edilebilir. Bu yeni nesil iridyum probu büyük ölçüde hastalık biyobelirteçlerinin tespiti için bizim on-boncuk ELISA testi artıracaktır.

Kolorimetrik ve floresan etiketleme biyokimyasal moleküllerin tespiti ve takibi için önemli bir yöntemdir ve 1,2 işler. En yaygın fluoresan işaretleyiciler, düşük molekül ağırlıklı organik boyalar 3,4, ancak bu moleküller her zaman ideal optik özelliklere sahip değildir. Floresan boyalar genellikle küçük Stokes kaymalar, ve üst üste binen uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip olabilir, ışıkla ağartma yatkındır. Kolorimetrik markalama genellikle bağışıklık miktar 5,6 yararlı olan güçlendirilmiş bir sinyal enzimatik etiketler, kullanımı ile elde edilir. Bu enzimler aynı zamanda fotosensitivite, reaksiyon koşulları ve kısa alt-tabaka raf ömrü dahil olmak üzere kendi dezavantajları vardır. Bu özellikler masraflı belirteçleri kullanarak iyi kontrollü şartlar altında yapılması gereken immün ve protein etiketleme yöntemleri gerektiren eğilimindedir. Yayıcı geçiş metali kompleksleri, alternatif etiketleme yaklaşımı FO olarak araştırılmıştırBiyokimyasal algılama r. Özellikle, (III), 7-9 oksijen 10 algılama organik ışık yayan diyotlar (OLED) kapsamında incelenen 11 kataliz ve protein / hücre 12-14 boyama olmuştur Ir cyclometalated. Yüksek fotostabilite ve kuantum verimliliği sondaları bu sınıf biyomolekülün tespiti 15,16 için iyi bir aday olun. Bu, daha önce formun, (III) kompleksleri Ir cyclometalated olduğu tespit edilmiştir [Ir (Cı ^ K) 2 (Solv) 2] +, geri dönüşü olmayan histidin bağlanan ve mavi-yeşil bir sinyal yanıtı 12,17 neden olabilir. Bu kompleksler solvento halde olmayan yayım, ancak histidin çözücü moleküllerini değiştirir ve metal merkezine bağlandığı zaman, uzun dalga UV ışınımı sonrasında yoğun bir fosforlu sinyali bırakın. Bu sinyal, yalnızca ligand ikamesi sonra oluşur ve metal ligand yük transferi aktivasyonu yoluyla zemin durumuna rahatlatıcı bir üçlü devlet elektronun sonucu (3 ML olduğunuBT) ve ligand merkezli transferi (3 LC) 8,15 yolaklarıyla. Bu kompleksler, potansiyel olarak histidin bakımından zengin proteinleri için algılama sondalar olarak kullanılabilir. Histidin bakımından zengin proteinler ve regülasyon seviyeleri karaciğer sirozu, kanser ve trombik bozukluklar da dahil olmak üzere, pek çok hastalıkta önemlidir. Özellikle 18 Plasmodium falciparum Histidin zengin protein II (pfHRP-II) &#39;sıtma paraziti enfeksiyonu için iyi olarak geçerliliği biyomarkerdir. Bu protein en çok karakteristik AHHAHHAAD tekrar motifler 19 içinde, 67 kDa ve 34% histidin içerir. Bu histidin tekrarlar ücretsiz metal iyonlarını 19 bağlayabilir ve heme konak kanda 20 kompleksleri. pfHRP-II yaygın immunokromatografik hızlı tanı testleri (RDTs) kullanarak düşük kaynak ortamlarda algılandı ancak bu testler nedeniyle numune koşulları, düşük biyobelirteç konsantrasyonu, kötü üretim standartları ve antikor bozulması 21 genellikle yanlıştır. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; örneğin cyclometalated Ir gibi metal tabanlı fosforlu sondalar (III) &#39;ün yukarıda tarif edilen kompleksler nedeniyle histidin seçici bağlayıcı ve stabil ve etkili bir emisyon özellikleri pfHRP-II&#39; nin tespiti için çekici bir seçenek vardır. Bu yazıda, kullanılması [ir (ppy) 2 (H2O) 2] + (IR1) BNT-II, 22 keşfedilmeden pfHRP-II dallı bir peptid taklidi gibi davranır algılamak için. Bu etkileşimin kinetik biolayer interferometre teknikleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edildi. Tahlil ayrıca tespit nanomolar limitleri elde edildi bir on-boncuk ELISA-tipi biçimi, adapte edildi. Bunun yerine, 4-5 saat ve tipik ELISA ile istenen biyolojik reaktifler, antikor içermeyen reaktifler ile, 2 saat altında gerçekleştirilebilir, çünkü bu deney, geleneksel ELISA fazla avantajlar tutar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>658383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silver trifluoromethanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>176435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Amino acids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>varies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNT-II peptide</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant HRPII</td>
			<td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td>
			<td>AGPF-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar white polypropylene 96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grenier black polypropylene 96-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89089-582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA magnetic agarose particles</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>36111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td>18-5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet</td>
			<td>ForteBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Synergy H4 Microplate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Biotech Transilluminator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FBDLT-88</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

iridium(iii) luminescent probe for detection of the malarial protein biomarker histidine rich protein-ii

Bu çalışma olmayan bir yayım sentezini ana hatlarıyla cyclometalated Ir (III) kompleksi, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 histidine- koordine olduğunda hızlı, uzun ömürlü fosforlu sinyali ortaya çıkarmaktadır + (IR1), manyetik parçacığın yüzeyi üzerinde hareketsizleştirilmiş protein ihtiva etmektedir. IR1 sentezi, yüksek verimlerle, / K tam bir O ve solvatlanmış kompleks iki eşdeğer olarak Ir (III) &#39;ün kloro-köprülü dimer cyclometalated ebeveynin bölme içerir. Özgünlüğünü teyit etmek için, sentezlenmiş prob ilave edildiğinde çeşitli amino asitler koordinasyon aktivitesi için problandı ve sadece histidin sinyal karşılığını ortaya çıkardı. BNT-II, sıtma belirteç Histidin zengin protein II (pfHRP-II) &#39;in bir dallı peptit taklidi gibi davranır kullanarak, iridyum prob HRP II tespiti için bir araç olarak doğrulanmıştır. L-Histidin / IR1 kıyasla söndürme etkisi BNT-II / IR1 titrasyonu dikkat çekildi, ancak bu sterik engel ve tri atfedilmiştirdevlet su verme plet. Biolayer interferometri BNT-II ile IR1 etkileşimi gerçek zaman kinetiklerini belirlemek için kullanılmıştır. Sistem optimize sonra, prob kullanılarak rcHRP-II &#39;nin tespit limiti çözeltisi içinde 12.8 nM olduğu tespit edilmiştir. Bu protein, bir 50 um, manyetik agaroz parçacık yüzeyi üzerinde immobilize edildi, algılama sınırı 14.5 nM idi. Sağlam sinyali, bu inorganik prob tepki olarak çözelti içinde kullanım esnekliği ya da bir yüzey üzerinde immobilize, diagnostik kullanım görüntülemeye, çeşitli uygulamalarda doğru elverişli olabilir.

Şekil 1, metal merkezine çözünmeyen AgCl şeklinde klorür çökelmesi ile ana dimer klorid köprünün IR1 solvento kompleks ilgili bölme sentezi ve su moleküllerinin birlikte gösterildiği gibi. IR1 oluşumu, H 1 NMR ve ESI ile teyit edilmiştir. 365 nm&#39;de uyarıldığında, ayrıca metal ligandı yük transferi karakteristik UV-görünür bant ve π-π * geçişler daha IR1 oluşumunu doğrulamak, spektrum tahsis edilmiştir. Bu kompleks sergilemeyen bir yayıcı karaktere solvatlanmış. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Şekil 1:. Bölgesinin IR1 Dichlorotetrakis (2- (2-piridinil) fenil) Klorür köprüsü bölme reaksiyon sentezi ve karakterizasyonu diiridium (III) Akuo kompleksi Ir oluşturmak için (ppy) 2 (H2O) 2 </sub&gt; + (IR1). Ilave edildikten sonra, L-His sulu tampon içinde Akuo kompleksi, lüminesan sinyal açılır. Kompleksi sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir kez daha önce benzer bir iridyum analog 17 kullanılarak tarif edildiği gibi, bir amino asit seçiciliği, analiz edilmiştir. Şekil 2A, 365 nm&#39;de uyarıldığında, sadece histidin, 510 nm&#39;de bir sinyal yanıtı ortaya göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Şekil 2: Amino Asit Seçiciliği ve histidin bakımından zengin peptitler ile IR1 Titrasyonu (A), 50 uM ile, çeşitli amino asitler (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His), 200 uM etkileşimi. HBS IR1. Spektral taramalar siyah 96 oyuklu bir plaka içerisinde 365 nm&#39;lik bir uyarma dalga boyunda 400-700 nm alınmıştır. Tüm amino asitler b nispi floresans birimleri Sinyal (RFU)esides histidin (kesikli siyah iz) yok denecek kadar azdı. BNT-II (▪) ve rcHRP-II (♦) ve (B), nanomolar konsantrasyonlarda HBS&#39;de IR1 ile titre edildi. histidin bakımından zengin peptitler 365 nm ışık ile uyarma sonrasında 510 nm&#39;de emisyon okumadan önce çözelti içinde 15 dakika için sonda ile inkübe edilmiştir. Algılama limiti Y 3σ boş = x değeri olarak hesaplandı. Histidin koordine edildiğinde Ir singlet uyarılmış durum (1 MLCT / 1 LC) (III) Bioconjugate üçlü uyarılmış duruma (3 MLCT) için sistemler arası geçiş uğrar çünkü iridyum probunun fosforesans Bu &quot;on-switch&quot; oluşur Metal merkezine. Bu prob BNT-II Plasmodium falciparum Histidin Zengin Protein II (HRP-II pf) sıtma belirteç mimik bir peptid uygulanmıştır. IR1 ile BNT-II &#39;nin, bir titrasyon olarak, konsantrasyon bağımlı bir sinyal tepkisi gözlendi ( <strong&gt; Şekil 2B). Rekombinant HRP-II (rcHRP-II) &#39;de çözelti içinde benzer bir tepki sergiledi. çözelti içinde BNT-II ve rcHRP-II &#39;nin tespiti sınırları, sırasıyla 54.8 nM ve 12.8 nM idi. Biolayer interferometre teknikleri kullanarak, BNT-II bağlanmasını IR1 Kd bir Ni (II), NTA yüzeyi üzerinde hareketsiz 2.05 uM (Şekil 3) olduğu bulunmuştur. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Şekil 3:. Bir Ni (II), NTA, cam sensörünün yüzeyi üzerinde BNT-II bağlanmasını IR1 çeşitli konsantrasyonlarda kinetik analizi için BNT II Biolayer interferometri ile IR1 gerçek zamanlı Kinetik Analizi. KB (Bölge A) sensörleri dengelenmesinden sonra, sensörler 0.5 uM BNT-II (Bölge B) ile yüklenir. Peptit sensörleri üzerinde yüklendikten sonra, bir temel öncesinde BNT-II (Bölge D) IR1 dernek ölçme (Bölge C) kuruldu. SonraDerneğin bir süre, sensörler ayrışma (Bölge E) ölçmek için KB geri yerleştirilir. Bütün kinetik analiz süreci az 30 dakika sürer. Bir manyetik parçacık platformuna çözeltisi tabanlı testte geçtiğinde, sistem içinde parçacığın ilave karmaşıklığı göz önüne alınması gerekiyordu. Görüldüğü gibi, yukarıda tarif 24 Siyah floresan plakalar çözüm tahlil için çalıştı. Bu parçacıklar verimli sıtma biyogösterge pf HRP-II bağlamak olduğunu, daha önceki çalışmalar ile bilinen, ancak beyaz plakalar üzerinde parçacık algılama platformu için daha uygun idi Şekil 4A. Beyaz bir levha, ışık ve böylece parçacığın yüzeyine bağlanmış IR1 ile daha iyi bir emiş sağlayan geri numune içine yansıtılmaktadır. Üzerinde parçacık tahlilde, rcHRP-II &#39;nin tespit limiti 14.5 nM (Şekil 4B) olduğu belirlenmiştir. rcHRP-II için tespit limiti solüsyonu-in ve on-boncuk statis vardıBir eşleştirilmemiş t-testi (p = 0,731) dayalı olarak an- aynı. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Şekil 4: a. Siyah 50 um Ni yüzeyinde BNT-II&#39;ye bağlanan IR1 alınan sinyal arasındaki üzerinde boncuk BNT-II ve HRP-II Saptanması (A) fark (II), NTA, manyetik agaroz parçacıkları 96- de beyaz 96-kaynak plaka (kesikli çizgi) karşı plaka (düz çizgi). parçacıklar 365 nm ışık ile ikaz edilmiş ve emisyon 510 nm&#39;de ölçülmüştür. RcHRP-II &#39;nin (B)&#39; titrasyon manyetik parçacıklar üzerinde hareketsiz ve IR1 ile tespit edildi. Algılama limiti va olarak hesaplanmıştırx Lue y 3σ boş = olduğunda. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Şekil 5: IR1 ile rcHRP-II üzerinde boncuk Algılama şematik temsili Ni (II), NTA parçacıklar ve IR1 ile etiketlenmiş yüzeyine bağlaması, HRP-II &#39;nin genel şeması.. tanecikler, 15 dakika boyunca bir histidin açısından zengin peptid ile inkübe edilir. Bu inkübasyon süresinden sonra, parçacıklar HBST çözeltiden parçacıkları çekmek için, bir mıknatıs kullanılarak yıkanır. Son olarak, peptid bağlanan parçacıklar önce, 365 nm ışık ile uyarma sonrasında 510 nm&#39;de emisyon okuma 1 saat boyunca IR1 ile inkübe edilir.

Watch this Scientific Journal Video about IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II at JoVE.com

IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

iridium-iii-luminescent-probe-for-detection-malarial-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

9.1K Görüntüleme.  Vanderbilt University. Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.

Video: IridiumIII Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

Buz Bağlayıcı Protein İncelemelerde LabVIEW çalıştırılan Roman nanolitre Ozmometre

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Kimya

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Kolloidal Probe Nanoscopy kullanarak parçacık-parçacık Etkileşimleri Nicel ve Nitel Sınav

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

Küçük oligomer oluşturan Membran Protein Sedimantasyon Denge: pentameric İstikrar Histidine Protonasyon Etkisi

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zempl&#233;n.

Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

Glikosidaz Faaliyetlerinin Belirlenmesi için indoksil-glikozitler sentezi

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

DNA, Oksidasyon Biomarker HPLC ölçümü, 8-okso-7,8-dihidro-2&#39;-deoksiganozin, Kültürlenmiş Hücrelerde ve hayvansal dokular

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding the role of complexes in biological systems. While the direct characterization of biomolecular assemblies has become increasingly important in recent years, native fractionation techniques that are compatible with downstream analysis techniques, including mass spectrometry, are necessary to further expand these studies. Nevertheless, the field lacks a high-throughput, wide-range, high-recovery separation method for native protein assemblies. Here, we present clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), which is a novel separation modality for non-covalent protein assemblies. CN-GELFrEE separation performance was demonstrated by fractionating complexes extracted from mouse heart. Fractions were collected over 2 hr and displayed discrete bands ranging from ~30 to 500 kDa. A consistent pattern of increasing molecular weight bandwidths was observed, each ranging ~100 kDa. Further, subsequent reanalysis of native fractions via SDS-PAGE showed molecular-weight shifts consistent with the denaturation of protein complexes. Therefore, CN-GELFrEE was proved to offer the ability to perform high-resolution and high-recovery native separations on protein complexes from a large molecular weight range, providing fractions that are compatible with downstream protein analyses.

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

CN-GELFrEE - net yerli jel-elüt sıvı kısmı Tuzak Elektroforez

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Color Spot Test As a Presumptive Tool for the Rapid Detection of Synthetic Cathinones

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and other border protection agencies globally. Color testing is a presumptive identification technique indicating the presence or absence of a particular drug class using rapid and uncomplicated chemical methods. Owing to their relatively recent emergence, a color test for the specific identification of synthetic cathinones is not currently available. In this study, we introduce a protocol for the presumptive identification of synthetic cathinones, employing three aqueous reagent solutions: copper(II) nitrate, 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline (neocuproine) and sodium acetate. Small pin-head sized amounts (approximately 0.1-0.2 mg) of the suspected drugs are added to the wells of a porcelain spot plate, and each reagent is then added dropwise sequentially before heating on a hotplate. A color change from very light blue to yellow-orange after 10 min indicates the likely presence of synthetic cathinones. The highly stable and specific test reagent has the potential for use in the presumptive screening of unknown samples for synthetic cathinones in a forensic laboratory. However, the nuisance of an added heating step for the color change result limits the test to laboratory application and decreases the likelihood of an easy translation to field testing.

Here we present a simple, inexpensive, and selective chemical spot test protocol for the detection of synthetic cathinones, a class of new psychoactive substances. The protocol is suitable for use in various areas of law enforcement that encounter illicit material.

Renk sentetik Cathinones hızlı tespiti için meşru bir araç olarak nokta testi

Synthetic cathinones are a large class of new psychoactive substances (NPS) that are increasingly prevalent in drug seizures made by law enforcement and ...

Breath Collection from Children for Disease Biomarker Discovery

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, tuberculosis, lung cancer, and liver disease. This protocol describes a reproducible method for sampling breath in children and then stabilizing breath samples for further analysis with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The goal of this method is to establish a standardized protocol for the acquisition of breath samples for further chemical analysis, from children aged 4-15 years. First, breath is sampled using a cardboard mouthpiece attached to a 2-way valve, which is connected to a 3 L bag. Breath analytes are then transferred to a thermal desorption tube and stored at 4-5 &#176;C until analysis. This technique has been previously used to capture breath of children with malaria for successful breath biomarker identification. Subsequently, we have successfully applied this technique to additional pediatric cohorts. The advantage of this method is that it requires minimal cooperation on part of the patient (of particular value in pediatric populations), has a short collection period, does not require trained staff, and can be performed with portable equipment in resource-limited field settings.

This protocol describes a simple method for the acquisition of breath samples from children. Briefly, samples of mixed air are pre-concentrated in sorbent tubes prior to gas chromatography-mass spectrometry analysis. Breath biomarkers of infectious and non-infectious diseases can be identified using this breath collection method.

Çocuklar hastalık biyomarker keşif için derlemeden nefes

Breath collection and analysis can be used to discover volatile biomarkers in a number of infectious and non-infectious diseases, such as malaria, ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

Silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...