This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

관심의 단백질을 발현 안정적인 세포주 1 세대 <ol><li> 열 - 불 활성화 FCS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 첨가하여 용지를 준비 시판 Dulbecco&#39;s은 루타-I, 피루브산 4.5 g / L D- 글루코스로 보충 된 이글 중간 (DMEM)를 수정한다. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 미디어 HEK293 세포를 배양. 모든 사흘 세포를 하위 육성. 용지를 제거하고 15 ml의 신선한 매체 세포를 재현 탁. 새로운 75cm 2 세포 배양 플라스크에 넣고 피펫 1ml를 14 ml의 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혈구를 이용하여 세포 수를 분석한다. </li><li> 웰 당 2 × 105 세포의 밀도로 6 웰 플레이트에 시드 HEK293 세포는 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 형질 감염을 위해 형질 전환 시약의 제조업체에서 제공하는 프로토콜을 사용한다. 형질 전환 시약을 사용하여있는 pEGFP-C2 나있는 pEGFP-C2-CaeB와 세포를 형질. 사용 형질 reag을 따뜻하게 이전ENT과 RT에 필요한 매체. DNA로 형질 전환 시약 : 1 비율 3을 사용합니다. <ol><li> 구체적으로는, 피펫 직접 무 혈청 DMEM 배지 50 ㎕를 형질 감염 시약으로 1.5 μL. 복합체 형성의 경우, 트랜 스펙 션 시약 혼합물을 함유하는 DNA 인코딩 GFP 또는 GFP-CaeB 0.5 μg의 피펫 및 RT에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 적가 방식으로 반응 혼합물을 첨가하여 세포를 형질 감염 24 시간 동안 5 % CO 2에서 37 ° C에서 배양한다. </li></ol></li><li> 1 ㎎을 추가 / 5 % CO 2에서 37 ° C에서 GFP 양성 클론의 선택을 위해 네티 ㎖로. </li><li> 1 비율 : 6 일 후, 1 중간 HEK293 상층 액을 품고 96 웰 플레이트에 정렬 유동 세포 계측법에 의해 단일 ​​세포를 분리. 4,966 × g으로 15 분간 원심 분리 하였다 배양 합류 HEK293 세포로부터 HEK293 상등액을 생성한다. </li><li> 다음 날, 배지를 포함하는 1.5와 배지를 대체0; ㎎ / ㎖ 네티. 일주일에 한 번 미디어를 변경합니다. 세포가 컨 플루 언트 단일 층을 형성하는 경우, 24 웰 플레이트로 옮긴다. 1.5 mg의 / ml의 제 네티 함유 배지에서 5 : 1의 비율로 일주일에 두 번 세포를 서브 배양. 마지막으로, 면역 블롯 분석에 의해 GFP 양성 세포의 비율을 분석하고 유동 세포 계측법. </li></ol> 면역 블롯 분석에 의한 안정적인 세포주 2. 분석 <ol><li> 상층 액을 제거하고 따뜻한 PBS로 한 번 부착 된 세포를 씻으십시오. -20 ° C에서 5 ° C에서 95 분, 상점 배 램 믈리 시료 완충액, 열 100 ㎕에 세포를 재현 탁. </li><li> 12 % SDS-PAGE 겔에 샘플 당 약 4 × 10 4 세포를로드합니다. 또한, 분자량 마커로서 상업적 단백질 사다리 하중 6 μL. 1X 실행 램리 버퍼 45-60 분 동안 180 V의 정전압 하에서 겔 전기 시스템에서 젤을 실행. </li><li> PVDF 막 위에시킨다 단백질 (0의 기공 크기.트랜스 - 블롯의 SD 세미 드라이 전송 셀을 사용하여 60 분 동안 16 V의 정전압에서 45 μm의). </li><li> PBS 중 5 % 탈지 분유 10 ㎖ / 0.05 % 트윈 20 (MPT) RT에서 1 시간 동안 블럭 막. </li><li> MPT 4 ㎖에 방지 GFP 항체의 4 μl를 희석하고 4 ℃에서 막 O / N을 품어. </li><li> 10 ml의 PBS / 0.05 % 트윈 (Tween) 20 세에서 10 분 세척 단계를 수행한다. </li><li> MPT 4 ㎖의 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 접합 이차 항체 0.8 μL와 함께 막을 인큐베이션. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, PBS로 세포막을 세 번 세척 / 0.05 % 트윈 20 (2.6에 기술 된 바와 같이) 및 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 개발을위한 표준 장비를 적용합니다. </li></ol> 3. 흐름 사이토를 사용하여 세포를 분석 할 수 있습니다. <ol><li> PBS로 세포를 재현 탁. 순방향 SC를 조정할 음성 대조군으로서 HEK293 세포를 사용atter (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC) 세포 규모되도록. 세포는 이중, 단위 및 세포 파편을 제외하여 살아있는 세포에 게이트를 그립니다. </li><li> 흠없는 세포가 훨씬 FL1 채널 (488 nm의 아르곤 레이저)에 대한 히스토그램의 왼쪽에 있도록 광전자 증 배관 (PMT)의 이득을 조정합니다. </li><li> HEK293-GFP 및 HEK293-GFP-CaeB 세포의 형광 강도를 분석하는 FL1 채널의 히스토그램을 열고 게이트 모집단 만 이벤트를 취득. </li><li> 상업적 FACS 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol> 유도 성 발현 벡터 시스템과 안정적인 세포주 4. 형질 <ol><li> 종자 HEK293 세포를 안정적 / 웰의 1 × 105 세포의 밀도로 12 웰 플레이트에서 GFP 또는 GFP-CaeB 표현. </li><li> 19 시간 후 - 시드, 레귤레이터 플라스미드 및 응답 플라스미드 중 인코딩 Bax의 또는 활성화 된 카스파 제 3 세포를 공동 - 형질. <ol><li> 안정된 HEK293 세포를 공동 트랜pWHE125-P 레귤레이터 플라스미드 100 NG (그림 2)와 응답 플라스미드 pWHE655-hBax 또는 pWHE655-revCasp3 (그림 3)과 폴리에틸렌 이민 0.4 μL의 100 NG와. </li><li> 옵티-MEM 배지의 75 μL의 DNA와 폴리에틸렌 이민 형질 전환 시약을 각각 준비하고 실온에서 정확히 5 분 동안 품어. 복합체 형성의 경우, RT에서 15 분 동안 혼합물 모두를 함께 배양한다. </li></ol></li><li> 폴리에틸렌 이민 / DNA 용액 드롭 현명한 세포를 추가하고 5 % CO 2에서 37 ° C에서 품어. </li></ol> 세포 사멸 5. 유도 <ol><li> 트랜 스펙 션 후 5 시간은 배지 1 μg의 / ㎖의 독시사이클린을 첨가하여 프로 - 세포 사멸 단백질의 발현을 유도한다. 5 % CO 2에서 37 ° C에서 18 시간 동안 세포를 인큐베이션. </li></ol> 면역 블롯 분석에 의한 숙주 세포 사멸 6. 분석 <ol><li> 시간 전에 세포 검사광학 현미경 arvesting하는 세포 사멸 유도를 확인합니다. 사멸 세포가 죽어가는 세포를 둘러싸는 세포 자멸 소체의 존재시켜 검출한다. </li><li> 상층 액을 제거하고 따뜻한 PBS로 한 번 부착 된 세포를 씻으십시오. -20 ° C에서 5 ° C에서 95 분, 상점 배 램 믈리 시료 완충액, 열 100 ㎕에 세포를 재현 탁. </li><li> 12 % SDS-PAGE 겔에 샘플 당 약 4 × 10 4 세포를로드합니다. 또한, 분자량 마커로서 상업적 단백질 사다리 하중 6 μL. 1X 실행 램리 버퍼 45-60 분 동안 180 V의 정전압 하에서 겔 전기 시스템에서 젤을 실행. </li><li> 트랜스 - 블롯 SD 세미 드라이 전송 셀을 사용하여 60 분 동안 16 V의 전압을 일정 PVDF 멤브레인 상에 도말 단백질 (0.45 ㎛, 기공 크기). </li><li> PBS 중 5 % 탈지 분유 10 ㎖ / 0.05 % 트윈 20 (MPT) RT에서 1 시간 동안 블럭 막. </li><li> 4 μ를 희석MPT 4 용액에 안티 - 절단 폴리 ADP 리보오스 중합 효소 (PARP) 항체의 L과 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 10 ml의 PBS / 0.05 % 트윈 (Tween) 20 세에서 10 분 세척 단계를 수행한다. </li><li> 4 ML의 MPT에 희석 0.8 μL 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 - 복합 이차 항체와 세포막을 품어. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, PBS로 세포막을 세 번 세척 / 0.05 % 트윈 20 (6.7에 기술 된 바와 같이) 및 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화하기 위해 필름 개발을위한 표준 장비를 적용합니다. </li><li> 7 ml의 서쪽 오점 스트립 버퍼로 실온에서 30 분 배양에 구속 항체를 제거합니다. </li><li> PBS로 세 세척 / 0.05 % (6.7에서 설명) 트윈 (20) 후, 4 ℃에서 MPT O / N의 4 용액에 안티 굴지 항체의 4 μL와 세포막을 조사. </li><li> (6.7에서 설명) MPT 세 세척 단계 후, 호 0.8 μL와 세포막을 품어rseradish 퍼 옥시다아제 접합 이차 항체는 MPT 4 ㎖에 희석 하였다. </li><li> RT에서 1 시간 동안 배양 한 후, 0.05 % / PBS로 막은 6.7에 기재된 트윈 20 (세 번 세척하고 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트와 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 활성을 검출한다. 단백질 밴드를 시각화 막 개발 표준 장비를 적용한다. 참고 : 모든 배양 단계가 지정된 시간과 온도에 대한 플레이트 진탕 기에서 수행되었다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

많은 병원성 박테리아는 분비 또는 숙주 세포에 박테리아 효과기 단백질을 분비하기 위해 이동시키다 시스템 항구. 이러한 이펙터 단백질은 박테리아가 생존하고 각 세포의 틈새 내에 복제 할 수 있도록 숙주 세포에서 처리하고 경로를 조절하는 능력을 갖는다. 생화학 활동 및 효과기 단백질의 분자 메커니즘을 이해하면 병원성의 더 나은 이해를 향해 도움 질병을 퇴치하기위한 새로운 치료 도?...

많은 그람 음성 박테리아 병원균의 독성은 진핵 숙주 세포를 납치 전문 분비 시스템에 따라 달라집니다. 박테리아 세포 생화학 다양한 활동을 조절하는 숙주 세포에 박테리아 병원성 단백질 (이펙터) 주입이 분비 시스템을 사용한다. 효과기 단백질의 연구는 호스트 / 병원균 상호 작용의 기본적인 양상에 또한 진핵 세포 (1)의 기초 생물학에 현저한 통찰력을 제공하고뿐만 아니라. 숙주 세포 사멸의 조절은 많은 세포 내 병원체에 대한 중요한 독성기구 것으로 도시되었으며, 세포 사멸을 조절 효과기 단백질의 수는 2-9 확인되었다. 그러나, 이들 활동의 정확한 분자 메커니즘은 많은 경우에 남아 도비. 아폽토시스 프로그램 된 세포 사멸의 형태는 감염 10의 면역 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 사멸에 이르는 두 가지 주요 경로는이확인되었다 : 원형질막 (외인성 사멸)에서 세포 사멸 수용체를 통하여 미토콘드리아 (극한 아폽토시스) 또는 신호 전달의 직접적인 타겟팅. 고유 또는 미토콘드리아 매개 세포 사멸 경로는 세포 내 신호에 의해 트리거 백스와 박,하는 Bcl-2 가족의 두 프로 - 세포 사멸 회원의 활성화를 포함한다. 이 패밀리는 세포 사멸을 조절 11-14 프로 및 안티 사멸 조절 단백질로 구성된다. 백스와 박가 세포질에 시토크롬 C 릴리스의 결과로, 미토콘드리아 외막의 후속 투과성으로 다음의 세포 사멸의 활성화는 올리고머로 연결됩니다. 시토크롬 C의 릴리스는 apoptosome을 15 카스파 제 9의 활성화를 통해 이펙터 카스파 3과 7의 활성화를 시작합니다. 이것은 다른 사람의 사이에서, 세포 표면 (16)에 포스파티딜 세린의 노출 결과, 선택된 기판의 단백질 분해로 연결하고 채널을 프래그먼트 전용 DNase의를 해제romatin (17, 18). 개별 이펙터 단백질 방해 사멸 캐스케이드 내에 유도 발현 시스템 (19)을 사용 위치를 판별하기 위해. 유전자의 조건식을위한 규제 시스템은 세포 내에서 단백질의 기능이나 조직, 기관 및 유기체 개발의 중요성뿐만 아니라, 개시, 진행 및 질병 20-23의 유지 보수시를 분석에 매우 중요한 도구왔다. 전형적으로, 이러한 시스템 테트 금회 24 유도 성 제어 시스템은 인공 전사 부 (도 1 참조)를 형성한다. 하나의 컴포넌트는 전사 활성화 또는 24, 26 사일런을 매개 포유류 단백질 도메인 박테리아 전사 리프레 TetR 25의 융합에 의해 형성 TTA (테트라 사이클린 - 의존성 전사 활성제)라고 인위적 조작 된 전사 인자이다. 2 성분은 하이브리드프로모터, 적어도 TATA 박스 및 전사 개시 부위를 포함하는, 진핵 최소 프로모터로 이루어진, TRE (테트라 사이클린 - 반응 요소)라고 TetR, TETO 24,25 대한 동족 DNA 결합 부위의 다중 반복에 접합. 제 3 성분은 TetR, 테트라 사이클린 또는 독시사이클린 또는 anhydrotetracycline 25 그의 유도체, 하나의 천연 리간드이다. 문화 매체에 리간드 또한시, TetR는 TETO에 대한 친 화성을 ​​잃고 트레에서 해리. 결과적으로, 표적 유전자의 전사가 폐지된다. 형질 전환 유전자 발현, 즉, 단단히 모두 세포 배양 시간 및 용량 - 의존적으로 동물 20,23,24 제어 될 수있다. TTA으로, 도입 유전자의 발현은 항생 물질의 존재를 제외하고는 구조적으로 발생한다. 테트라 사이클린 제 트랜스 expressio 전에, 시스템으로부터 제거되어야하기 때문에 이는 세포 독성 또는 발암 단백질의 연구에서 불리 할 수​​있다N이 발생하고 세포에 표적 단백질의 효과를 모니터링 할 수있다. 이것은 많은 시간이 소요될 수 특히 형질 전환 동물 (27)에, 항상 완전하지 않습니다 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 독시사이클린의 존재에 응답하여 역으로 TetR 변이주 새로운 전사 인자를 생성하는 데 사용 된, rtTA 28 (TTA 역방향). 그것은 단지 TRE에 결합하고, 부수적으로, 독시사이클린의 존재 하에서 전사를 활성화시킨다. 시스템, 즉 잔류 leakiness., TRE - 결합 전사 인자의 부재하에 트랜스 유전자 발현, 게놈 통합 사이트 위치 효과로부터의 (ⅰ)을 발생, (ⅱ) TRE 자체 (29), 또는 (ⅲ) 비부터 특이 TTA / rtTA 28의 결합, 추가 전사 사일런서를 도입하여 해결하고, 시스템 (테트라 사이클린 - 의존성 전사 소음기) (30)를 TTS 불린다. 그것은 rtTA (도 1 참조)과 함께 이중 조절기 네트워크를 형성한다.독시 싸이클린이없는 경우, TTS는 트레에 결합 적극적으로 남아있는 전사를 종료합니다. 독시사이클린의 존재 하에서 TTS는 TRE로부터 해리 rtTA 동시에 표적 유전자의 발현을 유도 결합한다. 엄격이 추가 레이어는 활성이 높은 세포 독성 단백질 31-34을 표현하는 것이 필요하다. 이 엄격하게 제어 듀얼 레귤레이터 시스템을 사용하여 세포 사멸 캐스케이드 주어진 이펙터 단백질이 아폽토시스 유도를 방해 할 수 있는지 여부를 분석 할 수 있도록 정의 단계에서 시작될 수있다. 이 방법은 세균 효과기 단백질의 세포 자멸 억제 활성을 연구하기 위해 사용될뿐만 아니라, 프로 - 세포 사멸 또는 독성 단백질의 발현을위한 유도 성 또는 다른 신호 전달 경로와 간섭을 해부 용 수 없다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>life technologies</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>life technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365752001</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine</td><td>Polyscienes</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP&amp;nbsp;</td><td>life technologies</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>anti-cleaved PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>anti-actin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

여기에 제시된 기술은 신호 전달 경로의 구성 요소와 상호 작용하는 하나의 표적 단백질, 또는 대안 적 소분자 단계를 분석 할 수있다. 방법을 기반으로 한 손으로, 특정 단백질의 발현 유도에 선택된 시그널링 캐스케이드에서 정의 된 소정의 단계에서의 시그널링 이벤트를 개시한다. 발현 된 목적 단백질의 활성이 얻어지는 신호 전달 경로의 판독에 따라, 상류 측에 위치 또는 개시 시그널링 이벤트의 하류 경우 병용 식 반면에, 관심의 유전자의 후 조사자 평가할 수있다. 여기, 세포 사멸 폭포는 프로토콜의 기능을 보여주기 위해 정의 된 신호 전달 경로로 선정되었다. 이러한 Coxiella burnetii 등의 병원균, 박테리아 세포에서의 생존을 보장하기 위해 숙주 세포에서 숙주 세포 사멸 유도 방해 효과기 단백질을 이동시키다 촉진 그들의유기체의 보급. C. burnetii 효과기 단백질 CaeB 효과적으로 UV 광 또는 스타 우로 스포린과 함께 아폽토시스의 유도 후 숙주 세포 사멸을 억제한다. 단계 CaeB는 세포 사멸 신호의 전파를 방해하는 좁히려, 잘 특성화 프로 - 세포 사멸 활성을 선택 단백질은 독시사이클린 유도 방식으로 일시적으로 발현되었다. CaeB이 단백질의 상류 역할을하는 경우, 세포 사멸은 방해받지 않고 진행됩니다. CaeB 하류 작용하면, 세포 사멸을 억제한다. 선택된 테스트 단백질 주요 집행자 프로테아제 인 미토콘드리아의 레벨, 및 카스파 제 3, Bax의 작용에이었다. CaeB는 Bax의 발현에 의해 유도되는 세포 사멸을 방해,하지만 카스파 제 3 식으로. CaeB, 따라서,이 두 단백질 사이의 사멸 캐스케이드와 상호 작용한다.

먼저, GFP 융합 단백질로서 안정적으로 관심 (CaeB)의 단백질을 발현하는 HEK293 세포주를 확립 하였다. 대조군으로서, 안정적 GFP를 발현 HEK293 세포주는 또한 생성 하였다. 및 GFP-CaeB GFP의 발현은 면역 블롯 분석에 의해 확인되었다. 대표적인 면역 (그림 4A)는 GFP와 GFP - CaeB의 안정적이고 명확하게 검출 식을 보여줍니다. 모든 세포가 GFP 또는 GFP - CaeB을 표현 여부 그러나이 분석은 확인할 수 ...

Watch this Scientific Journal Video about Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling at JoVE.com

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K 조회수.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

비디오: Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

연구

유전학

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

면역학 및 감염병학

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

리슈마니아증 치료를 위한 테트라사이클린 제어 합성 회로 설계

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a step toward therapeutic intervention targeting host-associated factors that drive leishmaniasis. Synthetic biology entails the engineering of genetic components in an orthogonal and modular manner to precisely modulate biological systems, imparting novel functions to cells. In the presented study, elucidation of a systematic pipeline for the development of an inducible tetracycline-controlled (TetON)-based synthetic circuit was aimed at delivering succinate dehydrogenase as a therapeutic agent to facilitate the elimination of intracellular Leishmania parasites. The outlined protocol describes the designing of a synthetic circuit and its subsequent validation. The proposed strategy also concentrates on the incorporation of synthetic circuits in the plasmid backbone as a delivery vehicle. Additionally, delivery machinery employing polyplexes-based nano-particles for the delivery of synthetic circuits was used in murine macrophage cell lines without compromising the cellular morphology. Standardization of the method was conducted for selecting transfected cells and determining optimal induction concentration for synthetic circuit expression. Observations reveal a distinct reduction in intracellular parasite burden in transfected cells compared to infected cells. Pro-inflammatory cytokines were expressed post-infection in synthetic circuit transfected and induced cells as a mechanism to promote parasite elimination. This underscores the synthetic biology-based method as a potent approach in leishmaniasis by targeting host factors associated with disease progression.

저자 스포트라이트: 리슈마니아 주요 감염에서 혁신적인 치료법을 위한 시스템 및 합성 생물학 활용

Here, a protocol for designing, constructing, and delivering tetracycline-controlled based inducible synthetic circuit is presented. The effect of the synthetic circuits on parasite elimination and cytokine expression can be studied by channelizing the presented pipeline. This protocol is relevant for researchers studying synthetic circuit-based therapeutics in infectious diseases.

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

생체공학

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템