Biz yardım için CIBIO (Trento Üniversitesi) ve CNR Nörobilim Enstitüsü idari personeline teşekkür etmek istiyorum. Giovanni Veronesi Provenzano Fondazione (Milan, İtalya) doktora sonrası bursu ile desteklenmektedir. Bu eser İtalyan Üniversitesi Bakanlığı ve Araştırma (PRIN 2008 hibe # YB ile 200894SYW2_002 ve PRIN 2010-2011 hibe # 2010N8PBAA_002), Trento Üniversitesi (YB için CIBIO start-up hibe) ve Telefon Kurumu (hibe # GGP13034 tarafından finanse edildi YB).

Tüm deneyler Avrupa Topluluğu Direktifi 2010/63 / AB ile uyumlu yapılmıştır ve İtalyan Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan Bakımı, Konut ve Tedavisi <ol><li> İlgili kurum hayvan bakım yönergelerine uygun olarak fareleri kullanarak tüm deneysel protokolleri gerçekleştirin. </li><li> Yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde hayvanları korumak. </li><li> Ev talaş ve yatak malzemesi ile standart boyutlu polikarbonat fare kafeslerinde 2-4 gruplar, fareler haftada değişti. </li><li> Hastalığa yatkınlık nörogelişimsel bozuklukların farklı fare modellerinde yaş ve cinsiyet ile değişebilir, çünkü yaş ve cinsiyet uyumlu fareler kullanın. </li><li> Istatistiksel olarak anlamlı (davranışsal çalışma için genotip başına 10 fare ve immünohistokimya deney için genotip için 4 farelik bir minimum) ulaşmak için hayvan uygun sayıda seçin. </li></ol> 2. Morris Water Maze (MWM) <ol><li> Bir Genelge Tank (çapı 100 cm, yüksekliği 50 cm) kullanın. <ol><li> Tankın etrafına oda bölücüler bazı görsel ipuçları yerleştirin. </li><li> Dört hayali kadranın birinin merkezinde sabit bir yerde tankın içine 10 cm çapında bir platform yerleştirin. Tüm eğitim oturumlarında tüm çalışmalar için aynı kadranda gizli platformu tutun. </li><li> Platform su yüzeyinden 1 cm kadar musluk suyu ile havuz doldurun. Dengelenmesi su sıcaklığı 22 ° C&#39;ye yakın olmalıdır; Bu adımı birkaç saat sürebilir. Su sıcaklığını dengeye için gereken süreyi kısaltmak için, sıcak su eklenir. </li><li> Su opak hale getirmek için beyaz, toksik olmayan boya yaklaşık 1.5-2 L ekleyin. </li></ol></li><li> Parça Toplama İşlemi <ol><li> Standart CCD kamera ve video kurulları ile MWm adlı izleme sistemi kurun. Böyle yol uzunluğu gibi çeşitli değişkenler izlemek ve analiz etmek için bir video izleme sistemi seçin escape gecikme ve zaman her kadranda geçirdi. </li><li> Dört kadranda arenada bölün ve canlı izleme hayvanlar ve arka plan arasındaki optimum kontrast sağlamak için algılama ayarlarını. </li><li> Platform bölgeyi belirtin. </li><li> 60 sn maksimum deneme süresini ayarlayın. </li></ol></li><li> MWM Testi <ol><li> Davranış testleri öncesinde, farelere onlar havuz ya da mekansal ipuçları göremiyorum bir alanda 20-25 dakikalık bir adaptasyon dönemi sağlar. </li><li> (Aralarında 20-30 dk aralıklarla, günde iki ardışık denemeler) 9 gün boyunca her fare eğitin. </li><li> Bilgisayar ve fotoğraf makinesini açın ve video izleme sistemi yazılımını başlatmak. </li><li> Kendi kuyruğundan fare atın ve baş dört başlangıç ​​pozisyonları (kuzey, güney, doğu, batı) birinden başlayarak, havuz tarafına doğru işaret ile, suya koyun. Her fare için, başlama pozisyonu ve farklı çalışmalar boyunca pseudorandomized olmalıdır. </li><li> Fare yüzmek edelim ve platf arama60 saniyelik bir süre için biçiminde olabilecektir. Hayvan platformu ulaştığında, 20 saniye platformda kalmak için izin verir. </li><li> Fare bu süre içinde platformu bulmak için başarısız olursa, nazikçe kuyruğunu tutarak, platforma fare rehberlik ve 20 saniye boyunca orada kalmak için izin verin. Hayvan hepsi iki denemeler tamamlandıktan sonra, bir havlu ile kurulayın ve kafes içine geri koymak. </li><li> Eğitim süresinin her gün, aynı prosedürü (adımları 2.3.4-2.3.6) tekrarlayın. </li><li> Geçen eğitim iz gün sonra 9 prob testi yapın. </li><li> Havuzdan platformu çıkarın. </li><li> Fare yüzmek edelim ve 60 saniye maksimum platformu için arayın. </li><li> Periyodik olarak, aynı (22 ° C) olmalıdır, böylece su sıcaklığını kontrol edin ve havuz temizlemek. </li></ol></li></ol> Perfüze Animals Bölüm 3. hazırlanması <ol><li> MWM sonunda fareler kurban. Genotip başına dört fare euthaniz öncesinde anestezi gerekiryerel ve uluslararası kılavuzlara göre Ation. </li><li> (Kanama izin vermek için bir makas auriclewith doğru kesilir ve serpmek için sol ventrikül içine, bir kelebek kanül tanıtmak) transkardiyal hayvan serpmek 10-15 PBS içinde% 4 paraformaldehid, ardından fosfat tamponlu tuzlu su, 4-5 dakika boyunca (PBS) ile dk 22. </li><li> Inceleyin ve en az 12 saat süre ile 4 ° C &#39;de% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası sabitleyin. </li><li> Dilimleme için gerekli olana değin 4 ° C&#39;de 15 0.1 M PBS,% 0.02 sodyum azid ilave edildi ve deposu ihtiva eden 50 ml polistiren konik tüplerde beyinleri yerleştirin. </li><li> Kes ve vibratome kesme önce beyincik çıkarın. </li><li> Vibratome sahibi plaka üzerine, yapıştırıcı kullanarak, kesme site beyin dik Tutkal. </li><li> Uygun vibratome üzerine, dorsal hipokampusun boyunca seri sırayla, 20-40 mikron kalınlığında koronal bölüme beyin kesin. </li><li> Bir boya fırçası ile vibratome dilim toplayın ve 2 aktarmakHer bir kuyu için 0.1 M PBS içinde 1 ml ihtiva eden 4, çok-yuvalı plaka. </li><li> 4 ºC PBS içinde% 0.02 Sodyum Azid içinde PBS içinde kısa vadede veya uzun vadede mağaza bölümleri (doku kadar bir yıl süreyle kullanılmış olabilir). </li></ol> 4. İmmünhistokimya <ol><li> Aktarım her bir kuyu için, 0.1 M 500 ul PBS içeren 24 çok oyuklu bir plakaya her bir fare için 3-5 dorsal hipokamp bölümleri. </li><li> 0.1 M PBS içinde 500 ul (5 dakika, hafifçe çalkalanarak 3 kez) ile her yuva içinde yer alan bölümleri yıkayın. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 20 dakika boyunca PBS içinde% 1 H2 O 2 bölümleri inkübe edilerek, bir endojen peroksidaz etkinliğini Quench. </li><li> Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın. </li><li> Doku geçirgenliği: PBS içinde% 0.2 Triton X-100, 5 dakika için bölümler inkübe edin. </li><li> Yukarıdaki adımlarda (4.4; 4.5) içinde, (numbe tüm deney için yeterli engelleme tamponu (PBS içinde% 10 keçi serumu ve% 0.1 Triton-X100) yapmakbölümlerin R x 100 ul x 3 adım). </li><li> Not: (biyotine konjüge edilmiştir), ikincil antikor yapıldığı aynı türden kullanımlar serumu. </li><li> Hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat süre ile tampon (100 ul / bölümü) engelleme bölümleri inkübe edilerek spesifik olmayan antikorun bağlanmasını önler. </li><li> Hafifçe çalkalama ile, gece boyunca 4 ° C &#39;de, bloke edici tampon içinde seyreltilmiş primer Ab (pERK) bölümleri inkübe edin. </li><li> Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın. </li><li> Hafifçe çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat için (adım 4.6 de kullanılan aynı) blokaj tamponunda seyreltilmiş: biyotin (250 1) ile konjüge edilmiş sekonder Ab kuluçkalayın. </li><li> Avidin ve biyotin kompleksi, oda sıcaklığında en az 30 dakika gerektirir, çünkü, aynı zamanda, ABC reaktifi hazırlayın. </li><li> Üreticilerin protokole göre ABC reaktifi gerekli hacmi hazırlayın. </li><li> Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın. </li><li> IncubatABC reaktifi ile oda sıcaklığında 45 dakika boyunca E bölümleri. </li><li> Yumuşak çalkalama ile (3 x 5 dk) ile, 0.1 M PBS bölümleri yıkayın. </li><li> DAB çözümü çalışma hazırlayın DAB karsinojenik ve teratojenik olduğu gibi, DAB içeren her adımda davlumbaz yapılmalıdır. </li><li> Plastik bir transfer pipet yeni bir plaka DAB çözüm aktarın. </li><li> Elle çözüm ve yavaş yavaş girdap plaka çalışma DAB içeren plaka yerleştirin bölümleri, bölümlere maksimum etkiyi sağlamak için. </li><li> Yeterli sinyal gelişene kadar mikroskop DAB reaksiyonu (2-5 dk) izleyin. </li><li> 0.1 M PBS (3 x 5 dk) doku yıkanarak istenen renk yoğunluğuna reaksiyonu durdurun. </li><li> Gecede davlumbaz kalan DAB substrat solüsyonu devre dışı bırakmak ve laboratuvar kurallarına göre onu imha etmek için çamaşır suyu kullanın. </li><li> Jelatin Mount bölümler PBS yüzen slaytlar kaplı. Sonra oda sıcaklığı en az 3-4 saat sonra kurutun. </li><li> % 50 kısımları, kurutmak,% 70,% 95% 100 2 dakika her biri için etanol ve 5 dakika için% 100 ksilen açık ve. </li><li> Montaj orta kullanarak lamel ve gece boyunca kurumaya davlumbaz bırakın. </li></ol> 5. Hücre Sayısı <ol><li> Sayım pERK-pozitif hücreler, dorsal hipokamp seviyesinde 3-5 bölümler hayvan başına analiz edilmelidir. </li><li> Uygun bir mikroskop kullanılarak 200X büyütmede her bölüm birden fazla parlak alan görüntüler elde, ve daha sonra bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bunları bir araya. </li><li> ImageJ özgür yazılım kullanarak tiff-dönüştürülmüş mozaik görüntülerde hücre sayımı gerçekleştirin. </li><li> 100 × 100 um her 2-3 sayma kutuları üzerinde hilus ve granül hücre tabakasında pERK lekeli hücreleri saymak. </li><li> Hücre yoğunlukları sayma penceresi (100 x 100 um) ortalama işaretli hücrelerin sayısı olarak ifade edilecektir. </li><li> Genotipleri arasında anlamlı farklılık değerlendirmek için istatistiksel analiz gerçekleştirin. Bu Öğrenci t yapılabilirTest veya ANOVA ticari yazılımları kullanarak uygun post hoc testi ile izledi. P &lt;0.05 Set istatistiksel anlamlılık düzeyi. </li></ol>

<ol>
	<li>Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+neurodevelopmental+disorders+in+adulthood.">Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).</li><li>Ehninger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+learning+deficits+in+a+Tsc2+/-+mouse+model+of+tuberous+sclerosis.">Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis.</a> Nature medicine. 14, 843-848 (2008).</li><li>West, A. E., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-regulated+gene+transcription+in+synapse+development+and+cognitive+function.">Neuronal activity-regulated gene transcription in synapse development and cognitive function.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 3, (2011).</li><li>Goorden, S. M., van Woerden, G. M., van der Weerd, L., Cheadle, J. P., Elgersma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+deficits+in+Tsc1+/-+mice+in+the+absence+of+cerebral+lesions+and+seizures.">Cognitive deficits in Tsc1+/- mice in the absence of cerebral lesions and seizures.</a> Annals of neurology. 62, 648-655 (2007).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromin+regulation+of+ERK+signaling+modulates+GABA+release+and+learning.">Neurofibromin regulation of ERK signaling modulates GABA release and learning.</a> Cell. 135, 549-560 (2008).</li><li>Brielmaier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autism-relevant+social+abnormalities+and+cognitive+deficits+in+engrailed-2+knockout+mice.">Autism-relevant social abnormalities and cognitive deficits in engrailed-2 knockout mice.</a> PloS one. 7, e40914 (2012).</li><li>Provenzano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+dysregulation+of+neurofibromin-dependent+pathways+is+associated+with+impaired+spatial+learning+in+engrailed+2+knock-out+mice.">Hippocampal dysregulation of neurofibromin-dependent pathways is associated with impaired spatial learning in engrailed 2 knock-out mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 13281-13288 (2014).</li><li>Morgan, J. I., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-transcription+coupling+in+neurons:+role+of+cellular+immediate-early+genes.">Stimulus-transcription coupling in neurons: role of cellular immediate-early genes.</a> Trends in neurosciences. 12, 459-462 (1989).</li><li>Steward, O., Schuman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+at+synaptic+sites+on+dendrites.">Protein synthesis at synaptic sites on dendrites.</a> Annual review of neuroscience. 24, 299-325 (2001).</li><li>Gutmann, D. H., Parada, L. F., Silva, A. J., Ratner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofibromatosis+type+1:+modeling+CNS+dysfunction.">Neurofibromatosis type 1: modeling CNS dysfunction.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14087-14093 (2012).</li><li>Costa, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+for+the+learning+deficits+in+a+mouse+model+of+neurofibromatosis+type+1.">Mechanism for the learning deficits in a mouse model of neurofibromatosis type 1.</a> Nature. 415, 526-530 (2002).</li><li>Silva, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+learning+and+memory+deficits+associated+with+neurofibromatosis+type.">A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type.</a> I. Nature. 15, 281-284 (1997).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297, 681-683 (1982).</li><li>Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+increases+cell+proliferation+and+neurogenesis+in+the+adult+mouse+dentate+gyrus.">Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus.</a> Nature. 2, 266-270 (1999).</li><li>Adams, J. P., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+psychology:+roles+for+the+ERK+MAP+kinase+cascade+in+memory.">Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).</li><li>Di Cristo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+ERK+activation+for+visual+cortical+plasticity.">Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity.</a> Science. 292, 2337-2340 (2001).</li><li>Satoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK2+contributes+to+the+control+of+social+behaviors+in+mice.">ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+GABAergic+neurons+in+the+hippocampus+and+cerebral+cortex+of+Engrailed-2+null+mutant+mice:+implications+for+autism+spectrum+disorders.">Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders.</a> Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+in+engrailed-2+mutant+mice+reveals+common+molecular+pathways+associated+with+autism+spectrum+disorders.">Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders.</a> Molecular autism. 4, 51 (2013).</li><li>Cheh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En2+knockout+mice+display+neurobehavioral+and+neurochemical+alterations+relevant+to+autism+spectrum+disorder.">En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder.</a> Brain research. 1116, 166-176 (2006).</li><li>Dawson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+broader+phenotype+of+autism:+genetic,+brain,+and+behavioral+perspectives.">Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives.</a> Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).</li><li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+Most+Sensitive+Measure+of+Water+Maze+Probe+Test+Performance.">What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance.</a> Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).</li><li>Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning:+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc,+c-fos+and+zif268.">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

/ - - Fareler, nörogelişimsel bozuklukların fare modelini Burada, biz nöronal en2 içinde MWm aşağıdaki aktivasyon ifşa ettiği için bir pERK immünhistokimya protokol sağlar. / - - PERK düzeylerinin azalması en2 CA3 subfield tespit edilmiştir mutantlar WT ile karşılaştırıldığında. Farklı CA3 alt alanına, pERK pozitif nöronlarının genel bir artış gözlenen ne yerine iki hilus saptanmış ve EN2 bölgesinin GCL - / - fareler WT ile karşılaştırıldığında....

Nörogelişimsel bozukluklar gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gelişmesi ve olgunlaşması sırasında erken rahatsız olduğu Down sendromu, frajil X sendromu (FXS), Rett sendromu, nörofibromatozis, yumrulu skleroz ve ASD gibi hastalıkların geniş ve heterojen bir grup içerir Prenatal dönem 1. Bu gelişimsel beyin işlev bozuklukları motor fonksiyon, dil, öğrenme ve bellek süreci üzerinde derin, yaşam boyu etkilere neden olabilir. Genetik ve çevresel faktörlerin bir bolluk son yıllarda 2,3 sırasında nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde suçlanmıştır. Klinik fenotip altında yatan moleküler mekanizmalar halen bilinmemektedir bile, yukarıda belirtilen bulgular, bu hastalıkların birkaç fare modellerinin geliştirilmesi sağladı. Öğrenme ve hafıza noksanlıkları gibi +/- tsc1 +/-, TSC2 olarak, bu fare modellerinde bir dizi tespit edilmiştir,NF1 +/- ve En2 - / - fareler 2,4-7. Nörogelişimsel bozuklukların alanında önemli bir zorluk hücresel ve moleküler süreçler bellek yatan ve disfonksiyonu öğrenme belirlenmesidir. Öğrenme ve bellek sırasında aktive Seçilen sinyal yolları spesifik genlerin transkripsiyonunu neden ve sonuç olarak de novo protein sentezinin yol açabilir. Hemen-Erken genler, (bacakları) aktivasyonu ve protein bağımlı sinaptik değişiklikler hızla nöronal aktivite ve davranışsal eğitim 8,9 yanıt olarak beyin nöronlarının indüklenir. Nörofibromin içeren sinyal yolları içinde Açıkları nörogelişimsel bozukluklarda bozulmuş öğrenme ile ilişkili bulunmuştur. Nörofibromin olan mutasyon nörofibromatozis tip 1, karmaşık genetik sendrom sinir sistemi tümörleri, davranışsal ve motor gecikme ve bilişsel DISA ile karakterizedir neden olur NF1 geninin ürünüdürhastanın talimatları 10. Önleyici nöronlarla sınırlı NF1 silinmesi için heterozigoz olan fare, MWM 5,11,12 uzun süreli potansiyasyon erken faz (LTP), hem de tehlikeye uzamsal öğrenme eksiklikler göstermektedir. İlginç olarak, bu fare modelinde NF1 eksikliği artan ERK fosforilasyonu ve son olarak bu nöronların 5 GABA serbest anormal bir artışa yol açar, öğrenme sırasında inhibitör Ras sinyallemesinin bir aşırı aktivasyonuna yol açar. Bu bulgulara dayanarak, davranış görevler sonrasında nöronal aktivitenin görselleştirme nörogelişimsel hastalıklarda rol oynayan spesifik devreleri yeniden bir yol gösterir. Burada açıklanan immünohistokimyası protokolü değerlendirmek ve bilişsel bozukluklar ile ASD fare modelinde MWm aşağıdaki hipokampal ERK fosforilasyon düzeylerini ölçmek hedefliyor. MWM yaygın kemirgenler 13,14 hipokampal bağımlı uzaysal öğrenme ve hafıza araştırmak için kullanılır </s&gt; yedekleyin. Biz ERK öğrenme ve bellek oluşumu 15 önemli bir role sahip olduğu gösterilmiştir beri görev bağımlı hipokampal öğrenme moleküler okuma olarak ERK fosforilasyonu kullanmaya karar. Ayrıca, ERK yolu, geliştirme, görsel korteks 16 deneyime bağlı plastisite için gereklidir. Son olarak, MSS gösteride iki ERK izoformu (ERK2) birini eksik fareler ERK sinyal gibi ASD olarak nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde kritik bir rol oynayabileceğini belirten, bilişsel, duygusal ve sosyal davranışlar 17 anomalileri kutladı. Nöro hastalıklar açısından bir model olarak farenin (- / - En2) Biz Engrailed 2 nakavt kullanılır. En2 - / - fareler ön beyin internöronlar 18 kaybı dahil anatomik ve davranışsal &quot;ASD gibi&quot; özellikleri, ASD-ilişkili genlerin 19 azaltılmış ifade göstermek, sosyallik azaldığı ve bozulmuş bilişsel esneklik 6,7,20. Mekansal Learning ve MWM tespit edilenler gibi hafıza kusurları, EN2 ​​özellikle sağlam - / - fareler 6,7 ve ASD hastalarında 21 gözlenen bilişsel bozukluklar ile ilgili olabilir. - / - Yetişkin farelerde 7 Ayrıca, MWM bozulmuş normal süreçlerde indirgenmiş nörofibromin ekspresyonu ile bağlantılı ve EN2 arasında hilusunda pERK düzeylerinde artış olduğunu göstermiştir. İşte biz bu ASD fare modelinde MWm aşağıdaki pERK immunohistokimyasal karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EthoVision XT 8</td>
			<td>Noldus Information Technology</td>
			<td></td>
			<td>This software platform is not a requirement &#8211; there are many other behavioral softwares on the market.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempera Paint</td>
			<td>Giotto - Fila Group Company</td>
			<td></td>
			<td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>Equivalent models from other companies can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66004-950</td>
			<td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit Vectastain&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>Dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Slides&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>317616</td>
			<td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss&#160;</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Equivalent microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot 11.0</td>
			<td>Systat Software Inc. (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

Fosforile ekstraselüler regüle kinaz (pERK) uyarılması öğrenme bağımlı nöronal aktivasyon güvenilir bir moleküler okuma olduğunu. Burada, biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için pERK immünhistokimya protokol açıklar. Fareler, otizm spektrum bozuklukları modeli (ASD) Özellikle, Morris su labirenti Engrailed-2 nakavt (MWM, klasik hipokampus bağımlı öğrenme görev) - (- / En2) aşağıdaki nöronal aktivasyon incelemek için pERK immün kullanılır. Vahşi tip (WT) kontrol ile karşılaştırıldığında, En2 - / - fareler MWM önemli uzamsal öğrenme yetersizlik göstermiştir. WT hayvanlara kıyasla, farelerin - / - MWM sonra, pERK pozitif nöronların sayısında anlamlı bir fark, belirli hipokampal EN2 bölgesinin alt alanlarında tespit edilmiştir. Böylece, bizim protokol sağlam farklılıkları tespit edebilirASD bir fare modelinde hipokampus bağımlı öğrenme bozukluğu ile ilişkili pERK-pozitif nöronlar. Daha genel olarak, protokol bilişsel bozukluklar ile karakterize edici özelliği, her iki genetik ya da farmakolojik fare modellerinde hipokampal nöron aktivasyon profilini araştırmak için uygulanabilir.

Burada açıklanan protokol imünohistokimya ile, görselleştirmek için tasarlanmıştır, nöro bozuklukların bir fare modelinde MWM sonra hipokampal nöron aktivitesi belirli bir markör ifade. Burada gösterilen tüm deneysel veriler bizim son işten 7 alınmıştır. Erkek ve kadın WT ve En2 - / - (3-5 aylık; ağırlık = 25-35 gr) yaştaki erişkin litermatlarının heterozigot çiftleşmelerin elde kullanılmıştır. Yirmi iki fareleri (genotip için 11) MWM kullanılmıştır. Sekiz fa...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders at JoVE.com

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir.

Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

immunohistochemical-visualization-hippocampal-neuron-activity-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Görüntüleme.  University of Trento.  Biz nörogelişimsel kökenli bilişsel bozuklukların ile karakterize bir fare modelinde bir mekansal öğrenme göreve maruz kaldıktan sonra hipokampal nöron aktivasyonu profilini incelemek için bir immünohistokimya protokol açıklar. Bu protokol bilişsel karakterize hem genetik ya da farmakolojik fare modellerine uygulanabilir. 

Video: Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Nörobilim

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

Mekansal Navigasyon Öğrenme Eğitim için Infrared Spektroskopisi civarında MazeSuite ve Fonksiyonel kullanma

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</emMekansal Bellek Test sırasında&gt; mikrodivaliz

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

Nörodejeneratif Hastalıkların bir Drosophila Modelinde Tırmanma Kusur Kantitatif Analiz

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

Fare Hipokampal Astrositler Seks Farkları sonra<em&gt; In-Vitro</em&gt; İskemi

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

Küçük pul pul Sürüngenler Mekansal Öğrenme ve Bellek değerlendirilmesi

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

Hipokampal disfonksiyon Fetal alkol spektrum bozuklukları, fare modeli değerlendirmek için izleme Eyeblink Klasik koşullanma kullanımı

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.