Name: simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays at JoVE.com

The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Not: Bu protokol için damlacıkları mevcut ticari damlacık makinesi 23,29 oluşturulabilir gibi mikroakışkan cihaz imalatı, Bu deney için gerekli değildir. 1. Damlacık oluşturan mikroakışkan Aygıt olun <ol><li> SU-8 Master Fabrikasyon protokolü ile kanallar için ana kalıp hazırlayın önce 31 özetlenen, ama bir damlacık jeneratör maske deseni 32. </li><li> Yumuşak litografi 32,33 tekniklerini kullanarak PDMS cihazları imal. </li></ol> 2. Dökme Damlacık Göstergesi için reaksiyon Mix hazırlayın Not: protokol amplifikasyon reaksiyonlarında pek çok türleri kullanılarak nükleik asitleri ölçmek için kullanılabilir. Bir örnek olarak, çok sayıda Lambda DNA konsantrasyonları MDA için gerekli reaktif verilmiştir. Reaktif ayrıntıları Belirli Reaktifler Tablo listelenmiştir. Damlacıkları içinde şablon dağılımı sufficien bağlıdırNumunenin t karışımı. <ol><li> Elde veya Arındırmak Phi29 DNA polimeraz. <ol><li> Daha önce tedarikçiden 7 veya satın açıklandığı gibi Phi29 arındırın. Gösterilen deneyleri için kullanılan Phi29 saflaştırılmıştır. </li></ol></li><li> 65 mM KOH, 1.65 mM EDTA ve 14 mM DTT içeren denatürasyonu Tamponu 10 ml hazırlayın. </li><li> 65 mM HCI, 0.21 M Tris-Cl pH 7.0 ve 9 mM Tris-CI, pH 8,0 içeren Nötralizasyon Tamponu 10 ml hazırlayın. </li><li> Böyle nükleaz içermeyen su gibi iki standartları, kimse şablon kontrolü (NTC) ve bir yüksek şablon konsantrasyonu (4 pg / etrafında ul Lambda DNA) hazırlayın. Bir qPCR tüpünde Denatürasyon Tampon 3.3 ul her standardın 3.3 ul denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Nötralizasyon Tamponu 3,3 uL her söndürün. </li><li> Bir qPCR tüpünde Denatürasyon Tampon 3.3 ul ilgi şablonun 3.3 ul denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 3,3 ul söndürünNötralizasyon Buffer. </li><li> Buz üzerinde örnek başına usta karışımı 11 ul hazırlayın. 2x MDA Reaksiyon karışımı, ana 2x çift-şeritli DNA oluşur (dsDNA) bağlanma, boya, 2x qPCR referans boya, 50 uM randomize oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 4.8 mM dNTP, nükleaz içermeyen su ve 40 ug / ml Phi29 DNA polimerazı. Iyi 7.5.Mix daha pH seviyelerinin daha yüksek veya daha düşük karşılaşmak değil polimeraz sağlamak için son Phi29 DNA polimeraz ekleyin. </li><li> İsteğe bağlı: Daha az yanlış pozitif için önce damlacıklar 34 oluşturan UV ışığı ile ana karışımı maruz. <ol><li> Buz üzerinde 0,5 ml veya 1.5 ml saydam bir tüp içinde örnek başına ön karışımın 10 ul hazırlayın. Ön-karışım 55 uM randomize oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 5.3 mM dNTP ve nükleaz içermeyen su oluşur. </li><li> 34 tarif edildiği gibi buz su tüp yerleştirilir ve bir akü, UV ışığı (254 nm) maruz5.7 J formüle edilmiş dozu / cm 2. </li><li> Ön karışım içinde bulunan 40 ug / ml dsDNA bağlayıcı 1x boya, 1x referans boya ve Phi29 ekleyin. İyice karıştır. </li></ol></li><li> Denatüre şablon veya standart 10 ul ve master karışımı 10 ul birleştirin. İyice karıştır. </li></ol> 3. Damlacık Oluşumu Not: damlacıklar statik elektrik ve kayma gerilmesi çok hassas olabilir. Statik elektrik neden olabilecek giysiler çıkarın ve damlacıklar oluşturan önce kendinizi topraklayın. Mümkün olduğu kadar emülsiyondan, tüpün üstünden emülsiyon tüpleri tutun. Pipet emülsiyonlar çok yavaş, tercihen geniş delik pipet ucuyla. Bir pipet gelen dağıtım yaparken, pipet hızını belirlemek için uç tarafında emülsiyonu izleyebilirsiniz. <ol><li> Form damlacıkları. Deneyler göstermiştir için, mikroakışkan cihaz, bir yağ girişi ve damlacıklar üretmek için bir akış odaklama kavşağın iki sulu girişleri vardır. İki syri kullanınNGE 20.000 1 nl damlacıklar oluşturmak için mikroakışkan çip sayesinde yüzey aktif madde ile bir yağ 55 ul ve reaksiyon karışımı bir 20 ul akış hızlarını kontrol etmek pompalar. </li><li> Bu yüzey aktif madde ile birlikte bir yağ, çok çeşitli olan damlacıkları üretmek mümkündür, ama bileşim, büyük ölçüde, yüksek sıcaklıklarda ve zaman içinde damlacık stabilitesini etkiler: edin. Olası bir kombinasyonu anyonik bir yüzey aktif 19,35 florlu yağ HFE 7500. </li><li> Herhangi bir yöntem 13,36 ile herhangi bir boyutta damlacıklar üretmek ama damlacık popülasyonda boyut farklılaşabilirliği dökme floresan ve bu nedenle tahlilin hassasiyetini etkileyecektir. Gösterilen deneylerde, damlalar 1 nl bir hacimde tek dağılımlı idi. </li><li> PCR tüpleri içine ve sıvı yağ toplayın. Her bir örnek için, kısım 30, optik kapaklar taze PCR tüpleri içine petrol ul ve yağ üstünde damlacıklar 20 ul transfer. Tutarlı hacimleri tahlil ac olarak sağlamakmümkün papaz. </li><li> Yakın tüp gevşek kapakları petrol buharlaşmasına izin verecek şekilde, sıkıca kapakları. </li></ol> 4. İzotermal Büyütme <ol><li> PCR thermocycler, qPCR PCR, ya da sıcak plaka kullanılarak, 7 saat süre ile 30 ° C&#39;de inkübe örnekleri ve 75 ° C&#39;de 1 dakika süre ile etkisiz hale getirirler. Damlacıkların borular bu noktada bir kaç saat için folyo ile kaplı bir buzdolabı bırakılabilir. </li></ol> 5. Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Hemen qPCR thermocycler kullanan tüm numuneler için boya flüoresan seviyelerini ölçmek reaksiyon inaktivasyonunu takip. Optimal filtre ayarlarını boya uyarma ve emisyon spektrumları bağlıdır. Bu örnek için, dsDNA bağlayıcı boya için ayarlanmış 492 nm-516 nm filtre ve referans boya için ayarlanmış 585 nm-610 nm filtre kullanın. Diğer floresan ölçüm teknikleri floresan ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Her numune için, tarafından dsDNA bağlayıcı boya floresan yoğunluğu bölmekReferans boyanın flüoresan yoğunluğu. Tüm örneklerden arka plan floresan veya hiçbir şablon kontrolü normalize floresan, çıkarma. </li><li> Standartlardan düzeltilmiş floresan ölçümleri kullanarak doğrusal bir standart eğri oluşturun. NTC standart% 0 floresan damlacıklarıyla bir örnek için floresan (&quot;Tüm negatif&quot;) temsil eder ve yüksek şablon konsantrasyonu floresan ölçümü% 100 floresan damlacıklarıyla bir örnek için beklenen floresan (&quot;tüm pozitif&quot;) &#39;dir. Karşılık gelen standart eğri kullanılarak, bunların yığın floresan göre pozitif ve negatif damlacıkların ara oranları tahmin. </li></ol> 6. Üretim Damlacıklar Proof-of-İlke Ölçümleri için <ol><li> Floresan (pozitif) damlalar sağlayın: 0,1 ng Lambda DNA, 1 x dsDNA bağlayıcı boya, 1 x referans boya, 1.5 birim Taq DNA polimeraz, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1,5 m aşağıdakilerden oluşan bir PCR reaksiyon karışımı hazırlamakM MgCI2, 0.2 mM dNTP ve 0.5 uM primer. Karışım yukanda açıklandığı gibi 30 kat (20 saniye, 20 saniye, 1 dakika için 72 ° C, 55 ° C, 95 ° C) Thermocycle, daha sonra damlacıklar oluşturur. </li><li> Floresan olmayan (negatif) damlalar sağlayın: 1x dsDNA bağlayıcı boyasından oluşan bir PCR reaksiyon karışımı hazırlandı, 1 x referans boya, 1.5 birim Taq DNA polimeraz, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 0.2 mM dNTP, ve 0.5 uM primer. Karışım 30 kez (20 saniye için 95 ° C, 20 saniye, 1 dakika süre ile 72 ° C&#39;de 55 ° C), daha sonra damlacıklar oluşturmak Thermocycle. </li><li> Ön karışımlı damlacık oranları Şekillendirme <ol><li> QPCR tüpler içine florlu yağı 20 ul dağıtın, buharlaşmayı önlemek için bir optik kapakla örtün. </li><li> Petrol üstündeki olumsuz oranları: yavaşça istenen olumlu iyi karıştırılmış damlacıkların 10 ul pipetle. Gösterilen sonuçlar, pozitif: negatif oranlarının 1 damla (tüm pozitif), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 ve 0 (bütün neg edildiative). </li></ol></li><li> QPCR thermocycler kullanan tüm numuneler için boya flüoresan seviyeleri ölçülür. Bu protokol için, dsDNA bağlayıcı boya için belirlenen 492 nm-516 nm filtresi ve referans boya için belirlenen 585 nm-610 nm filtresi kullanın. <ol><li> DsDNA referans boya floresan kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. Dahası &quot;tüm pozitif&quot; örnek floresan normalleştirmek. </li></ol></li><li> &quot;Tüm pozitif&quot; ve &quot;negatif&quot; örneklerinden normalize floresan ölçümleri kullanarak doğrusal bir standart eğri oluşturun. Karşılık gelen standart eğri kullanılarak, bunların yığın floresan göre pozitif ve negatif damlacıkların ara oranları tahmin. </li><li> Her oran (n = 3) bağımsız bir damlacık oluşumu ve her bir deney için karıştırılarak deneyi tekrarlayın. </li></ol> 7. Proof-of-Prensibi MDA Deneyi <ol><li> Bir spec ile Lambda DNA stok çözeltisi konsantrasyonunu ölçmektrophotometer. <ol><li> Damlacık ortalama 10 şablon molekülleri gerekli şablon konsantrasyonu hesaplayın. Bu protokol için damlacık hacimleri 1 nl ve Lambda DNA 1 ng yaklaşık 1.9 x 10 7 kopyasını içerir varsayıyorum. Bu nedenle, damlacık başına 10 şablonları nl başına 10 kopya ya da ul başına 526 fg Lambda DNA olacaktır. Damlacıklar oluşacak zaman şablonu, bu nedenle, ilk üst şablon konsantrasyonu / ml 3,2 pg olacak ~ 6x seyreltilmiş olacaktır. </li></ol></li><li> Seri olarak denatürasyon tampon ve eşit hacimde Nötralizasyon Tamponu ile 3,2 ug / ul DNA Lambda seyreltin. 0.1 bir seyreltme faktörü için, Denatürasyon Tamponu 45 ul 10 ul örnek birleştirmek ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Nötralizasyon Tampon 45 İL gidermek için ekleyin. </li><li> Deney için numune kalanını yapmak için adım 7.2 anlatıldığı gibi daha ileri örneği sulandırmak. Gösterilen reaksiyonlarda, ilk şablon konsantrasyonları, 3.2 pg, 320 fg edildi160 fg, 32 fg, 16 fg, 3.2 fg ve mikrolitre başına 1.6 fg. Not: master karışım ilave edildikten sonra son şablon konsantrasyonları 526 fg vardı, 52.6 fg, 26.3 fg, 5.26 fg, mikrolitre başına 2.63 fg, 526 ag ve 263 ag. Sırasıyla, damlacık başına 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ve 0.005 beklenen Lambda kopyalar. </li><li> Oluşturmak ve adımları 2,5-5,3 tarif edildiği gibi, her örnekten damlacıklar analiz eder. </li><li> Bir dijital fotoğraf makinesi kullanan gösterilen floresan görüntüleri (Şekil 2,3) oda sıcaklığında bir 10x amacı ile bir epi-floresan mikroskop monte edinin. Her numune için görüş oniki alanları edinin. Bir floresan slayt ile elde edilen bir arka plan görüntüsü ile doğru floresan görüntüler. </li><li> Emülsiyon yağı çabuk buharlaşır gibi görüntüleme 37 için bir yer odasına kullanın. </li><li> Bir ImageJ makro (Ek kod dosyası) kullanarak bireysel damlacık yoğunluklarını analiz edin. <ol><li> En iyi N floresan olmayan damlacıkları ayıran bir eşik floresan yoğunluğu seçinYüksek şablon konsantrasyonu görüntülerde floresan damlacıklar gelen TC görüntüler. Bilinmeyen her numune için, bir sınır değerin üzerinde floresan ile damlacıklar kısmını hesaplar. </li></ol></li></ol> 8. PCR ve MDA toplu reaksiyonları <ol><li> PCR reaksiyonu hazırlayın. <ol><li> Seri 0,1 seyreltme faktörü ile şablon DNA sulandırmak. Her seyreltme için, Denatürasyon Tamponu 45 ul şablonun 10 ul birleştirmek ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Nötralizasyon Tampon 45 ul seyreltme birleştirin. </li><li> Örnek başına PCR master 20 ul hazırlayın. 1.1x PCR reaksiyon karışımı, ana Taq DNA polimeraz ul 60 birim /, 11 mM Tris-HCI, 55mm KCI, 1.65 mM MgCl2, 0.22 mM dNTP oluşur, 1.1x boya, 1.1x referans boya ve 550 nM dsDNA bağlayıcı Her astar. </li><li> Seyreltilen değişik şablon 2 ul ve 20 ul master birleştirin. Not: Nihai şablon konsantrasyonları tO gösterilen reaksiyonlar PCR 50 pg, 5 pg, 500 fg, mikrolitre başına 50 fg, 5 fg, 500 ag ve 0 g Lambda DNA idi ve üç kopya halinde yapıldı. </li><li> Aşağıdaki programı ile QPCR makinesinde Thermocycle PCR reaksiyonu. 2 dakika boyunca 72 ° C &#39;de 2 dakika önce 30 saniye, 30 saniye için 20 sn için 57 ° C, 72 ° C, 95 ° C 40 döngü çalıştırın ve 4 ° C&#39; de tutarak. </li><li> DsDNA referans boya floresan önce daha fazla analiz kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. </li></ol></li><li> MDA reaksiyonu hazırlayın. <ol><li> Aşama 8.1.1 açıklandığı gibi örnekleri sulandırmak. </li><li> Buz üzerinde örnek başına usta karışımı 11 ul hazırlayın. 2x MDA Reaksiyon karışımı, ana 2x dsDNA bağlayıcı boya, 2x referans boya, 50 uM randomize oligo oluşur 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 4.8 mM dNTP, nükleaz içermeyen su ve 40 ug / ml Phi29 DNA Polimeraz. </li><li> 40 ug Phi29 DNA polimeraz ekleyin / polimeraz d sağlamak için son mloes 7.5 den pH seviyelerinin daha yüksek veya daha düşük değil karşılaşmak. İyice karıştır. </li><li> Bir qPCR tüp içinde Denatürasyon Tamponu 3,3 ul seyreltilmiş numune, 3.3 uL denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Nötralizasyon Tampon 3.3 ul ekleyin. </li><li> Denatüre şablonun 10 uL ve master karışımı 10 ul birleştirin. İyice karıştır. </li><li> Aşağıdaki programı ile QPCR makinesi MDA reaksiyonu çalıştırın. </li><li> Floresans her 7,5 dakika, ölçüm 4 saat 30 ° C&#39;de tutun. </li><li> 1 dakika süre ile 75 ° C &#39;de inaktive. </li><li> DsDNA referans boya floresan kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. Bundan başka, her numune için maksimum flüoresan ile normalize. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+strategies+in+the+development+and+analysis+of+molecular+biomarkers+for+personalized+medicine.">Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine.</a> Methods. 59 (1), 101-107 (2013).</li><li>Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RefSeq+microbial+genomes+database:+new+representation+and+annotation+strategy.">RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).</li><li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+is+now:+single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea.">The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination.">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+genomic+diversity,+one+cell+at+a+time.">Dissecting genomic diversity, one cell at a time.</a> Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).</li><li>Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Something+from+(almost)+nothing:+the+impact+of+multiple+displacement+amplification+on+microbial+ecology.">Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology.</a> ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+the+Year+2013.">Method of the Year 2013.</a> Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).</li><li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+digital+PCR+enables+multigene+analysis+of+individual+environmental+bacteria.">Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria.</a> Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).</li><li>Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+on+a+SlipChip..">Digital PCR on a SlipChip..</a> Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).</li><li>Heyries, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megapixel+digital+PCR.">Megapixel digital PCR.</a> Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).</li><li>Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+single+DNA+molecules+into+fluorescent+magnetic+particles+for+detection+and+enumeration+of+genetic+variations.">Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).</li><li>Kiss, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+quantitative+polymerase+chain+reaction+in+picoliter+droplets.">High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets.</a> Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).</li><li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+picoliter+rt-PCR+assays+using+microfluidics.">Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics.</a> Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+reinjection+and+coalescence+of+droplets+in+microfluidics.">Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics.</a> Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).</li><li>Rhee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+stabilizer+for+reproducible+picoinjection+in+droplet+microfluidic+systems.">Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems.</a> Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).</li><li>Hatch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR.">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays.">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li><li>Lage, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+analysis+of+genetic+alterations+in+small+DNA+samples+using+hyperbranched+strand+displacement+amplification+and+array-CGH.">Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH.</a> Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).</li><li>Dean, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+detection+of+single-nucleotide+and+copy-number+variations+of+a+single+human+cell.">Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syringe-vacuum+microfluidics:+A+portable+technique+to+create+monodisperse+emulsions.">Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions.</a> Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).</li><li>Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chip+for+the+versatile+chemical+analysis+of+single+cells.">A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells.</a> J Vis Exp. (80), e50618 (2013).</li><li>Fainman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , (2010).</li><li>Xia, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G.M.+Softlithographie.">G.M. Softlithographie.</a> Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).</li><li>Woyke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decontamination+of+MDA+reagents+for+single+cell+whole+genome+amplification.">Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification.</a> PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).</li><li>Hindson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+hot-start+amplification+via+a+multiple+emulsion.">System for hot-start amplification via a multiple emulsion.</a> US patent. , (2014).</li><li>Utada, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).</li><li>Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrically+mediated+breakup+of+drops+in+microfluidic+devices.">Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices.</a> Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).</li><li>Nisisako, T., Torii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration+on+a+chip+for+mass+production+of+monodisperse+droplets+and+particles.">Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles.</a> Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).</li><li>Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+production+of+single+core+double+emulsions+in+a+parallelized+microfluidic+device.">High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device.</a> Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).</li></ol>

The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

Dijital deneyler, nadir görülen hücrelerin tespit ve nükleik asit moleküllerinin bireyin sayımı sağlayan güçlü bir yöntem vardır. Bununla birlikte, dijital deneyler de rutin olarak ticari olarak temin edilebilen yöntemler ile ilişkili özel ekipman maliyeti, kısmen, analitik laboratuar uygulanan bağlı değildir. Burada bir standart gerçek zamanlı kantitatif PCR makine kullanarak basitleştirilmiş bir analog okuma ile nükleik asitlerin miktarının belirlenmesi için bir son nokta dijital tahlil aç...

Nükleik asit ölçümü (dijital PCR) 1-4 ve taban sırası (sıralama) için dijital analizler şiddetle yaşam bilimleri ve tıp etkilemektedir. Dijital deneyleri, yüksek hassasiyet sağlayan deneyler üzerinde yüzeysel karşılaştırmalar sağlayarak ve en önemlisi, karşılaştırılabilir veriler 5 (Tablo 1) içeren büyük veritabanları yapımını sağlayan mutlak ölçek (bir kontrole göre değil) moleküler sayımı ölçümü sağlar. Son 15 yılda, tüm genom amplifikasyonu (WGA) nükleik asit amplifikasyonu için genel bir araç olarak PCR ile birlikte ortaya çıktı. PCR gibi, WGA kolayca tespit veya baz sıralama gibi daha sonraki analizler için kullanılabilecek bir seviyeye kadar dakikalık numune elemanlarını yükselterek analitik ve preparatif uygulamalar için kullanışlıdır. PCR aksine, WGA tercih bilinmiyor sekanslar dahil olmak üzere numunedeki tüm sekanslar, amplifikasyon sağlayan belirli bir DNA lokusu için özel değildir.PCR ve WGA arasındaki bu temel fark birbirine tamamlayıcı yöntemler yapar ve bunların uygulamada farklı zorluklar doğurur. WGA reaksiyonlar 6 yüksek verimi tek moleküllerin 7, tek hücreler 8 ve miktar tayini ya da daha fazla analiz için diğer düşük biyokütle örnekleri 9 genomik DNA rutin amplifikasyonunu sağlamaktadır. WGA kimya ile ilgili önemli zorluklar onun kirlere karşı aşırı hassasiyet ve bireysel şablon molekülleri 6 genelinde dengesiz amplifikasyon vardır. Tek hücreli sıralama Ancak, WGA kazanıyor popülerlik WGA tarafından WGA teknolojisi 10, ve şablon nicelikleme &quot;katil uygulaması&quot; olarak ortaya çıkmıştır uygulamanın 7 birçok alanda önemlidir. Dijital nükleik asit ölçümü için Alet, daha önce Valfli ve supapsız mikroakışkan forma çeşitli tarif edilmiştirdamlacık bazlı deneyler dahil olmak üzere, ts 11-14, 15,16 (Tablo 2). Ancak, dijital analiz için ticari mikroakışkan sistemler reaksiyon kurulumu ve ürün tespiti 17 için özel ekipman gerektirir. Özel valfli Mikroakiskan esnek, ama hassas mikroüretim ve pnömatik kontrol sistemleri 18 gerektirir. Bu emülsiyon tabanlı dijital deneyleri 19,20 için monodispers mikro damlacıklar yapmak nispeten basit olmakla birlikte, dijital okuma büyük ölçekli geniş alan görüntüleme ya gerektiren, (popüler yeni nesil dizileme teknolojileri benzeri) teknik külfetli olduğu 21,22 veya Yüksek hızlı damlacık algılama 23-25 ​​akış tabanlı. İdeal olarak, bir dijital deney karmaşık enstrümantasyon ihtiyacını azaltarak ve hızlı bir şekilde dışarı okunacak örneklerin çok sayıda izin okunmasını set-up basit olurdu. Burada PCR i konvansiyonel gerçek zamanlı kullanan dijital damlacık deneyleri okuma için basitleştirilmiş bir yöntem tarifişle- mini yaparken damlacık tabanlı dijital testlerin toplu floresan ölçmek için. Yeni yaklaşım, dijital PCR uygulanabilir olsa da, (PCR için mükemmel sonuç verir) sorunlu gerçek zamanlı amplifikasyon deneylerini analog olan bir dijital WGA deneyleri için özellikle avantajlıdır. WGA yaygın sekansı, uzunluğu, ve baz içeriği heterojendir şablon molekülleri ile örneklere uygulanır. Bu farklı şablon molekülleri referans (&quot;standart&quot;) eşleşen özelliklere sahip numunenin kullanımını gerektiren, farklı oranlarda 6 güçlendirilir. Genellikle, böyle bir standart mevcuttur ya da gelen örneklerin özellikleri bilinmemektedir. Giriş kütlesi, moleküllerin giriş numarasını, iki ya da ne bir arada - WGA kimyaları giriş malzeme ve uzunluğu bağımlı mülkiyet heterojenliği 26 de sayısal ediliyor ne de belirsizlik yaratarak sonuçların yorumlanmasını zorlaştırmaktadır. FHerhangi bir dizinin kirletici molekülleri müdahale için potansiyele sahip çünkü inally, dizi-dışı özgüllük kantitatif PCR daha kirlenmeye kantitatif çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) daha duyarlı hale getirmektedir. Mikroakışkan dijital tahliller şablon molekülleri ayırma ve daha az kirletici örneklenmiş öyle ki tepkime hacimleri azaltarak kirlenmesini hitap etmektedir. Burada popüler bir izotermal WGA yöntemi, MDA 27 kullanın. Unutmayın ki, PicoPlex ve MALBAC 28 dahil olmak üzere birçok diğer WGA kimyaları ilk izotermal sarmal yer değiştirme merdivenlerinde önemlisi bağlıdır. Izotermal adımlar nicel WGA analog gerçek zamanlı deneyleri uygulanarak meydan alevlenmesine. WGA ne tamamen kurulum sırasında engelledi istenmeyen değişken ön büyütme giden, ne heterojen moleküllerin çoğaltma tamamlanmasına tahrik ve durdurulabilir bir şekilde (&quot;sağlanıncaya&quot;) discretized edilebilir PCR 11 gibi sonraki döngüsü önce </sup&gt; (Şekil 1). WGA için dijital tahlil biçimi nedeniyle tahlil uç noktada sayımı için her molekülün ayrılığı tipik reaksiyon kurulum işlemlerini barındıran özgün okuma doğruluğu amplifikasyon verimliliği varyasyon büyük ölçüde bağımsız olacağını ifade (yani preamplıfikasyon sonuçlarını etkilemez). Tahlil uç noktada damlacık başına sinyal seviyesi damlacık hacmine bağlıdır olarak tahlil, üniforma hacimli yağ üretilen damlacıklar bağlıdır ve biz sonuçların tutarlılığı damlacık boyutları dağılımı boyunca ortalama bağlıdır istemiyorum. Monodispers damlacıkları yapma şimdi (yaklaşık 3.500 monodispers damlacık kağıtları 2013 yılından bu yana yayınlanmış) standart bir prosedür olduğunu, ancak mikroakışkan enstrümantasyon 25 gerektirir. Aslında, fazla altı şirketlerin bu tür damlacıkların üretimine dayanan bağımsız ticari ürünler geliştirdik ve damlacık yapma mikroakışkan cips23,29 ticari olarak temin edilebilir. Bu çalışma için, in-house (Protokol bakınız) üretilen özel mikroakışkan cihazları kullanılır. Şırınga cihazlar yoluyla akışı da ticari olarak temin edilebilir sürücü pompalar, fakat alternatif olarak, maliyetleri azaltmak için 30 vakum bağlı akış için tek tek kullanımlık şırınga ile sübstitüe edilmiş olabilir.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Dye</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>Heated to 50 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C and quenched on ice prior to dilution</td></tr><tr><td>Randomized MDA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-NNNNN*N-3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&amp;rsquo; and 5&amp;rsquo;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>UltraPure Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)</td></tr><tr><td>ROX reference dye</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR optical strip caps</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (25 micromolar each)</td><td>Agilent Technologies</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Barrier pipette tips</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad oil for evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Dijital deneyler hücrelerin nadiren ve tek tek nükleik asit moleküllerinin sayımı saptanmasını sağlayan güçlü yöntemlerdir. Ancak, dijital tahliller rutin nedeniyle maliyet ve piyasada mevcut yöntemlerle ilgili özel ekipman, uygulanan değil hala. Burada damlacık tabanlı dijital tahliller kütle floresan ölçmek için geleneksel bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak dijital damlacık deneylerinin okunması için basit bir yöntem sunulmaktadır. Biz sentetik damlacık karışımları ve damlacık dijital çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) testi kullanılarak toplu okuma testinin performansını karakterize. Dijital reaksiyon biçimi Kantitatif MDA özellikle faydaları, ama bizim yeni bir yöntem herhangi bir dijital tahlil için de geçerlidir. Dijital PCR gibi kurulan dijital deney protokolleri için, bu yöntem, hızlandırmak ve deney okuma kolaylaştırmak için hizmet eder. Bizim toplu okuma metodolojisi partitione avantajlarını getiriyorözel okuma enstrümantasyon gerek kalmadan d tahliller. Bu standart için gereksinimler geleneksel gerçek zamanlı deney için daha az talepkar olmasına rağmen toplu okuma metodolojisi temel sınırlamalar, damlacık sayma platformları ve standart bir numune için ihtiyacı ile karşılaştırıldığında dinamik aralık azalır. Kantitatif tüm genom amplifikasyonu (WGA) WGA reaksiyonlarda kirletici maddeler için test etmek için kullanılır ve farmasötik kalite kontrol ve astrobiyolojiden dahil olmak üzere çeşitli uygulama alanlarında yöntemi büyük umut veren bilinmeyen dizilerle DNA parçalarının varlığını tespit etmek için, en hassas bir şekilde işleme tabi tutulur.

Geleneksel bulk / gerçek zamanlı kantitatif PCR okumaları ve kantitatif WGA tahlilleri (Şekil 1) her ikisi için de kullanılabilmesine rağmen, bir dijital sayısal deneyler avantajları (Tablo 1) sağlar. Açıklanan yöntemde, basit bir toplu uç ölçümü (Şekil 2) ile mikro damlacık formatında dijital deneyleri okudu. Bu yöntem genel olarak uygulanabilir iken bu yöntem, geleneksel gerçek zamanlı deneyleri için özel zorluklar sunuyor, çünkü biz nice...

Watch this Scientific Journal Video about Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays at JoVE.com

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K Görüntüleme.  Broad Institute. We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy. 

Video: Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in potentially heterogeneous specimens. Nucleic acids can be detected via several established approaches, including analytical methods that are spectrophotometric (e.g., A260), fluorometric (e.g., binding of fluorescent dyes), or colorimetric (nucleoside-specific chromogenic chemical reactions).1 Though it cannot readily distinguish RNA from DNA, the A260/A280 ratio is commonly employed, as it offers a simple and rapid2 assessment of the relative content of nucleic acid, which absorbs predominantly near 260 nm and protein, which absorbs primarily near 280 nm. Ratios &lt; 0.8 are taken as indicative of 'pure' protein specimens, while pure nucleic acid (NA) is characterized by ratios &gt; 1.53.
However, there are scenarios in which the protein/NA content cannot be as clearly or reliably inferred from simple uv-vis spectrophotometric measurements. For instance, (i) samples may contain one or more proteins which are relatively devoid of the aromatic amino acids responsible for absorption at &asymp;280 nm (Trp, Tyr, Phe), as is the case with some small RNA-binding proteins, and (ii) samples can exhibit intermediate A260/A280 ratios (~0.8 &lt; ~1.5), where the protein/NA content is far less clear and may even reflect some high-affinity association between the protein and NA components. For such scenarios, we describe herein a suite of colorimetric assays to rapidly distinguish RNA, DNA, and reducing sugars in a potentially mixed sample of biomolecules. The methods rely on the differential sensitivity of pentoses and other carbohydrates to Benedict's, Bial's (orcinol), and Dische's (diphenylamine) reagents; the streamlined protocols can be completed in a matter of minutes, without any additional steps of having to isolate the components. The assays can be performed in parallel to differentiate between RNA and DNA, as well as indicate the presence of free reducing sugars such as glucose, fructose, and ribose (Figure 1).

A suite of colorimetric assays is described for rapidly distinguishing protein, RNA, DNA, and reducing sugars in potentially heterogeneous biomolecular samples.

Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

Kimya

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Genetik

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biyomühendislik

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Biyoloji

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Tıp

<meta charset="utf8"></head><body>Dijital Damlacık PCR Kullanarak Viral Genom Ölçümü için Standartlaştırılmış Protokol

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of AAV genome copy number in vector preparations is essential for bioprocess optimization and dosage calculation in both preclinical and clinical studies of AAV-based gene therapy products. Currently, a consensus protocol for AAV viral genome titration is lacking. Here, we present a digital droplet PCR (dd_PCR) protocol for the quantification of viral genomes in purified vector samples. Samples are treated with DNase I to eliminate unpackaged contaminant DNA. DNase-treated samples are then mixed with an appropriate primer-probe set (designed according to the target AAV genome) and PCR reagents, and then loaded into a droplet generator. The prepared droplets are transferred into a PCR plate, where PCR amplification is performed and analyzed. The viral genome titer is calculated based on the concentration (copies/&#181;L), accounting for sample dilutions. A successful measurement shows a clear separation of the positive and negative droplet clouds, has at least 10,000 accepted droplets, shows a value between 10 copies/&#181;L and 10,000 copies/&#181;L, and has a coefficient of variation (CV) between repeats lower than 20%. Reliable viral genome titration will aid in the development of safe and effective AAV-based gene therapy products.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Doğru Adeno İlişkili Viral Genom Ölçümü için Dijital Damlacık PCR Yönteminin Optimize Edilmesi

Precise quantification of adeno-associated virus (AAV) vector genome copies is critical, but a standardized protocol has yet to be established. This protocol describes a validated method for preparing purified AAV samples and conducting digital droplet polymerase chain reaction (dd_PCR) to reliably quantify the viral genome titer.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 water-in-oil droplets, and the PCR occurs in the individual droplets. The dd-PCR has several advantages over conventional real-time qPCR, including increased accuracy in detecting low-abundance targets, omitting reference genes for quantification, eliminating technical replicates for samples, and showing high resilience to inhibitors in the samples. Recently, dd-PCR has become one of the most popular methods for accurately quantifying target DNA or RNA for gene expression analysis and diagnostics. Circular RNAs (circRNAs) are a large family of recently discovered covalently closed RNA molecules lacking 5' and 3' ends. They have been shown to regulate gene expression by acting as sponges for RNA-binding proteins and microRNAs. Furthermore, circRNAs are secreted into body fluids, and their resistance to exonucleases makes them serve as biomarkers for disease diagnosis. This article aims to show how to perform divergent primer design, RNA extraction, cDNA synthesis, and dd-PCR analysis to accurately quantify specific circular RNA (circRNA) levels in cells. In conclusion, we demonstrate the precise quantification of circRNAs using dd-PCR.

This protocol describes the detailed method of digital droplet PCR (dd-PCR) for precise quantification of circular RNA (circRNA) levels in cells using divergent primers.

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Hitachi F-7000 Floresans Spektrofotometre ve PicoGreen Boya kullanarak dsDNA Niceleme

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi