dd-PCR, hedef DNA veya RNA'nın mutlak nicelleştirilmesi için oldukça hassas ve doğru bir yöntemdir. Diğer konvansiyonel yöntemlerin doğru sonuç veremediği durumlarda hastalık tanısında kullanılmıştır. dd-PCR, çok düşük miktarda bulunan nükleik asit moleküllerini tespit etmek için en hassas tekniktir.
Kantitatif PCR'nin aksine, dd-PCR nicelik için herhangi bir temizlik gen kontrolü gerektirmez. Duyarlılığı ve doğruluğu nedeniyle, dd-PCR, mikro RNA'lar ve dairesel RNA'lar gibi düşük miktarda RNA moleküllerini içeren moleküler teşhis ve araştırmalar için bir araç olarak kullanılabilir. dd-PCR kullanmadan önce, primerlerin spesifik olmayan herhangi bir PCR amplifikasyonu olmadan hedef genlerini yükselttiğini doğrulamak için RT-PCR veya RT-qPCR yapılmalıdır.
Başlamak için, toplam dairesel RNA dizisi uzunluğunun son 100 nükleotidini dairesel RNA dizisinin ilk 100 nükleotidine birleştirerek 200 nükleotid uzunluğunda bir PCR şablon dizisi hazırlayın. Primer 3 web aracı tarafından tasarlanan astar şablon dizisini kullanın. RNA izolasyonu için yaklaşık 5 milyon çoğalan C2C12 miyoblast hücresi ve dört günlük bir farklılaştırılmış C2C12 miyotüpü içeren 10 santimetrelik bir çanak alın.
Hücreleri 10 mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'yi bir pipet kullanarak atın. Bir mililitre RNA izolasyon reaktifi ekleyin ve hücreleri kuvvetli pipetleme ile lize edin. Ardından, 15 saniye boyunca 200 mikrolitre kloroform ve vorteks ekleyin.
Tüpü 12.000 G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj yapın.Üst sulu tabakanın 400 mikrolitresini alın, bir silika kolona yükleyin ve oda sıcaklığında 12.000 G'de bir dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı yeni bir tüpe alın ve 600 mikrolitre% 100 etanol ekleyin. 20 mikrolitre manyetik silika boncuk ekleyin ve tüpü beş dakika boyunca 25 santigrat derece ve 1.200 RPM'ye ayarlanmış bir termomikser üzerine yerleştirin.
Ardından, tüpü 30 saniye boyunca veya çözelti netleşene kadar manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Manyetik silika boncukları% 90 etanol içeren 500 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Tüpü manyetik standa 30 saniye yerleştirdikten sonra, boncukların mıknatısa doğru yerleşmesine izin verin ve tamponu bir pipet kullanarak atın.
Tüpü bir termomikser üzerinde üç dakika boyunca 50 santigrat derecede hava ile kurutun ve kapağı açık tutun. 20 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve boncukları yeniden askıya alın. Bir spektrofotometre kullanarak miktar ve kalite değerlendirmesi için çözünmüş RNA'yı yeni bir tüpte toplayın.
RNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve cDNA sentezi için bir mikrogram RNA alın. Bir mikrogram toplam RNA'yı bir mikrolitre dNTP karışımı, dört mikrolitre 5X ters transkriptaz tamponu, iki mikrolitre 10X ters transkriptaz rastgele primer, 0.25 mikrolitre ters transkriptaz enzimi ve 0.5 mikrolitre RNaz inhibitörü ile karıştırın. Nükleaz içermeyen su kullanarak hacmi 20 mikrolitreye kadar yapın.
Tüpü 10 dakika boyunca 25 santigrat dereceye, ardından bir saat boyunca 50 santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra enzimi inaktive etmek için tüpü beş dakika boyunca 85 santigrat dereceye yerleştirin. 22 mikrolitrelik PCR reaksiyonunu, negatif bir kontrol tüpü ve şablonsuz kontrol tüpleri ile birlikte 0.2 mililitrelik PCR tüplerinde veya şeritlerinde ayarlayın.
NTC reaksiyon tüplerini kurmak için 11 mikrolitre dd-PCR ana karışımı, bir mikromolar konsantrasyonda 5.5 mikrolitre dairesel RNA'ya özgü ileri ve ters primer karışımı ve 5.5 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Benzer şekilde, test reaksiyon tüplerini kurmak için, 11 mikrolitre dd-PCR ana karışımı, bir mikromolar konsantrasyonda 5.5 mikrolitre dairesel RNA'ya özgü ileri ve ters primer karışımı ve 5.5 mikrolitre cDNA ekleyin. Damlacık üretimi için, 0.2 mililitrelik PCR tüplerinden 20 mikrolitre PCR karışımını damlacık jeneratörü kartuşunun numune kuyucuklarına aktarın.
Bir pipet kullanarak damlacık jeneratörü kartuşunun yağ kuyularına 70 mikrolitre damlacık üretim yağı ekleyin. Damlacık jeneratörü kartuşunu kauçuk bir conta ile örtün ve kartuşun damlacık kuyucuklarında oluşan örnek yağ damlacığı karışımını elde etmek için damlacık jeneratörü makinesine yerleştirin. PCR amplifikasyonu için, damlacık jeneratörü kartuşunun damlacık kuyucuklarından 40 mikrolitre numune yağ damlacığı karışımını, pipet kullanarak 96 delikli bir PCR plakasına aktarın.
96 delikli PCR plakasını alüminyum folyo sızdırmazlık maddesi ile kapatın. 180 santigrat derecede önceden ısıtılmış plaka kapatıcı makine bloğuna yerleştirin ve PCR plakasını kapatmak için contayı tıklayın. Ardından, plakayı dd-PCR termal bisikletçiye yerleştirin ve kapak sıcaklığını 105 santigrat dereceye ve rampa hızını saniyede iki santigrat dereceye ayarlayın.
PCR bittikten sonra, plakayı dd-PCR damlacık sayacı makinesine, damlacıkları saymak için plaka tutucu ile doğru konuma getirin. Damlacık analiz yazılımını açın ve numune bilgilerinin girişini vererek çalıştırmayı ayarlayın. Damlacık okumasının tamamlanmasından sonra verileri analiz etmek için analiz et düğmesine tıklayın.
Ardından, pozitif ve negatif damlacıkları görmek için 1D Genlik düğmesine tıklayın. Pozitif damlacıkları negatif damlacıklardan ayırmak için, aynı hedefe sahip tüm numuneler için ortak bir eşik çizgisi koyun. Dairesel RNA sayım verilerini csv dosyası olarak dışa aktarmak için dışa aktar düğmesine tıklayın.
Dışa aktarılan veriler, her örnekte bulunan dairesel RNA'ların sayısını gösterir. Her reaksiyonda kullanılan toplam cDNA miktarını göz önünde bulundurarak, RNA'nın nanogramı başına her numunedeki dairesel RNA sayısını manuel olarak hesaplayın. QuantaSoft Yazılımı kullanılarak yapılan veri analizi burada gösterilmiştir.
MT1 dışındaki tüm örnekler 12.000'den fazla damlacık sayısı gösterdi. MT1'de toplam damlacık sayısı düşük olduğundan, bu örnek son veri analizi için dikkate alınmamıştır. İlginçtir ki, dört günlük farklılaşmış miyotüp durumunda, miyoblast hücrelerine kıyasla Circ B ve C2'nin ekspresyon paterninde açık bir fark vardı.
Circ B ve C2 bolluğunun kopya sayısı açısından analizi, C2C12 miyoblastlarının üç replikatörünün RNA'nın nanogramı başına 76.8, 67 ve 46 kopyaya sahip olduğunu, iki miyotüp örneğinin RNA'nın nanogramı başına 558 ve 610 kopyaya sahip olduğunu göstermiştir. Çubuk grafikteki veriler, iki ila üç biyolojik kopyanın ortalama artı eksi standart sapmasını temsil eder. ddPCR, hedef dairesel RNA'nın doğru diferansiyel ekspresyonunu ölçmek için en gelişmiş yöntemlerden biridir.
Bu yöntem, önümüzdeki yıl döngüsel RNA araştırma ve teşhis endüstrilerini hızlandırmak için önemli bir araç olacaktır.
