This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

Ilgi konusu proteini eksprese eden kararlı hücre soyları 1. Üretim <ol><li> Isı ile inaktive edilmiş FCS ve% 1 penisilin / streptomisin eklenmesi ile ortamı hazırlamak ticari olarak temin edilebilen Dulbecco&#39;s GlutaMAX-I, piruvat, ve 4.5 g / L D-glükoz ile takviye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) Modifiye etmek. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de ortam içinde HEK293 hücrelerinin geliştirin. Her üç günde bir hücrelerini Alt yetiştirmek. Ortamı çıkarın ve 15 ml taze medya hücrelerin tekrar süspansiyon. Yeni 75 cm 2 hücre kültürü şişesi içine pipetle 1 ml 14 mi ortamı eklenir. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücre sayısını analiz. </li><li> Oyuk başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu bir plaka içerisinde tohum HEK293 hücreleri, 24 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> Transfeksiyon için transfeksiyon reaktif üreticisi tarafından sağlanan protokolünü kullanır. Transfeksiyon ayıracı kullanılarak pEGFP-C2 ya da pEGFP-C2-CaeB olan hücreleri transfekte. Kullanmak transfeksiyon extra pure ısınmak için önceent ve RT için gerekli ortam. DNA transfeksiyon reaktifi: 1 oranını 3 kullanın. <ol><li> Ayrıntılı olarak, bir pipet ile doğrudan serumsuz DMEM ortamı içinde 50 ul transfeksiyon reaktifi 1.5 ul. Kompleks oluşumu için, transfeksiyon reaktifi ihtiva eden karışıma kodlayan DNA, GFP ya da GFP-CaeB 0.5 mg pipet ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Bir damla damla bir tarzda, reaksiyon karışımı ekleyerek hücreleri transfekte ve 24 saat boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> 1 mg ekleme /% 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de GFP-pozitif klonların seçilmesi için geneticin&#39;e ml. </li><li> : 1 oranında 6 gün sonra, 1, orta ve HEK293 süpernatan barındıran bir 96-çukurlu plaka içinde sıralama akış sitometrisi ile, tek hücrelerin izole eder. 4966 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj edildi kültürlenmiş konfluent HEK293 hücrelerinden HEK293 süpernatant oluşturur. </li><li> Ertesi gün, ortam 1,5 ihtiva eden kültür ortamı yerine0 mg / ml genetisin. Haftada bir kez medya değiştirin. Hücreler konfluent tek tabaka oluşturmak için, bir 24-çukurlu plaka aktarın. 1.5 mg / ml genetisin içeren ortamda 5: 1 arasındaki bir oranda, haftada iki kez hücreleri alt yetiştirirler. Son olarak, bağışıklık beneklenme analizi ile GFP-pozitif hücrelerin yüzdesi analiz etmek ve akış sitometrisi. </li></ol> Bağışıklık beneklenme analizi ile kararlı hücre kuşaklarının 2. analizi <ol><li> Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C &#39;de 5 ila 95 ° C&#39;de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 4 hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın. </li><li> PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0 gözenek boyutu.Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde 45 um). </li><li> PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar. </li><li> MPT 4 ml anti-GFP antikorunun 4 ul seyreltilir ve 4 ° C&#39;de membranlar O / N inkübe edin. </li><li> 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları. </li><li> MPT 4 ml yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor, 0.8 ul membranlar inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (2.6 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın. </li></ol> 3. Bir Akış Sitometreyi Kullanarak Hücreleri analiz edin. <ol><li> PBS hücrelerin tekrar. Ileri sc ayarlamak için negatif kontrol olarak HEK293 hücreleri kullanınardıl (FSC) ve yan dağılım (SSC) hücreleri ölçekte böylece. Hücre çiftleri, agrega ve hücre artıkları dışlayarak canlı hücrelerin üzerinde bir kapı çizin. </li><li> Lekesiz hücreler çok FL1 kanalı (488 nm argon lazer) için histogram soldaki böylece photomultiplier tüp (PMT) kazanç ayarlayın. </li><li> HEK293-GFP ve HEK293-GFP-CaeB hücrelerinin floresan yoğunluğu analiz etmek FL1 kanalının histogram açıp kapı nüfus 10.000 olayları kazanır. </li><li> Ticari FACS analiz yazılımı kullanarak verileri analiz. </li></ol> Uyarımlı Ekspresyon Vektör Sistemi ile Sabit bir Hücre Serisinin 4. transfeksiyonu <ol><li> Tohum HEK293 hücreleri / oyuk 1 x 10 5 hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir plaka içerisinde GFP ya da GFP-ifade eden CaeB. </li><li> 19 saat sonrası tohumlama, regülatör plazmid ve tepki plazmid ya kodlayan Bax veya aktive kaspaz 3 ile hücreleri co-transfect. <ol><li> Stabil HEK293 hücrelerinin birlikte transfekte edilmesipWHE125-P regülatörü plazmid 100 ng (Şekil 2) ve yanıt plazmid pWHE655-hBax ya pWHE655-revCasp3 (Şekil 3) ve polietilenimin 0.4 ul, 100 ng. </li><li> Opti-MEM ortamı 75 ul DNA ve polietilenimin transfeksiyon reaktifi, her hazırlama ve oda sıcaklığında tam olarak 5 dakika boyunca inkübe edin. Kompleks oluşumu için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca her iki karışımları birlikte inkübe edilir. </li></ol></li><li> Polietilenimin / DNA solüsyonu damla damla hücrelere ilave edin ve% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Apoptoz 5. İndüksiyon <ol><li> Post-transfeksiyon 5 saat, kültür ortamına 1 ug / ml doksisiklin ilavesiyle pro-apoptotik proteinlerin ekspresyonunu indükler. % 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 18 saat inkübe hücreleri. </li></ol> İmmünoblot Analizi Ana Hücre Apoptoz 6. Analizi <ol><li> H öncesinde hücrelerin kontrol edinışık mikroskobu altında arvesting hücre ölümü indüksiyonu için kontrol edin. Apoptotik hücreler ölüyor hücreyi çevreleyen apoptotik cisimlerin varlığıyla algılanabilir vardır. </li><li> Süpernatantı ve sıcak bir kez PBS ile yapıştırılır hücreleri yıkayın. -20 ° C &#39;de 5 ila 95 ° C&#39;de dakika ve mağaza 2x Laemmli numune tampon maddesi, ısı 100 ul tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> % 12 SDS-PAGE jeli üzerindeki numune başına yaklaşık 4 x 10 4 hücrelerini yükleyin. Buna ek olarak, bir molekül ağırlığı markörü olarak, ticari bir protein merdivenin yük 6 ul. 1x Laemmli çalışan tamponu ile 45-60 dakika için 180 V sabit bir gerilim altında, bir jel elektroforez sistemi jeller çalıştırın. </li><li> Trans Blot SD Yarı kuru transfer hücresi kullanılarak 60 dakika boyunca 16 V sabit gerilimde PVDF zarları üzerine Blot proteinler (0.45 um gözenek boyutu). </li><li> PBS içinde% 5 yağsız kuru süt, 10 ml /% 0.05 Tween 20 (MPT), oda sıcaklığında 1 saat süre ile Blok membranlar. </li><li> 4 μ seyreltinMPT 4 ml anti-ayrıldı poli ADP-riboz polimeraz (PARP) antikorun L ve 4 ° C de O / N inkübe edin. </li><li> 10 ml PBS /% 0.05 Tween 20 ile üç adet 10 dk yıkama adımları. </li><li> 4 mi MPT içinde seyreltilmiş 0.8 ul yabanturpu peroksidaz-konjuge sekonder antikor ile membranlar inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile membranlar üç kez yıkama /% 0.05 Tween 20 (6.7 de tarif edildiği gibi) kullanılarak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için filmin gelişimi için standart donanım uygulayın. </li><li> 7 mi Western Blot Sıyırma Tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmek suretiyle bağlanan antikorlar çıkarın. </li><li> PBS ile üç yıkamadan /% 0.05 (6.7 de tarif edildiği gibi), Tween 20 sonra, 4 ° C&#39;de MPT O / N 4 ml anti-aktin antikor 4 ul membranlar prob. </li><li> (6.7 de tarif edildiği gibi) MPT üç yıkama aşamasından sonra, ho, 0.8 ul membranlar inküberseradish peroksidaz-konjuge sekonder antikor MPT 4 ml seyreltilmiştir. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra,% 0.05 / PBS ile membranlar 6.7 de tarif edildiği gibi Tween 20 (üç defa yıkamak ve imalatçının protokolüne göre, ticari bir kit ile bayır turpu peroksidaz aktivitesi tespit eder. Protein bantları görselleştirmek için bir film gelişimi için standart donanım uygulayın. Not: Tüm bekletme işlemleri, belirtilen süre ve sıcaklıkta, bir plaka karıştırıcısı üzerinde gerçekleştirilmiştir. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Birçok patojen bakteri salgılar veya konakçı hücreye bakteri efektör proteinleri yerini değiştirmek için salgılama sistemleri liman. Bu efektör proteinler bakteriler hayatta ve ilgili hücre içi niş içinde kopyalanmasına olanak tanıyan, konakçı hücre süreçleri ve yolların modüle kapasitesine sahiptir. Biyokimyasal faaliyetler ve efektör proteinlerin moleküler mekanizmaların anlaşılması patojenite daha iyi anlaşılmasına yönelik yardımcı olacak ve bu hastalıkla mücadele için yeni teda...

birçok Gram-negatif bakteriyel patojenlerin hastalık oluşturma ökaryotik konakçı hücreleri kaçırmak için özel bir salgı sistemleri bağlıdır. Bakteriler hücresel ve biyokimyasal çeşitli aktiviteler modüle edilmesi için bir ev sahibi hücre içerisine bu bakteriyel hastalık oluşturma proteinleri (efektörler) enjekte etmek için, bu salgılama sistemleri kullanırlar. efektör proteinlerin çalışma konak / patojen etkileşimleri temel yönlerini içine değil, aynı zamanda ökaryotik hücreler 1 temel biyoloji içine olağanüstü bir fikir vermiştir sadece. Konakçı hücre, apoptoz modülasyonu birçok hücre içi patojenler için önemli bir virülans mekanizma olduğu gösterilmiştir, ve apoptoz modüle efektör protein bir dizi 2-9 tespit edilmiştir. Bununla birlikte bir aktivite bunların kesin moleküler mekanizmalar birçok durumda halen mevcuttur. Apoptoz, programlanmış hücre ölümü olup, enfeksiyon 10 immün yanıtlarda önemli bir rol oynamaktadır. Apoptoz giden iki ana yollar vartespit edilmiştir: plazma zarı (dışsal apoptosis) hücre ölümü reseptörleri aracılığıyla mitokondri (içsel apoptosis) ya da sinyal iletimini doğrudan hedef. intrinsik veya mitokondri aracılı hücre ölüm yolunu hücre içi sinyaller ile tetiklenir ve Bax ve Bak, Bcl-2 ailesine ait iki pro-apoptotik üye aktivasyonunu içerir edilir. Bu aile hücre ölümü 11-14 kontrol pro- ve anti-apoptotik düzenleyici protein oluşmaktadır. Bax ve Bak sitoplazmaya sitokrom C salınımı ile sonuçlanan, mitokondriyal dış membran daha sonra permeabilization ardından apoptoz aktivasyonu oligomerizasyonu yol açar. Sitokrom C salma apopitozom 15 kaspaz 9 aktivasyonu yoluyla efektör kaspaz 3 ve 7 aktivasyonunu başlatır. Bu diğerlerinin yanı sıra, hücre yüzeyi 16 fosfatidilserin maruz sonuçlanır, seçilen alt-tabakaların proteoliz yol açar ve CH fragmanları özel bir DNaz boşaltırromatin 17,18. Bağımsız bir efektör protein, müdahale eden apoptotik kaskad içinde indüklenebilir bir ekspresyon sistemi 19 kullanılmıştır belirlemek amacıyla. Transgenlerin koşullu ifadesi için düzenleyici sistemler hücre içinde bir proteinin fonksiyonunu veya doku, organ ve organizma gelişimi için önemini, hem de inisiyasyon, ilerlemesi ve hastalık 20-23 bakımı sırasında analiz değerli bir araç olmuştur. Tipik haliyle, örneğin Tet sistemi Burada kullanılan 24 indüklenebilir kontrol sistemleri, yapay bir transkripsiyon birimi (Şekil 1 e bakınız) oluşturur. Bir bileşen, transkripsiyonel aktivasyonu veya 24,26 susturulması aracılık eden bir memeli protein etki bakteriyel transkripsiyon bastırıcı TetR 25 füzyonu ile oluşturulan tTA (tetrasilin bağımlı transkripsiyon aktivatörü) olarak adlandırılan bir yapay tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüdür. İkinci bileşen, bir melezpromoteri, en az bir TATA-kutu ve bir transkripsiyon başlatma bölgesi içeren, bir ökaryotik minimal promotör aşağıdakilerden oluşan, TRE (tetrasiklin-duyarlı öğesi) olarak adlandırılan TetR, teto 24,25 için aynı kökenli DNA bağlanma sitesi birden fazla kopyası katıldı. Üçüncü bileşen TetR, tetrasiklin ya da anhydrotetracycline veya doksisiklin 25 bunun türevleri, biri doğal bir liganddır. Kültür ortamına ligand ilave edilmesinden sonra, TetR teto için afiniteye kaybeder ve TRE ayrışmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, hedef genin transkripsiyonu kaldırılmıştır. Transgen ekspresyonu, bu nedenle sıkı bir şekilde her iki hücre kültüründe, bir zaman ve doza bağlı bir şekilde ve hayvanların 20,23,24 kontrol edilebilir. TTA&#39;nın ile, transgen ekspresyonu, tetrasiklin varlığında dışında, yapısal olarak ortaya çıkar. Tetrasiklin transgen expressio önce sistemden çıkarılması gerekir, bu sitotoksik veya onkojen protein çalışmada bir dezavantaj olabilirN oluşur ve hücre hedef proteinin etkisi izlenebilir. Bu zaman alıcı olabilir ve özellikle transgenik hayvanlarda 27, her zaman tam değil olabilir. Bu sınırlama çözmek için, doksisiklin varlığına ters yanıt veren bir TetR mutant yeni bir transkripsiyon faktörü üretmek için kullanıldı, rtTA 28 (tTA ters). Sadece TRE bağlanan ve eş zamanlı olarak, doksisiklin varlığında transkripsiyonu aktive eder. Sistem, örneğin, kalıntı leakiness. TRE-bağlanmış transkripsiyon faktörünün yokluğunda transgen ekspresyonu, bir genomik entegrasyon sahasında pozisyon etkilerinden ya (i) menşeli, (ii) TRE kendisinin 29, ya da (iii) dan -spesifik tTA / rtTA 28 bağlanmasını, ek bir transkripsiyonel susturucu getirerek hitap etti, sisteme (tetrasiklin bağımlı transkripsiyon susturucu) 30 TTS adlandırılan. Bu rtTA (Şekil 1 e bakınız) ile birlikte bir ikili regülatörü ağı oluşturur.Doksisiklin yokluğunda TTS TRE bağlanan ve aktif bir diğer transkripsiyon kapanır. Doksisiklin varlığında TTS TRE ayrışmaktadır ve rtTA aynı zamanda, hedef genin ekspresyonunu indükleyen bağlar. Sıkılık Bu ek tabaka, yüksek ölçüde aktif, sitotoksik proteinleri 31-34 ifade etmek çoğu zaman gereklidir. Bu sıkı bir şekilde kontrol çift regülatör sistemi kullanarak, apoptotik kaskad verilen efektör protein, apoptosisin engelleyebilir olmadığı analize izin tanımlanmış bir adımda başlatılabilir. Bu yöntem, yalnızca bakteriyel efektör protein, anti-apoptotik aktivitesi çalışma için kullanılan hem de pro-apoptotik ya da toksik proteinlerin uyanlabilir ifadesi için ya da diğer sinyal yollarının parazit kesme için mümkün değildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

Burada sunulan teknik, bir sinyal yolunun bileşenleri ile etkileşime girer, biri bir hedef proteini ya da alternatif olarak, küçük bir molekül adım analiz etmeyi sağlar. yöntem dayanır, bir yandan, belirli bir proteinin endüklenebilir ifadesi üzerindeki seçilen sinyalleşme kademeli olarak tanımlanmış ve önceden tespit edilmiş bir aşamada bir sinyal olayını gerçekleştirmek için kullanılır. Ifade edilen hedef proteinin aktivitesi elde edilen sinyal yolunun okumaya bağlı olarak, yukanya doğru yer alan veya başlatılan sinyal olayının alt baş halinde birlikte ifadesi, diğer yandan, söz konusu genin, sonra araştırmacı değerlendirmelerini sağlar. Burada, apoptotik kaskad protokolü özelliğe göstermek için belirli bir sinyal yolu olarak seçilmiştir. Böyle Coxiella burnetii gibi patojenik bakteriler, hücre içinde bakteri hayatta kalmasını sağlamak için konak hücreye konak hücre ölümü indüksiyon müdahale efektör proteinleri yerini değiştirmek ve geliştirmek için onlarınOrganizmada yaygınlaştırılması. C. burnetii&#39;nin efektör protein, CaeB etkili bir UV ışığı veya staurosporin ile apoptoz indüksiyonu sonrasında konakçı hücre ölümünü engeller. Adım CaeB apoptotik sinyalin yayılma müdahale ettiği daraltmak için, iyi karakterize edilmiş, pro-apoptotik etkinliğe sahip seçilen proteinler doksisiklin indüklenebilir bir şekilde geçici olarak ifade edilmiştir. CaeB Bu proteinlerin yukarı hareket ederse, apoptoz engelsiz devam edecektir. CaeB aşağı hareket ederse, hücre ölümü önlenir. seçilen test proteinleri büyük cellat proteazıdır mitokondri düzeyi ve kaspaz 3, en davranır Bax idi. CaeB Bax ifadesi ile indüklenen hücre ölümü engeller, ama kaspaz 3 sentezlenmesiyle. CaeB, bu şekilde, bu iki protein arasında apoptotik kaskad ile etkileşime girer.

İlk olarak, bir GFP füzyon proteini olarak kararlı bir şekilde ilgi (CaeB) proteinini eksprese eden HEK293 hücre soyları kurulmuştur. Bir kontrol olarak, kararlı bir şekilde GFP eksprese eden HEK293 hücre hatları da oluşturulmuştur. GFP ve GFP-CaeB sentezlenmesi bağışıklık beneklenme analizi ile doğrulanmıştır. Örnek immünoblot (Şekil 4A), GFP ve GFP-CaeB istikrarlı ve net bir şekilde tespit edilebilir ifadesi gösterilmiştir. Tüm hücreleri GFP veya GFP-CaeB ifade edip Anca...

Watch this Scientific Journal Video about Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling at JoVE.com

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Bir uyarılabilir İfade Sistemi uygulamak Hücre içi Sinyali ile Bakteriyel Virulans Faktörler Girişim Eğitim için

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K Görüntüleme.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Video: Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon<em&gt; Manduca Sexta</emBakteriyel virülans Değerlendirememesi&gt; Larva

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Floresan Nanopartiküller Uygulama Hücre içi Bakteri tarafından Endo-lizozomal Sistemi Modelleme Eğitim için

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Mycobacterium abscessus virülans işaretleri tanımlaması fagositler hücre içi çoğaltma için

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

Farelerde Parazit Virülans değerlendirmek için Leishmania amazonensis ile Vivo Enfeksiyon

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...