Bu çalışma Sağlık Hibe GM094246, Amerikan Kalp Birliği Hibe 11GRNT7890004 ve Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-1110501 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1. ilgili proteini içeren Construct oluşturma Uygun bir vektör içine ilgi konusu proteini eksprese eden genin klonlanması. Örneğin, seri ya da pcDNA pRK5 gibi kullanımlar vektörler HEK293 ve CHO hücreleri gibi memeli sistemlerinde ifade için uygundur gibi. Fluorophoresle Takip edilecek Protein üzerindeki Siteleri seçin 2. <ol><li> Protein içinde mümkün yapısal değişiklikleri yansıtmak mümkün etiketleme siteleri seçin. Eğer mümkünse, bu tespit etmek için, proteinin ya da homolog proteinin bir kristal yapısını kullanır. Hiçbir kristal yapısı mevcut değilse, proteinin olası yapısı tahmin etmek ve böylece, uygun bölgelere ilişkin bilgi almak için çevrimiçi yazılım. </li><li> Protein sokulabileceği şekilde seçilen kalıntıların yan zincirleri, yüzeyde maruz kalan ve florofor için erişilebilir olduğu şekilde tortuları seçin. <ol><li> Artıklarını seçmekligand bağlanması karışmayan örneğin siteler için protein fonksiyonu için kritik değildir. </li><li> Sistein mutasyonu ise, protein yapısı minimal bozukluklarına neden olur örneğin serin, benzer siteleri, tercih vermek. </li><li> Etiketleme the seçtikten sonra, protein, sadece bu amaçlanan sitelerden LRET verir sağlamak için mutasyonlar tercih. Uzaklıkta potansiyel floresan etiketler ile konjüge maleimit bağlanan şekilde düzenli olmayan, disülfit bağlı, mutasyona sistein, standart alana-yönlendirilmiş mutagenesis protokolleri kullanarak. , Bunlar proteinin katlanmış şeklinde floresan boyalar ile reaksiyona girmemesi gerekmektedir Bu beri uzak, disülfit bağlı, sistein ve gömüldü, serbest sisteinleri mutasyona etme. </li></ol></li><li> Standart alana-yönlendirilmiş mutagenez yöntemi kullanılarak nokta mutasyonu yaparak istenen sitelerinin sistein artıklarını tanıtılması. </li><li> Özellikle proteinden sisteinlerin bir kapalı yarabilir bir proteaz bölünme sitesini içerir. Eğerbu, tutucu (tanıma sekansı LVPRGS) veya trombin için protein ile mutasyona mevkisinin katılması için protein dizisi sağlar Faktör Xa (tanıma sekansı IDGR veya IEGR) sokulan sistein yakınında bölünmesini dizisi ve proteaz için erişilebilir; aksi takdirde tetra-ya da heksa-peptid dizisi, bir bütün olarak ilave edilebilir. Yarılma üzerine katılan sistein biri geri kalanından ayrışmaktadır şekilde site seç-protein bazı durumlarda, bu mutasyona uğramış bir sistein yan iki bölünme mevkilerinin gerektirebilir. </li></ol> 3. Test Protein İfadesi ve İşlevselliği <ol><li> Mutasyona uğrayan proteinin ifadesini teyit etmek için bir Western blot gerçekleştirin. </li><li> Hiç, bir işlevsel olmayan proteinin yapısal değişiklikleri önlemek için eğitim durumunda, mutasyonlar minimal protein işlevi değişmiş sağlamak için proteinin işlevsel bir test gerçekleştirir. NOT: Tüm proteinler farklı işlevlere sahip olduğundan, tek bir f yoktur<html> LRET için özel olarak kullanılan unctional deneyi; Bununla birlikte, işlevsel tahlillerde bazı örnekler, iyon kanalları için enzimlerin enzim aktivitesi deneyleri, reseptörleri için ligand bağlanma deneyleri ve elektrofizyoloji çalışmaları içerir. </li></ol> 4. İkinci edilecek Flüoroforlar seçin Beklenen mesafe aralığına göre seçeneğini flüorofor arasındaki aralık 0.5-1x florofor çiftinin R, 0 olacak şekilde ölçülmüştür. NOT: Bu genellikle daha uzun ömür vardır arka plan, bir daha kolay çıkarma sağlar. Bu çifti için R 0 53 Å (Tablo 1) çünkü Örneğin, beklenen mesafe aralığı ölçülen eğer yaklaşık 35 Å, donör ve alıcı olarak Alexa 594 kadar terbiyumun selat olacağını kullanmak için uygun bir flüorofor çifti vardır. Geçici olarak Memeli Hücrelerinin Gereken miktarı ile transfekte olan proteini de ifade 5. ntent &quot;&gt;, geçici olarak, ortak transfeksiyon reaktifleri herhangi biri kullanılarak seçilen memeli hücrelerine ilgi konusu proteini transfekte Tipik haliyle, HEK ve bunlara CHO hücre çizgileri için LRET deney başına dört adet 10 cm&#39;lik kaplar kullanır;., ancak bu miktar, protein ekspresyonuna bağlı olarak değişebilir , stabilite, vs. hücrelerin hasat edilmesinden önce 36-48 saat boyunca protein ifade etmek için izin verin. 6. Proteinler Etiket <ol><li> Kültür çanak hücreleri ayırmak. Sadece çanak dibine tampon pipetle HEK hücreleri ayırmak. Ekstrasellüler tampon ile medya yıkayarak, bir hücre kazıyıcı ile CHO hücreleri ayırmak. </li><li> 3 dakika boyunca 1100 x g&#39;de santrifüj ile hücreler toplanır. Sonraki yıkamadan sonra, yanı sıra etiketleme sonra hücrelerin toplanması için bu aynı santrifüj ayarları kullanın. </li><li> Daha sonra, 100-300 nM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar eşit mol miktarlarında, verici ve alıcı florofor ekleyin hücre tamponu, 3 ml süspanse. Rotator f inkübeya da oda sıcaklığında 1 saat. </li><li> Daha sonra, bağlanmamış florofor kaldırmak LRET ölçümleri için hücre dışı bir tampon maddesi (genellikle 2 mi) içinde, bu hücrelerin süspansiyonu hücre tamponu ile 3-4x bu etiketlenmiş hücreleri yıkayın. </li><li> Bir kontrol olarak, bir akseptör-floroforu ilavesi olmaksızın, sadece, donor-florofor (terbiyum şelat) ile hücrelerden oluşan ayrı bir dizi etiket. Not: Bu donör okunur deneylerden elde edilen veriler analiz tamamlanması için gereklidir. Bu deneyler, aynı ya da farklı günlerde yapılabilir. </li><li> Etiketleme işlemi de işlev etiketlenmesi için kullanılan siteye bağlı olarak engel olabilecek Yine, fonksiyonel doğrulama, etiketli mutant protein ile bu kez gerçekleştirin. NOT: Bu deneyler, aynı ya da farklı günlerde yapılabilir. </li></ol> 7. LRET Deneyi kurun <ol><li> 1 ml &#39;lik bir minimum hacimde bir kuartz küvet içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin. </li><li> Bilgisayar ve cihaz üzerinde açın ve DAT parametrelerini ayarlamakBu duruma göre, bir satın alma programı. <ol><li> (Terbium Şelatın için iyi çalışır nm 330-340) donör floroforun absorbans aralığı dalgaboyu ayarlayın. </li><li> Alıcı emisyon kullanılan alıcısı göre değişir göz önünde tutarak, uygun emisyon dalga boyu ayarlayın. Önemlisi, sadece alıcı emisyonunu ölçer ve herhangi akmalarını donörün emisyonundan içermeyen bir algılama dalga boyu seçmek. Örneğin, bir alıcı Tablo 1 Alexa 555 için 565 nm bir dalga boyuna kullanılır. Proteinin, sadece vericinin ile değil alıcı içermeyen etiketli edildiği donör okunur ölçümleri için, terbiyum çelat yayımını ölçmek için 545 nm dalga boyuna kullanır. </li><li> Emisyon algılama uzunluğu uzun ömür bileşeni cevapsız olmayacak emin olmak için en az üç kez beklenen LRET ömür boyu olacak şekilde ayarlanır. </li></ol></li><li> Tarama gerçekleştirin. 99 Piyango en az üç taramaları sonuçlarının tutarlılığını sağlamak için vermeyin. Inci KaydetBir metin dosyası (* txt) e sonuçları. </li><li> (Örneğin, bir ligand eklenmesi gibi) farklı koşullar ile ilgili bir proteinin yapısal değişiklikleri ölçmek için, bu koşullar değiştirebilir ve tekrar yeni bir koşul altında aynı numune üzerinde 99 temizleyicileri her birinin en az üç taramalar yapar. Glutamat reseptörlerinin yapısı üzerinde glutamat etkileri incelenirken, örneğin, adım 7.3 taranan aynı numune için 1 mM glutamat ekleyin ve yeniden tarama. </li><li> Uygun proteaz beş adede kadar ekleyin ve bölünme tamamlanır ve daha fazla değişim birbirini izleyen üç taramalar için ömür boyu görülene kadar sürekli taramalar alır. Genellikle, iki bölme ile 3 saat içinde tamamlanır. Bir Faktör Xa proteaz klivaj sahası bölünmesi için kullanılmaktadır, örneğin, örneğe Faktör Xa 3 ul ekleyin ve 3 saat boyunca her 30 dakikada bir tarama. </li></ol> 8. Elde edilen verileri analiz <ol><li> Veri analiz yazılımı açın. </li><li> Floresan ömrünü yükleyinmetin dosyalarını açmak için İthalat ASCII kullanarak veri. Bir dosya içine tüm çoğaltır yanı sıra nihai plan ölçümleri, yükleyin. </li><li> Son verileri almak için her deneysel koşul için tüm taramaları verilerin ortalamasını. Bireysel denemeler içeren sütunları vurgulamak Bunu yapmak için, daha sonra menü çubuğunda Veri menüsü altında, denemelerinden ortalama floresan yoğunlukları yanı sıra, standart sapma ve standart hata görüntülemek için Satırlar üzerine İstatistiklere tıklayın. </li><li> Akseptörünün duyarlı emisyon ömrünü temsil eden bir eğri oluşturmak için X-ekseni üzerinde mikrosaniye Y ekseni ve hizmet ömrü floresan ile bir çizgi grafiği olarak ortalama değerleri çizilir. Verilerin daha iyi görünüm için izin, bir günlük ölçekte komplo Y-eksenini değiştirmek. </li><li> Tam bölünmeye işaret örtüşme gösteren son taramalar ortalama plan ölçüm verileri üzerinde adımı yineleyin 8.3. </li><li> Üzerinde ortalama arka plan verileri görüntülemekortalama ham verileri içerir aynı parsel. Bunu yapmak için, Plot menüsü altında bulunan Katman Denetimi iletişim kutusunu açın. Sonra, ortalama Katman İçindekiler listesine arka plan içeren veri aktarımı. </li><li> Ortalama ham verilere ortalama plan veri hizalayın. Bunu yapmak için, çarpma veya arka kuyruk ucu ham veri kuyruk ucu ile örtüşmektedir kadar gerektiği gibi arka plan verileri bölmek için Matematik menüsü altında Basit Matematik işlevini kullanın. NOT: Bu kuyruk sonunda, ilgilenilen protein ömrü zaten tamamen çürümüş olması gerekir; Ne hizalanır önce ve proteaz bölünme sonrasında sadece arka plan sinyali mevcuttur. </li><li> Tekrar Basit Matematik işlevini kullanarak, başlangıç ​​ham LRET sinyalinden hizalanmış plan sinyali çıkarın. </li><li> Bir üslü için veri uygun (tek veya çoklu üstel, siteler ve deneysel tasarım bağlı). <ol><li> Bitiminden sonra başlayacak takılması için başlangıç ​​sınıra ayarlayınlazer nabız. Sonraki tüm eğri parçaları için aynı StartPoint kullanın. </li><li> Tek üslü bir bozulma için aşağıdaki denkleme süresi uyacak şekilde Seç Uydurma İşlevi iletişim kutusunda, üstel bozulma seçin: <img alt="Denklem 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" /> Denk. 4 y floresans yoğunluğunu temsil eder, y, 0 x zaman, T floresan süresi, A, 1, sinyal yoğunluğu nedeniyle sistemden gürültü arka plan yoğunluğu temsil etmektedir, ve x, 0 ofset zamandır. </li><li> X 0-0 Fix Montaj Fonksiyonu başlatmak ve veri uygun. Not: Deney tek siteleri bir çiftten sinyal sahip olacak şekilde tasarlanmıştır, elde edilen verileri kolayca tek üslü bir bozulma 8 ile uygun olmalıdır. Uyum kalıntı uyum iyiliğini belirlemek için iyi bir yöntemdir ve ek çürüme ömürleri kullana iseed. </li></ol></li><li> Förster denklemi (Denklem yukarıdaki 1 ve 2 yeniden düzenlenmesini) kullanarak floroforlar arasındaki mesafeyi hesaplamak için veri elde ömür kullanın: <img alt="Denklem 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" /> Denk. 5 Not: τ DA hassaslaştırılmış alıcı emisyon ömrü gibi ölçülmüştür edilmiş olan, yukarıda da belirtildiği gibi tüm değişkenlerdir. R 0 ve R ölçümleri konusunda daha fazla ayrıntı ve örnekler başka 7,9,10 bulunabilir. </li><li> Tekrarlanabilirliği sağlamak deney ve veri analizini, en az üç kez tekrarlayın. Aynı ölçüm bireysel tekrarlar arasında tutarsızlık söz içine verilerin geçerliliğini çağırır; ek kontrol deneyleri veya tekrarlar kullanın. Hatayı yayar (Dr. Thomas Huber tarafından geliştirilen) ücretsiz Gustavus Hata analizi hesap veya benzer bir sistemi kullanarak ölçüm hataları hesaplayınömür boyu uyuyor. </li></ol>

<ol>
	<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes.">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate:+improvements+on+fluorescence+energy+transfer.">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li><li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium.">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li><li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates:+part+2.">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li><li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor.">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel.">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor.">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+(NMDA)+receptors.">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li><li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbium(III)+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors.">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

LRET bilim adamları, tek bir proteinin içinde yanı sıra multimer alt birimler arasındaki etki arasındaki mesafeleri ölçmek için olanak sağlayan güçlü bir tekniktir. Bu nedenle, LRET proteinlerden veya diğer makromoleküllerden yapısal değişiklikleri ve dinamiğini incelenmesi için çok uygundur. Yukarıdaki protokol kolayca hipotezlerini test etmek için düzgün donanımlı laboratuvarı izin vermelidir; Ancak, yeni araştırmacının başına bela olabilecek hata birçok ortak kaynakları vardır. Az...

Lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) iyi bilinen bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) tekniği 1 bir türevidir. FRET benzer şekilde, 10-100 LRET 1-3 aralığında ilgilenilen proteinin üzerinde özel sahalara bağlı verici ve alıcı florofor arasındaki mesafeler ve mesafe değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. LRET ilkeleri, donor-florofor emisyon spektrumu halinde akseptör-florofor emme spektrumu ile üst üste bindiğinde, iki florofor arasındaki yakın meydana Ayrıca rezonans enerji transferi FRET benzerdir. Bu transfer verimi aşağıdaki denklem ile, iki florofor arasındaki mesafe ile alakalıdır: <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> Denk. 1 R, iki florofor arasındaki mesafedir, E en verimliliğidirAşağıda tartışıldığı ji transferi ve R, 0, transfer verimi yarı maksimal olduğundaki mesafe örneğin flüorofor çifti için Förster yarıçapı vardır. Bu denklemden, bir o verim ters altıncı güç 1 yükseltilmiş mesafenin büyüklüğü ile ilgilidir görebilirsiniz. Bu zaman FRET çiftinin R 0 yakın hatta küçük mesafe değişikliklere zarif duyarlı olmaya FRET ve LRET ölçümler sağlar bu ters altıncı güç bağımlılığıdır. Özellikle proteinlerden veya diğer makromoleküllerden üzerinde arzu edilen the etiketlenebilmesi, bir yapısal değişimleri izlemek için bu duyarlılığının avantajından yararlanmak için izin verir. Geleneksel organik boya molekülünü kullanan FRET, karşılaştırıldığında, LRET ilave avantajlar sunmaktadır. LRET ise, aksine, donor-florofor, bir lantanid serisi katyon, tipik olarak, Tb 3 + veya 3 + AB gibi bir organik boya kullanarak, 1,4-6 kullanılır. U düşmek Flüoroforlarnder Bu kategori, örneğin, terbium kelatı, ki bu da alıcı Flüoroforlann geniş bir yelpazede kullanılabilecek çok yönlü. Şelatlanmış lantanit emisyon spektrumu çok keskin bir emisyon tepe noktaları içeren, bu esneklik, alıcı florofor çeşitli biri ile kullanılacak olan donor-florofor ait tek bir türün izin veren, mümkün olmaktadır. Böylece, duyarlı alıcı emisyon donör emisyon 5 den sızdırma-through kirlenmesine neden korkusu olmadan tespit edilebilir. Deneyci, iki florofor (Şekil 1 ve Tablo 1) arasındaki mesafeye göre beklenen spesifik akseptörü seçer. Bu şelat lantanid florofor olarak, metal iyonu, makromolekül 1 belirli bir fonksiyonel gruba iyonu halata bir bioreactive işlevsel grup hem de uyarım, normal olarak zayıf emici lantanid duyarlı hale bir anten grubu içeren bir molekül ile kenetlenmiştir, 5,6. Oncheyecanlı e lantanit milisaniye mertebesinde bir çürüme oranı ile fotonların serbest bırakılması ile zemin durumuna rahatlayın. Çürüme bir tekli-to-tekli gevşeme ne de üçüz-to-tekli gevşeme ne olduğundan, fotonların emisyon düzgün flüoresan veya fosfor denilen olamaz, ama daha düzgün bir aydınlık 1 denir. Lantanide luminesansın uzun çürük büyük ölçüde ömrü ölçümleri yardımcı olur. Ömür ölçümler, daha sonra aşağıdaki ilişki ile verimliliğini belirlemek için kullanılabilir: <img alt="Denklem 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> Denk. 2 nerede, E transferi verimliliği, τ D enerji transferi katılmayan donör (şelatlı lantanide) ömrü ve alıcısı ile enerji transferi katılan zaman τ DA donörün ömrü. LRET ile, τ DA al canterbium yaşam süresi çok daha büyük bir organik akseptör-floroforu daha uzun olduğundan çok hassaslaştırılmış alıcı emisyonunun ömrü olarak ölçülür. Alıcı onun kışkırtmaktan uyarma (donör lantanit) gibi aynı ömrü ile yayar ve akseptör kendi içsel floresan ömür boyu ömür boyu herhangi bir katkısı nispeten ihmal edilebilir düzeydedir. Akseptörüne donör: 1 oranında yerine donör emisyon daha duyarlı emisyonunu ölçerek, biz de tam bir 1&#39;de etiketleme sağlamak için gereksinimini ortadan kaldırır. Protein yerine alıcısı ve verici fluoroforlar hem de aynı anda etiketli olabilir. Bir heterojen olarak etiketli nüfus sonuçlanır, ancak çift verici etiketli proteinler, alıcı dalga boyunda vermeyecek ve çift alıcı etiketli proteinler heyecan olmayacaktır. Ayrıca, florofor arasındaki mesafe, verici olarak bir izotropik lantanidler kullanarak, özellikle belirli bir flüorofor, takılan bu sistein Alanı, aynı olabilir, bu nedenle J`o`kfl olmalıdırd donör veya alıcı ya gereksiz almak için belirli bir siteyi belirtmek için. Şiddeti bir heterojen bir nüfusa sahip etkilenebilir, ama hala tespit edilecek yeterli daha fazla olmalıdır. Denemelerin planlaması zaman florofor seçimi çiftinin R, 0 değeri hem de beklenen mesafe aralığı tarafından dikte edilmelidir ölçülmüştür. R, 0 değeri, aşağıdaki denklem ile tanımlanır: <img alt="Denklem 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> Denk. 3 burada, R, 0 Angstrom olarak Förster yarıçapı, 2 κ (genellikle 2/3 olduğu varsayılır) iki boyalar arasındaki yönlendirme faktördür φ D donör kuantum verimi, J donörün arasında entegral bir spektral örtüşme M emisyon spektrumu ve akseptör en absorbans spektrumu - 1cm-1 mil 4, ve n, 1 ortamın kırılma indisidir. Bizim laboratuar inceleniyoruz protein üzerindeki donör ve akseptör etiket siteleri arasında bir proteaz tanıma sitesi eklenmesi ile geleneksel LRET tekniğe bir değişiklik eklemiştir. Bu modifikasyon gibi bütün olarak memeli hücreleri gibi non-7 arıtıldı sistemlerde araştırma sağlar. Sistein de etiketli olan hücrelerde sistein sülfhidril grupları, diğer proteinlere bağlanan maleimid-konjüge boyalar ile etiketleme işleminde bu yana, etiketleme için yerler olarak sistein kullanılırken bu teknik, özellikle yararlıdır. Bununla birlikte, ilgi konusu bir protein üzerinde bir proteaz bölünme mevkilerini de dahil olmak üzere ve daha önce ve bölünmeden sonra ömürleri ölçülerek deneyi kantitatif ham sinyalinden proteaz bölünme sonra arka plan sinyalini çıkarmak olabilir. Bu çıkarma (Şek ilgilenilen proteinin kaynaklanan belirli bir sinyal izoleure 2). Yukarıda tarif edilen değiştirilmiş bir biçimi kullanılarak, LRET terbiyum şelat verici ve bir protein üzerindeki alıcı sonda arasındaki mesafe değişiklikleri ölçmek ve dolayısıyla saflaştırma için ihtiyaç duyulmadan, proteinin yaklaşık olarak fizyolojik halde yapısal değişimleri izlemek için de kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1.The emme ve siyah şelatlı terbiyum, hem de kırmızı temsili bir alıcı, Alexa 488, emisyon spektrumu. Birden fazla emisyon tepe ve terbiyum çelatın her bir zirve için keskin, dar yayma özelliğine edin. Bu model, terbiyum alıcı florofor ile birlikte kullanılabilir mümkün kılar ve terbiyum yayılıma gösterir, bu aralıklar içinde, duyarlı emisyon ölçümü kolaylaştırır. A ile oldukça iyi örtüşüyor nm 486 de Terbiyum emisyon zirve<html> iki flüorofor arasındaki meydana rezonans enerji transferi için izin Alexa 488 bsorption pik. 515 nm dalga bu terbiyumun emisyon zirveleri arasında vadi içinde ve oldukça 520 nm Alexa 488 emisyon zirvesine yakın olarak bu çifti için hassaslaşmış emisyonu tespit etmek için mükemmel bir seçimdir. Alıcı zirveye yakın olmak, arzu olsa, değil gerekli-565 nm de hala terbiyumun emisyonu tespit olmadan Alexa 488 emisyonu tespit edebildiğini unutmayın. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Akseptör-florofor </td><td style="width:45px;"> R 0 (Å) </td><td style="width:183px;"> Emisyon dalgaboyu (nm) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Fluorescein </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. LRET donör 11 olarak terbiyumun şelatını kullanmak için yaygın olarak kullanılan alıcı Flüoroforlann listesi. Verici ve alıcı, AMPA reseptörlerinin çözünür agonist bağlanma alanına bağlı zaman R, 0 değerleri ölçüldü. Her yeni sistem çalışılan tekrar R 0 değerini ölçmek için idealdir. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. sunulan LRET yöntemin bir bakış. (A) AMPA reseptörü ligand bağlanması üzerine yapısal değişimlere maruz kalan bir zar proteinidir. Kapaklı şeklinde ligand-binding etki kırmızı burada daire içine. (B) protein bağlı olmayan AMPA ligand bağlayıcı etki alanı, bir açık konformasyon (sol) olarak bulunmaktadır. Glutamat ligand bağlı olduğunda, protein ligandının (sağ) kapatır. LBD üzerinde ispat bölgelerinde florofor yerleştirilmesiyle, bu konformasyonel değişimin doğası sonra floresan ömrünü etkileyecek flüoroforlar değişiklikleri arasındaki mesafe olarak görülebilir. (Cı) ile etiketlenmesi, bütün hücreler, ilgilenilen protein hem de arka plan zar proteinlerinin her ikisi de etiketlenmesi (sol) meydana gelebilir. Proteaz bölünme sonra, ilgilenilen protein LRET sinyal sağlam bir arka plan sinyali (sağ) bırakarak, optimum olmayan bir fragmanının çözünür bir salınmasına kaybolur. Bu plan sinyal daha sonra ham sinyal düşülür.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

Lüminesans Rezonans Enerji Transferi, ya LRET, 10-100 Å mesafe aralığındaki proteinlerin iki site arasındaki mesafeleri ölçmek için kullanılan güçlü bir tekniktir. Çeşitli koşullar altında bağlandı mesafelerin ölçülmesi ile, proteinin konformasyonel değişiklikleri kolayca değerlendirilebilir. LRET, bir lantanid, en sık şelatlı Terbiyum ile, böyle uzun bir donör sadece emisyon ömür, birden fazla alıcı florosforlar kullanmak için esneklik ve kolay bir yol olarak hassaslaşmış akseptör emisyon tespit etmek için fırsat olarak avantajlar sağlamaktadırlar, donör flüorofor olarak kullanılır Ayrıca, verici-tek sinyali tespit riski olmadan enerji transferi ölçülür. Burada, zar proteinleri ifade dokunulmamış memeli hayvan hücrelerinin yüzeyi üzerinde analiz ile LRET kullanmak için bir yöntem tarif eder. Biz LRET florofor çifti arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması. Orijinal LRET sinyali aldıktan sonra, bu bölgede bölünme kapsamındaki proteinden gelen spesifik LRET sinyalini ortadan kaldırırBize nicel bölünmesinden sonra kalan arka plan sinyali çıkarmak için izin ilgi. Bu yöntem, daha fazla fizyolojik olarak ilgili ölçüm değerlerinin proteinin saflaştırılması için gerek kalmadan yapılmasına izin verir.

Bir lantanide donörü ile başarılı bir LRET ölçüm milisaniye zaman aralığında sadece ömür boyu bir donör olmalıdır. Verici ile kabul hem etiketli proteini sensitize LRET emisyon süresi. Arka plan çıkarma Şekil 3 sonra mikro saniye aralığında bir kullanım ömrüne sahip, özellikle daha kısa (zaman içinde stabil olmalıdır ömrü bir artışa parçalanma sonucu proteazın doyurmaya yani artık proteaz bölünme Şekil 4, komple olduğunu gösterir) değ...

Watch this Scientific Journal Video about Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells at JoVE.com

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır.

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K Görüntüleme.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır. 

Video: Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Biyomühendislik

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Fetal Akciğer Hücrelerinde Mechanotransduction Okumak Deneysel Bir Sistem

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Memeli hücre kültür Tekdüzen toplamları üretmek için O şeklindeki damarlarının sallayarak bir Orbital

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Floresan Mikroskopi ile Kesme Akışı Altında Tek Moleküllü Konformasyonel Değişikliklerin Karakterizasyonu

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...