Name: nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

Richard W. Beringer ve David L. Ash, teknik yardım ve film çekimi için başvurular Bilim adamları, Thermo Scientific NanoDrop ürünleri.

1. Microvolume Nükleik Asit Niceleme NanoDrop 2000c Spektrofotometre <ol><li> Başlamak için, optik alt yüzeye temiz deiyonize su 2 - 3 mcL pipetleme microvolume spektrofotometre numune tutma sistemi, üst ve alt optik yüzeyler temiz. </li><li> Üst kaide deiyonize su ile temas halinde gelir sağlamak, kol kapatın. Kol kaldırın ve her iki optik yüzeyler temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin silin. </li><li> NanoDrop yazılımını açın ve Nükleik Asit uygulamayı seçin. Optik alt yüzeye tampon 1 mcL dağıtım boş bir ölçüm gerçekleştirmek için küçük bir hacim, kalibre pipet kullanın. Alt kol ve Nükleik Asit uygulaması &quot;Boş&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Sonra boş bir ölçüm tamamlandığında, optik yüzeyler hem de temiz temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin. </li><li> Ölçülecek numune için uygun sabit seçin. <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek Türü </td><td> Seçenek Seçin </td><td> Konsantrasyonunun hesaplanması için kullanılan sabit </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Özel </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Tipik bir NanoDrop microvolume spektrofotometre, TrayCell Microcell küvet ile kullanılan geleneksel bir küvet tabanlı spektrofotometre ve PicoGreen testi ile birlikte bir microvolume NanoDrop fluorospectrometer kullanarak doğrudan A280 absorbans ölçümleri için nükleik asit konsantrasyon aralıkları. </li><li> 1 mcL nükleik asit örnek optik alt kaide üzerine koyun ve kol kapatın. Ölçümü bağımsız ses olduğundan, örnek, sadece yapılacak bir ölçüm için iki optik yüzeyler arasında köprü gerekir. </li><li> Uygulama yazılımı &quot;Ölçü&quot; i seçin. Yazılım otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonu ve saflık oranları hesaplar. Örnek ölçüm ardından, spektral çıktısını gözden geçirin. </li><li> Yazılım otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonu ve saflık oranları hesaplar. Örnek ölçüm ardından, örnek kalitesini değerlendirmek için spektral görüntü gözden geçirin. </li><li> Tipik bir nükleik asit örneği çok karakteristik bir profile sahip. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Tipik bir nükleik asit örneği çok karakteristik bir profile sahip. </li><li> Ortak spesifik nükleik asit izolasyon teknikleri ile ilişkili bulaşanların kaynakları Fenol / Trizol ve sütun çıkarma içerir. Fenol / Trizol çıkarma durumda, kalıntı reaktif kontaminasyonu 220 - 240 nm arasında anormal spektrumları yanı sıra 260-280 nm bölgede vardiya endike olabilir. Tersine, sütun çıkarma artık guanidin tepe ve çukur bir kayma yaklaşık 240 nm 230 nm 230 nm yakın bir katkıda bulunabilir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2, B ve C örnekleri zirveler ve dipler vardiya olarak kirleticiler, nükleik asit örneklerinin spektrumları nasıl etkilediğini göstermek örnek kıyasla. </li><li> Doğru örnek kalitesini değerlendirmek için, 260/280 ve 260/230 oranları genel spektral kalite ile birlikte analiz edilmelidir. Saf nükleik asitler genellikle sırasıyla ~ 1.8 oranı 260/280 ve 260/280 oranı ~ 2.0 DNA ve RNA için bir verim. Bu oran, boş ve örnek ölçümleri yapmak için kullanılan tampon pH ve iyonik kuvvet bağlıdır. Asidik çözümler temel bir çözüm 0.2-0.3 oranı fazla temsil edecek iken, 0.2-0.3 oranı altında temsil edecek. Önemli ölçüde farklı saflık oranları, 280 nm veya yakınındaki kuvvetle absorbe protein, fenol ya da diğer kirleticiler varlığına işaret edebilir. 260/230 saflık oranı 1.8-2.2 aralığında yaygın bir &quot;saf&quot; nükleik asit değerleri ile DNA saflık ikinci bir ölçüsüdür. Saflık beklenen değerlere göre anlamlı derecede düşük oranlar kullanılan izolasyon tekniği daha fazla optimizasyon isteyebilir gösterebilir. </li><li> NanoDrop spektrofotometreler da doğrudan absorbans kullanarak protein ya da protein kolorimetrik testleri ile ölçmek için kullanılabilir. Uygun sütun oluşumu ve tekrarlanabilirlik sağlamak için, 2-ul örnekleri protein örnekleri için tavsiye edilir. Aşağıdaki vallahi video bakın: Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> NanoDrop Spektrofotometre </li></ol><ol><li> NanoDrop 3300 kullanarak yüksek hassasiyetli microvolume nükleik asit kantitatif göstermek için, bir PicoGreen floresan kiti kullanılır. Başlamak için, oda sıcaklığına kadar kiti standartları ve nükleik asit örneklerinin dengelenmesi. Floresan örnekleri ışığa duyarlı ve kehribar veya alüminyum sarılmış tüpler tutulmalıdır. </li><li> , Gerekli olacak PicoGreen çalışma çözeltisinin yanı sıra ölçülebilir tüm standartlar ve örnekler için yeterli 1x TE tampon hazırlayın. 20x TE tampon üreticinin protokol başına nükleaz içermeyen su ile seyreltilmesi ile 1xTE tampon hazırlayın. Reaksiyon hacmi 200 mcL kadar az 10 ul uzanabilir. Bu örnekte, 10 mcL reaksiyon hacmi hazırlanacaktır. </li><li> Nükleaz şişeleri ya da tüpler 2x nihai istenen konsantrasyona seri seyreltilmiş dsDNA standartları hazırlayın. Nükleaz içermeyen amber veya folyo kaplı tüp etiketli bir birey haline seyreltilmiş dsDNA standartlarını her 5 mcL aktarın. </li><li> Uygun etiketli nükleaz içermeyen sarı veya folyo kaplı tüpler içine ilgi her dsDNA örnek kısım 5 mcL. </li><li> Üretici firmanın protokolüne göre PicoGreen çalışma çözeltisi hazırlayın. PicoGreen çalışma çözeltisi eşit hacimde bir ilgi standart ya da numune (bu örnekte 5 mcL) da içeren her tüp aktarın. </li><li> Bir referans çözüm olarak hizmet veren negatif kontrol hazırlamak, 1x TE tampon ve PicoGreen çalışma çözeltisi eşit hacimlerde birleştirin. </li><li> Nazik pipetleme ile iyice karıştırın ve Her reaksiyon tüpü içeriğini reaksiyonların, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Floresan sinyal sıcaklığından etkilenir gibi tüm standartlar ve örnekler önce aynı ölçüm sıcaklığına gelmesi beklenmelidir. </li><li> Alet hazırlamak ve ölçümlerini yapmak, ilk numune tutma sistemi alt ve üst yüzeyleri temizlemek. Optik alt yüzeye deiyonize su pipetleyin 2 3 mcL yakın, sonra kol ve temiz, havsız ile alt ve üst kaideleri blot, laboratuvar silin. Yüzeyleri tüy bırakmayan bir floresan bir uyarım kaynağının varlığını gösterirler ve ölçümü ile karışabilir geçmeden önce tüy bırakmayan ücretsiz olun. </li><li> , Cihazın yazılımını açın &quot;Nükleik Asitler&quot; uygulamasını seçin ve &quot;PicoGreen-dsDNA&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Araç boş için, alt kaide 1x TE 2 mcL ekleyin, kol kapatın ve cihaz yazılımı alanında &quot;Boş&quot; seçeneğini seçin. Boş komple sonra, numune tutma sistemi her iki yüzeyine boş bir çözüm kurulayın. </li><li> Nazik pipetleme referans çözüm karıştırın. Alt kaide üzerine düşük tutma ipuçları, pipet 2 mcL kullanma ve kol yakın. </li><li> Ölçüm tipi &quot;Referans&quot; seçin ve istenilen birimleri seçin. Ölçüm döngüsü başlatmak için &quot;Ölçü&quot; ı tıklayın. </li><li> Ölçüm döngüsü tamamlandığında, kol açık ve iyice kurulayın numune tutma sistemi yüzeyler. Beş kadar ölçüm her çoğaltmak için taze bir kısım kullanarak, referans çoğaltır. </li><li> Standart bir eğri oluşturmak için ek standartlar için bu işlemi tekrarlayın. Kadar yedi standartları kullanılıyor olabilir. Bu yazılım, her standart için beş çoğaltır kadar saklamak için tasarlanmıştır. Standartların çoğaltır örnek konsantrasyonları otomatik olarak belirlendiği ve standart bir eğri oluşturmak için ortalaması alınır. </li><li> Standart eğri tamamlandıktan sonra, &quot;Örnekler&quot; sekmesini seçin, ilgili örnek kimlik bilgilerini girin ve her bilinmeyen numune ölçün. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins ve Debra Conklin Bu makalede kullanılan aletleri üreten Thermo Scientific NanoDrop Ürünler, Inc tarafından istihdam edilmektedir.

Burada sunulan kantitatif protokolleri en yaygın kabul gören microvolume sistemleri dayanmaktadır. Bu tür sistemler daha fazla numune hacimleri ve çevreleme cihazların kullanımı güveniyor geleneksel nükleik asit kantitatif metodoloji için pratik alternatifler sağlar. NanoDrop microvolume teknolojisi, yüzey gerilimi özellikleri üzerine bir sıvı sütunu oluşturmak için ölçülen örnek güvenir bir örnek tutma sistemi kullanmaktadır. Bu örnek, uygun sütun oluşumu için alt ve üst optik ölçüm yüzeyleri ile temas yaptığı esastır. Eğer herhangi bir noktada ölçüm sonuçlarının yanlış ya da tekrarlanabilir değil gibi görünüyor, büyük olasılıkla örnek heterojenite veya sıvı sütun kırılması sonucu. Deterjan ve temizlik maddeleri, kaide ölçüm yüzeyleri uncondition olarak izopropil alkol tavsiye edilmez. Koşulsuz kaide örnek damlacık bir düzleşme, kaide hidrofobik yüzey özellikleri uzlaşılan olduğu zaman oluşur. Koşulsuz kaideleri ölçüm sırasında sıvı sütunun kırılmaya yol açabilir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 koşulsuz yüzey, bir su damlasının bir düzleşme tarafından karakterize edilir . Uncondtioned kaide yüzeyleri NanoDrop Ayak Yenileme Bileşik (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Ürünleri) kullanılarak yenilenmiş olabilir. ~ 30 saniye süreyle kurumasına izin, üst ve alt kaide yüzeyleri, bileşik yenileme ince bir tabaka uygulanır, daha sonra temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin kullanarak ovuşturdu. Başarılı bir şekilde yenilenmiş bir devlet, bir su damlacığı alt kaide yüzeyine uygulandığında kadar boncuk ile karakterizedir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 yenilenmiş bir yüzey, bir su damlasının bir boncuk tarafından karakterize edilir . Microvolume kantitatif sistemleri büyük ölçüde örnek tüketimini azaltmak ve daha geleneksel kantifikasyon sistemleri ile kıyaslandığında önemli ölçüde konsantrasyon aralığı artırmak. Microvolume kantitatif genellikle iğne biyopsileri ve lazer yakalama mikrodiseksiyon sınırlı hücre gibi kütle, verimlilik ve kolaylığı bu metodoloji yaptı yaygın olarak kabul gören alternatif geleneksel nükleik asit kantitatif yöntemleri içeren durumlar için elverişli bir teknoloji haline gelmiştir rağmen bile Örnek bol olduğu zaman.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Biyomoleküler deneyleri genellikle microvolume kantitatif gerçekleştirebileceğiniz bu nükleik asit kantitatif geleneksel küvet-temelli araçların kullanımını engelleyen, sürekli kullandığınız malzemenin giderek daha az miktarlarda gelişmiş ediliyor. NanoDrop microvolume numune tutma sistemi (Thermo Scientific NanoDrop Ürünler) Küvet veya kapiler gibi geleneksel çevreleme cihazların bağımsız örnek dakika miktarda yakalamak ve korumak için fiber optik teknoloji ve doğal yüzey gerilim özelliklerini birleştirerek fonksiyonları. Ayrıca, sistem, aslında dilüsyonları gerçekleştirmek için ihtiyacı ortadan kaldırır. Kısa yol uzunluklarında, nükleik asit konsantrasyon ölçümleri geniş bir yelpazede Sonuç olarak, istihdam Spektroskopik analiz için gerekli olan örnek hacminin azaltılması da dahil birçok moleküler iş akışları boyunca ek kalite kontrol adımları kolaylaştırır verimliliğin artırılması ve sonuçta aşağı sonuçlarında daha fazla güven. Sınırlı bir kitle yüksek hassasiyetli floresan analizi için ihtiyaç da deneysel son gelişmeler ile ortaya çıkmıştır. Aynı microvolume örnek saklama teknolojisini kullanarak, floresan ölçümler, floresan testleri hacim gereksinimleri önemli ölçüde azaltılabilir sağlayan 2 mcL malzeme ile olabilir. Bu mcL 10 veya daha az microreactions adanmış microvolume fluorospectrometer kullanarak artık mümkün. İki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri geleneksel küvet tabanlı protokoller için pratik alternatif olarak entegre numune tutma sistemleri kullanan gösterilecektir. Birincisi, bir microvolume spektrofotometre kullanarak doğrudan A260 absorbans yöntemi açıklanmıştır. Bu microvolume fluorospectrometer ile az hacimli floresan reaksiyonlar sağlayan bir floresan tabanlı bir yöntem bir gösteri izledi. Bu yeni teknikler 1 pg / ml numune en az tüketim ile 15.000 ng / ml arasında değişen nükleik asit konsantrasyonlarının değerlendirilmesi sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Pratik ve verimli bir alternatif olarak geleneksel nükleik asit kantitatif metodolojiye NanoDrop microvolume sistemlerinin kullanımı iki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri gösteri ile tarif edilir.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

201.8K Görüntüleme.  Thermo Scientific NanoDrop Products.  中文 Deutsch Français 

Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Biyoloji

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>Diskrimatif RNA ve DNA Analizi için Hassas DNA Nanomakineleri

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: DNA Nanosensörlerindeki Gelişmeler - Moleküler Algılamada Hassasiyet ve Seçicilik Zorluklarının Ele Alınması

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biyokimya

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Probe-tabanlı Real-time PCR microRNA Kantitatif Ölçüm Yaklaşımları

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati