This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

1. Erzeugung von stabilen Zelllinien, die das Protein von Interesse <ol><li> Vorzubereiten Medien durch Zugabe hitzeinaktiviertem FCS und 1% Penicillin / Streptomycin, handelsübliche Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) mit GlutaMAX-I, Pyruvat und 4,5 g / l D-Glucose. </li><li> Kulti HEK293 Zellen in Medien bei 37 ° C in 5% CO 2. Sub-Zellen zu kultivieren alle drei Tage. Entfernen Sie die Medien und Resuspendieren der Zellen in 15 ml frisches Medium. Pipette 1 ml in eine neue 75 cm 2 Zellkulturflasche und fügen Sie 14 ml Medien. </li><li> Analysieren Sie die Zellzahl mit Hilfe einer Zählkammer. </li><li> Seed HEK293-Zellen in einer 6-Well-Platte in einer Dichte von 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung und Inkubation für 24 Stunden. </li><li> Für die Transfektion verwendet das Protokoll vom Hersteller des Transfektionsreagenz zur Verfügung gestellt. Transfektion von Zellen mit pEGFP-C2 oder pEGFP-C2-CAEB Verwendung des Transfektionsreagenz. Vor der Verwendung erwärmen die Transfektion REAGent und die auf RT erforderlichen Medien. Verwenden Sie einen 3: 1-Verhältnis von Transfektionsreagenz an DNA. <ol><li> Im einzelnen Pipette 1,5 ul Transfektionsreagenz direkt in 50 ul serumfreiem DMEM Medium. Für die Komplexbildung, Pipette 0,5 ug DNA mit Codierung für GFP oder GFP-CAEB zum Transfektionsreagenz enthaltende Mischung und Inkubation für 15 min bei RT. </li><li> Transfektion von Zellen, die durch Zugabe der Reaktionsmischung in einem tropfenweisen Weise und bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 Std. </li></ol></li><li> 1 mg / ml für die Selektion von GFP-positive Klone bei 37 ° C in 5% CO 2 Geneticin. </li><li> Nach 6 Tagen isolieren Einzelzellen durch Durchflusszytometrie Sortierung in einer 96-Well-Platte beherbergen Mediums und HEK293 Stand in einem 1: 1-Verhältnis. Erzeugen HEK293 Überstand aus konfluenten kultivierten HEK293 Zellen, die für 15 min bei 4.966 x g zentrifugiert. </li><li> Am folgenden Tag, ersetzen Kulturmedium mit Medium, das 1,50; mg / ml Geneticin. Ändern Medien einmal pro Woche. Wenn die Zellen eine konfluente Monoschicht, übertragen Sie sie auf einer 24-Well-Platte. Unterkulti Zellen zweimal die Woche in einem Verhältnis von 1: 5 in Medien, die 1,5 mg / ml Geneticin. Schließlich analysiert man den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen durch Immunoblot-Analyse und Durchflusszytometrie. </li></ol> 2. Analyse der stabilen Zelllinien durch Immunoblot-Analyse <ol><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal geklebt mit warmem PBS. Die Zellen in 100 ul 2x Laemmli-Probenpuffer, Hitze für 5 min bei 95 ° C und bei -20 ° C. </li><li> Laden etwa 4 x 10 4 Zellen pro Probe auf einem 12% SDS-PAGE-Gel. Zusätzlich Last 6 &amp; mgr; l eines handelsüblichen Protein Leiter als Molekulargewichtsmarker. Gele laufen in einem Gel-Elektrophorese-System unter einer konstanten Spannung von 180 V für 45 bis 60 min mit 1x Laemmli-Laufpuffer. </li><li> Auslöschen Proteine ​​auf PVDF-Membranen (Porengröße von 0.45 &amp; mgr; m) bei einer konstanten Spannung von 16 V für 60 min unter Verwendung einer Trans-Blot SD Semi-Dry Übertragungszelle. </li><li> Block Membranen in 10 ml 5% fettfreier Trockenmilch in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) für 1 h bei RT. </li><li> Verdünnter 4 ul anti-GFP-Antikörper in 4 ml MPT und inkubieren Membranen O / N bei 4 ° C. </li><li> Führen drei 10 min Waschschritten mit 10 ml PBS / 0,05% Tween 20. </li><li> Membranen mit 0,8 &amp; mgr; l Meerrettichperoxidase-konjugierte sekundäre Antikörper inkubieren in 4 ml MPT. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 2.6 beschrieben) und Meerrettich-Peroxidase-Aktivität zu detektieren mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des Herstellers. Bewerben Standardausrüstung für Filmentwicklung bis Proteinbanden sichtbar zu machen. </li></ol> 3. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer. <ol><li> Die Zellen in PBS. Verwenden HEK293-Zellen als Negativkontrolle zu sc vorwärts einstellenAtter (FSC) und Seitenstreuung (SSC), so dass die Zellen auf der Skala. Zeichnen Sie ein Tor an lebenden Zellen durch den Ausschluss von Zell Dubletten, Zuschlagstoffe und Zelltrümmer. </li><li> Stellen Sie den Photomultiplier (PMT) Verstärkung, so dass die ungefärbten Zellen sind auf der anderen des Histogramms für die FL1-Kanal (488 nm Argonlaser) links. </li><li> Um die Fluoreszenzintensität von HEK293-GFP und HEK293-GFP-Zellen zu analysieren CAEB öffnen Sie das Histogramm des FL1-Kanal und zu erwerben 10.000 Events auf der gated Bevölkerung. </li><li> Analysieren Sie die Daten mit Hilfe von kommerziellen FACS-Analyse-Software. </li></ol> 4. Transfektion der stabilen Zelllinie mit dem induzierbaren Expressionsvektorsystem <ol><li> Samen HEK293-Zellen, die GFP oder GFP-CAEB in einer Platte mit 12 Vertiefungen bei einer Dichte von 1 x 10 5 Zellen / Vertiefung. </li><li> 19 Stunden nach der Aussaat, Co-Transfektion der Zellen mit Plasmid-Regler und Antwort Plasmid entweder kodiert Bax oder aktivierte Caspase-3. <ol><li> Co-Transfektion der stabilen HEK293-Zellenmit 100 ng pWHE125-P-Regler Plasmid (Figur 2) und 100 ng der Antwort Plasmide pWHE655-hBax oder pWHE655-revCasp3 (Abbildung 3) und 0,4 &amp; mgr; l Polyethylenimin. </li><li> Bereiten Sie die DNA und Polyethylenimin Transfektionsreagenz jedes in 75 &amp; mgr; l Opti-MEM-Medium und Inkubation für genau 5 min bei RT. Für die Komplexbildung, Inkubation sowohl Mischungen zusammen für 15 min bei RT. </li></ol></li><li> Füge das Polyethylenimin / DNA-Lösung tropfenweise zu den Zellen und inkubiere bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 5. Induktion der Apoptose <ol><li> 5 h nach der Transfektion induziert die Expression der pro-apoptotische Proteine ​​durch Zugabe von 1 &amp; mgr; g / ml Doxycyclin zum Kulturmedium. Inkubieren Zellen 18 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 6. Analyse der Wirtszell-Apoptose, die durch Immunblot-Analyse <ol><li> Untersuchen Zellen vor der hie Ernte unter dem Lichtmikroskop für Zelltodinduktion überprüfen. Apoptotische Zellen nachweisbaren durch die Anwesenheit von apoptotischen Körpern um die sterbende Zelle. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal geklebt mit warmem PBS. Die Zellen in 100 ul 2x Laemmli-Probenpuffer, Hitze für 5 min bei 95 ° C und bei -20 ° C. </li><li> Laden etwa 4 x 10 4 Zellen pro Probe auf einem 12% SDS-PAGE-Gel. Zusätzlich Last 6 &amp; mgr; l eines handelsüblichen Protein Leiter als Molekulargewichtsmarker. Gele laufen in einem Gel-Elektrophorese-System unter einer konstanten Spannung von 180 V für 45 bis 60 min mit 1x Laemmli-Laufpuffer. </li><li> Blot Proteine ​​auf PVDF-Membranen (Porengröße 0,45 um) bei einer konstanten Spannung von 16 V für 60 min unter Verwendung einer Trans-Blot SD Semi-Dry Übertragungszelle. </li><li> Block Membranen in 10 ml 5% fettfreier Trockenmilch in PBS / 0,05% Tween 20 (MPT) für 1 h bei RT. </li><li> Verdünnter 4 μl anti-gespaltenen Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) Antikörper, der in 4 ml MPT und inkubieren O / N bei 4 ° C. </li><li> Führen drei 10 min Waschschritten mit 10 ml PBS / 0,05% Tween 20. </li><li> Inkubieren Membranen mit 0,8 ul Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper in 4 ml MPT verdünnt. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben), und erfassen Meerrettichperoxidase Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. Bewerben Standardausrüstung für Filmentwicklung bis Proteinbanden sichtbar zu machen. </li><li> Entfernen gebundenen Antikörper durch 30 min Inkubation bei RT mit 7 ml Western Blot Stripping Buffer. </li><li> Nach drei Waschungen mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben), zu sondieren, die Membranen mit 4 &amp; mgr; l anti-Aktin-Antikörper in 4 ml MPT O / N bei 4 ° C. </li><li> Nach drei Waschschritten mit MPT (wie in 6.7 beschrieben), Inkubation der Membranen mit 0,8 ul horseradish Peroxidase-konjugierte sekundäre Antikörper in 4 ml MPT verdünnt. </li><li> Nach 1 h Inkubation bei RT, wäscht Membranen dreimal mit PBS / 0,05% Tween 20 (wie in 6.7 beschrieben, und detektieren Meerrettichperoxidase Aktivität mit einem kommerziellen Kit nach Vorschrift des Herstellers. Wenden Standard-Ausrüstung für die Filmentwicklung, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Anmerkung: Alle Inkubationsschritte wurden auf einem Plattenschüttler für die angegebene Zeit und Temperatur durchgeführt. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Viele pathogene Bakterien beherbergen Sekretionssysteme zur Sekretion oder translozieren bakteriellen Effektorproteine ​​in die Wirtszelle. Diese Effektor-Proteine ​​haben die Fähigkeit, Prozesse und Pfade in der Wirtszelle zu modulieren, so dass die Bakterien zu überleben und zu replizieren, innerhalb ihrer jeweiligen intrazelluläre Nische. Das Verständnis der biochemischen Aktivitäten und die molekularen Mechanismen der Effektor-Proteine ​​werden zu einem besseren Verständnis der Pathogenität zu hel...

Die Virulenz von vielen Gram-negative bakterielle Erreger hängt von spezialisierten Sekretionssysteme zu eukaryotischen Wirtszellen zu entführen. Bakterien nutzen diese Sekretionssysteme bakterieller Virulenzproteine ​​(Effektoren) in die Wirtszelle injiziert werden, um eine Vielzahl von zellulären und biochemischen Aktivitäten modulieren. Das Studium der Effektorproteine ​​nicht nur bemerkenswerten Einblick versehen, in grundlegende Aspekte der Wirt / Pathogen-Interaktionen als auch in die grundlegende Biologie von eukaryotischen Zellen 1. Modulation der Wirtszelle Apoptose wurde gezeigt, dass ein wichtiger Mechanismus für die Virulenz viele intrazelluläre Pathogene zu sein, und eine Anzahl von Effektor-Proteine ​​modulieren Apoptose identifiziert wurden 2-9. , Ihren genauen molekularen Mechanismen der Tätigkeit bleiben jedoch schwer in vielen Fällen. Apoptose, eine Form des programmierten Zelltods, spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf eine Infektion 10. Zwei Hauptwege, die zu Apoptose habenidentifiziert: zur Förderung der Mitochondrien (intrinsische Apoptose) oder direkte Weiterleitung des Signals über den Zelltod-Rezeptoren an der Plasmamembran (extrinsische Apoptose). Die intrinsische oder Mitochondrien vermittelte Zelltod wird durch intrazelluläre Signale ausgelöst und beinhaltet die Aktivierung von Bax und Bak, zwei proapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Diese Familie wird von pro- und anti-apoptotischen Regulatorproteine, die den Zelltod 11-14 steuern zusammen. Die Aktivierung der Apoptose führt zu Oligomerisierung von Bax und Bak, gefolgt von nachfolgenden Permeabilisierung der mitochondrialen Außenmembran, was zu einer Freisetzung von Cytochrom c in das Zytoplasma. Freisetzung von Cytochrom c initiiert Aktivierung der Effektor-Caspasen 3 und 7 durch die Aktivierung von Caspase-9 in der apoptosome 15. Dies führt zu einer Proteolyse von ausgewählten Substraten, die unter anderem führt die Exposition von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche 16 und befreit einen dedizierten DNase, die CH-Fragmentenromatin 17,18. Um zu bestimmen, wo innerhalb der Apoptosekaskade eine individuelle Effektorprotein stört, wurde ein induzierbares Expressionssystem 19 eingesetzt wird. Regulierungssysteme für die bedingte Expression von Transgenen wurden ein wertvolles Werkzeug in der Funktion eines Proteins innerhalb der Zelle oder ihrer Bedeutung für Gewebe, Organ und Entwicklung des Organismus, als auch während der Initiation, Progression und Wartung der Krankheit 20-23 analysiert. Typischerweise induzierbare Kontrollsysteme, wie das Tet-System 24 hier verwendet wird, bilden einen künstlichen Transkriptionseinheit (siehe Abbildung 1). Eine Komponente ist eine künstlich konstruierte Transkriptionsfaktor genannt tTA (Tetracyclin-abhängige Transkriptionsaktivator), durch Fusion des bakteriellen Transkriptionsrepressor TetR 25 an einen Säugetier-Protein-Domäne, die die transkriptionale Aktivierung vermittelt oder Schalldämpfer 24,26 gebildet. Die zweite Komponente ist ein HybridPromotor bezeichnet TRE (tetracycline-responsive element), bestehend aus einem eukaryontischen minimalen Promotor, mindestens eine TATA-Box und eine Transkriptionsinitiationsstelle enthält, verbunden mit mehrfachen Wiederholungen der passenden DNA-Bindungsstelle für TetR, tetO 24,25. Die dritte Komponente ist der natürliche Ligand von TetR, Tetracyclin oder eines seiner Derivate, wie Anhydrotetracyclin und Doxycyclin 25. Bei Ligandenzugabe zum Kulturmedium verliert TetR seine Affinität für tetO und distanziert von der TRE. Als Ergebnis wird die Transkription des Zielgens aufgelöst. Transgen-Expression kann somit fest in einer zeit- und dosisabhängigen Art und Weise sowohl in der Zellkultur und in Tier 20,23,24 gesteuert werden. Mit tTA tritt Transgen-Expression konstitutiv, außer in Gegenwart von Tetracyclin. Dies kann ein Nachteil in der Studie von cytotoxischen oder onkogene Proteine ​​sein, weil Tetracyclin zunächst vom System entfernt werden, bevor Transgen expression erfolgt und Wirkungen des Zielproteins auf der Zelle überwacht werden. Dies kann zeitaufwendig sein und ist nicht immer vollständig, insbesondere in transgenen Tieren 27. Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein TetR-Mutante mit einer umgekehrten Reaktion auf die Anwesenheit von Doxycyclin verwendet, um einen neuen Transkriptionsfaktor zu erzeugen, rtTA (reverse tTA) 28. Es bindet nur an dem TRE und damit einhergehend die Transkription in Gegenwart von Doxycyclin. Restundichtheit des Systems, dh., Transgen-Expression in Abwesenheit von TRE-gebundenen Transkriptionsfaktor Ursprung entweder (i) von Positionseffekten in einer genomischen Integrationsstelle, (ii) von der TRE selbst 29 oder (iii) aus nicht -spezifische Bindung von tTA / rtTA 28 wurde durch Einführung eines zusätzlichen transkriptionalen Schalldämpfer gerichtet, sogenannte TTS (Tetracyclin-abhängige Transkriptions Schalldämpfer) 30 an das System. Es bildet sich ein Zweiregler Netzwerk zusammen mit rtTA (siehe Abbildung 1).In Abwesenheit von Doxycyclin, bindet TTS TRE und schaltet alle verbleibenden Transkription aktiv. In Gegenwart von Doxycyclin, distanziert tTS von TRE und rtTA bindet gleichzeitig Induktion der Expression des Zielgens. Diese zusätzliche Schicht aus Stringenz ist oft notwendig, hochaktive zytotoxische Proteine ​​31-34 exprimieren. Mit diesen streng kontrollierten Doppelregler-System kann die Apoptosekaskade bei einer definierten Schritt kann Analysen, ob die gegebene Effektorprotein mit Apoptose stören initiiert werden. Dieses Verfahren kann nicht nur verwendet werden, um die anti-apoptotische Aktivität von bakteriellen Effektorproteine ​​studieren, sondern auch für die induzierbare Expression von pro-apoptotischen oder toxische Proteine ​​oder zum Präparieren Interferenzen mit anderen Signalwegen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt es, zu analysieren, zu dem Schritt für ein Zielprotein, oder alternativ ein kleines Molekül, interagiert mit den Komponenten eines Signalwegs. Das Verfahren basiert auf der einen Seite, auf der die induzierbare Expression eines spezifischen Proteins mit einem Signalisierungsereignis zu einem definierten und vorgegebenen Schritt in der gewählten Signalkaskade initiieren. Gleichzeitige Überexpression, andererseits aus dem Gen von Interesse ermöglicht dann der Prüfer zu beurteilen, ob die Aktivität des exprimierten Zielprotein stromaufwärts oder stromabwärts von dem eingeleiteten Signalereignisses, abhängig von der Ablesung der Signalweg, der gewonnen wird. Hier wurde die Apoptosekaskade als definierte Signalweg zum Protokollfunktionalität zu demonstrieren ausgewählt. Pathogene Bakterien, wie Coxiella burnetii, translozieren Effektorproteinen, die mit dem Host-Zelltod-Induktion in der Wirtszelle eingreifen, um Überleben der Bakterien in der Zelle zu gewährleisten und zur Förderung ihrerVerbreitung im Organismus. C. burnetii Effektorprotein CAEB wirksam inhibiert Wirtszelle Tod nach Induktion der Apoptose mit UV-Licht oder mit Staurosporin. Zu verengen, bei der Schritt CAEB stört die Ausbreitung des apoptotischen Signals wurden ausgewählte Proteine ​​mit gut charakterisierte pro-apoptotische Aktivität vorübergehend in einer Doxycyclin-induzierbaren Weise exprimiert. Wenn CAEB wirkt stromauf dieser Proteine ​​wird Apoptose ungehindert ablaufen. Wenn CAEB wirkt stromabwärts wird Zelltod gehemmt werden. Die Testproteine ​​wurden ausgewählt Bax, die auf der Ebene der Mitochondrien und Caspase 3, die die Hauptscharf Protease wirkt. CAEB stört Zelltod durch Bax-Expression induziert, aber nicht von Caspase-3-Expression. CAEB somit in Wechselwirkung mit der apoptotischen Kaskade zwischen diesen beiden Proteinen.

Zunächst wurden HEK293-Zelllinien, stabil das Protein von Interesse (CAEB) Exprimieren als GFP-Fusionsprotein hergestellt. Als Kontrolle wurden HEK293-Zelllinien, die stabil GFP generiert. Expression von GFP und GFP-CAEB wurde durch Immunoblot-Analyse verifiziert. Der Vertreter Immunoblot (4A) zeigt stabile und klar nachweisbare Expression von GFP und GFP-CAEB. Jedoch kann dieser Assay nicht bestimmen, ob alle Zellen exprimieren GFP oder GFP-CAEB. Daher wurden die stabil transfizierten HEK293-Zelllinie...

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Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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