Yazarlar mikroskobu deneyleri ile mükemmel teknik yardım için Glen Slocum (Wisconsin Tıp Koleji) ve Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma (AS) R01 HL108880 (OPO kadar) R01 DK095029 ve (TSP) K99 HL116603 (TSP) Ulusal Böbrek Vakfı IG1724, (OPO kadar) Amerikan Kalp Derneği 13GRNT16220002 ve hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir (DVI) Nefroloji American Society Ben J. Lipps Araştırma Bursu.

Aşağıda açıklanan deneysel prosedürleri Wisconsin ve Houston Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi Tıp Koleji&#39;nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca idi. Şekil 1 doku izolasyon ve işleme prosedürünün ana adımları gösterir. Kısaca, PCK veya SD sıçanların böbrekleri sağlıklı olmayan aranan tübüllerden veya kistleri ya oluklar toplama epitel mono tabakaları elle izolasyonu için kullanılır. Burada 4-16 hafta eski PCK sıçanlar 10,13 böbreklerin okudu. 1. Böbrek Kist ve Bağlantı Pipet (CNT) / İzolasyonu Toplama Kanalları (CD) Kesimleri <ol><li> Izofluran (% 5 indüksiyon,% 1.5 2.5 bakım) / tıbbi sınıf O 2 ya da başka bir onaylanmış yöntemle deneysel hayvan anestezisi. Hayvanlar sürekli olarak yeterli le sağlamak için izlenmesi gerekirAnestezi vel. Kararlı solunum hızı ve ayak tutam tepki uygun anestezi onaylamak için kullanılır. </li><li> Laparotomi gerçekleştirin ve abdominal aort 17 ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile böbreklerin yıkayın. <ol><li> Polietilen boru kateteri (PE50) hazırlayın ve PBS ile dolu bir şırınga pompası bağlayın. Yan ve mezenterik ve çölyak arterler dallanma ile inen aorta erişmek için pamuklu karın organları kaydırmaya taraftan karın karşısında çapraz karın bir kesi yapmak, sonra linea alba boyunca cilt ve karın duvarı kesti. Onların kuruluğunu önlemek için daha fazla işlemler sırasında ılık serum fizyolojik ile iç organları nemlendirin. </li><li> Tek mezenterik ve çölyak arterler etrafında bitişik harfleri (# 1) ve başka bitişik harfleri (# 2) diyaframın altında aort etrafında (kravat yok) yerleştirin. Yavaşça bir ayrı. İnce forseps ile çevresindeki bağ dokuları diseksiyon ve iki bitişik harfler koyun künt tarafından abdominalis ~ 3Sol renal arter altına mm (# 3) ve iliak arterler bifurkasyon yukarıda (# 4). </li><li> Bağ 4. Kravat ve sol renal arter ve bağ # 3 arasında aort etrafında bir gemi kelepçe takın. Sıkıca kateter düzeltmek için bağ 3. kullanın, kelepçe ve aorta kateterizasyonu bağ 4. arasında bir kesi yapmak. </li><li> Kelepçe bırakın ve kan nabız düzgün yüklenmesini sağlamak için kateterin görünür olduğundan emin olun. 6 ml &#39;lik bir oranda perfüzyon başlayın / dak, alaşımlar # 1 ve # 2 kravat ve sol renal damar kesilir. Organlar tamamen beyazlatılmış kadar 1-2 dakika süreyle yıkamaya devam edin. </li><li> Makasla böbrek kan damarları, üretra ve çevresindeki bağ ve yağ dokuları kesmek böbrekleri toplamak. Ardından böbrek kapsülü kısa gözyaşı yapmak ve bunları açarlar için böbrekleri soyun. Buz soğukluğunda PBS içine böbrekler yerleştirin. Ötenazi bir torakotomi ile teyit edilir. </li></ol></li><li> Poli-L-lisin ile kaplanmış 5 x 5 mm cam kapak fiş hazırlayın. Bir kapak GLA Cutbir elmas kalem ve yerine, her bir cam çip üzerine% 0.01 steril filtre edilmiş Poli-L-Lizin çözeltisi, yaklaşık 20 | il ile ss. Tuzlu ve diseksiyon için saatçi forseps iki çift hazırlayın. </li><li> 1-2 mm kalınlığında dilimler halinde ~ arasında frontal düzlem boyunca bir jiletle böbrekler kesin. Bir stereomikroskop altında dilim birini yerleştirin. Dokuların izolasyonu buz gibi soğuk tuzlu su içinde yapılmalıdır. </li><li> Yuvarlak şekilli boşlukların (Şekil 2A) gibi bir stereomikroskop altında kist bulun; duvarları genellikle çoğaldı kan damarlarının belirgin ağını içerir. Kullanımı ince uçlu forseps bir tek tabakalı alanı elde etmek mümkün olduğunca ince bir kist iç epitel tabakası teşrih. Poli-L-lisin ile kaplanmış cam bir çip için takın. Sabit Poli-L-Lizin yüzey araştırmacısı sıkıca camına iç kist tabakası konumlandırmak sağlar. Pipetler (Şekil 2B) için erişim sağlamak için apikal yüzü yukarı bakacak şekilde kist Açığa. </li><li> PCK veya SD sıçan çocuk kullanınolmayan dilate CNT / CCDsegments 18-21 izolasyonu için papilla içeren ney merkez dilim. Not: Papiller dokular korteks az ve forseps ile papiller boru şekilli bantlar tutarak ve dilim ince sektörlere bölünebilen ekseni radyal boyunca yırtılarak daha dayanıklıdırlar. Bireysel tübüller görünür ve kapak cam yongaları yerleştirilmek üzere dışarı çekilebilir. </li><li> , Bifurkasyonlarında tarafından proksimal tübüllerin ve büyük belirgin görünür hücreler (Şekil 2C) daha yüksek şeffaflık CNT / CCD kesimleri belirleyin. Mikropipetler sürüş için uygun mikromanipülatörler ile donatılmış bir mikroskop altında ekli tübüllere ile cam kapak çipi yerleştirin. Cama onların kenarları keskin Mikropipetler bölünmüş açık tübüllerine kullanma ve takın (Şekil 2B) apikal yüzey erişilebilir hale getirmek için. </li></ol> 2. Tek Kanallı Patch-kelepçe Elektrofizyoloji <ol><li> Banyo solüsyonu ile yama-kelepçe odasına doldurun ve kapak cam çip transferiodasına izole edilmiş dokular ile. Patch-kelepçe mikropipetler güvenilir on-hücre (hücre-bağlı) ölçümler için 7-10 M? Direncini sahip olduğundan emin olun. </li><li> Hücre bağlı ölçümler için, 20x&#39;e amplifikatör kazanç oranını ayarlamak ve sekiz kutuplu Bessel filtresi ile 300 Hz akımları düşük geçmektedir. ENaC kanallarının izlenmesi için, mM banyo çözeltisi, kullanın: 150 NaCI, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4); Pipet: 140 LiCİ, 2 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4). </li><li> Bir hücre bağlı modda 10 geleneksel bir yama-kelepçe deney. Epitel Tek tabakalı bir hücre seçin ve apikal membran pipet yaklaşım. Hafif bir emme uygulayarak bir pipet ve hücre zarı arasında sıkı bir dirençli sızdırmazlık elemanı oluşturmaktadır. Yüksek dirençli gigaohm kapatmanın meydana getirildiği zaman, bir tutma potansiyelinde bir boşluk içermeyen bir protokol ilgi kanalının izlenmesi aktivitesi için başlanmalıdır. </li><li> Giga gelen mağaza boşluk içermeyen tek kanallı güncel verilerSonraki analiz için Ohm mühürler. Genellikle yama-kelepçe kurulumları 18 ile sağlanan bir yazılım paketi kullanarak kanal olayları analiz. Kanalların ortalama açık olasılık N yama ve P o aktif kanal sayısına atıfta nerede NPO olarak kanal aktivitesini hesaplamak olduğunu. NOT: en fazla 30 dakika süreyle patch-clamp deneyleri izole kist veya tübüller kullanın. </li></ol> Epitel hücrelerinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu 3. oranlı metrik Epifloresans Ölçümleri <ol><li> DMSO içinde çözülmüş 5 mM, Fura-2AM kullanın. Bireysel 500 ul konik tüpler içine kısım stok çözeltisi (yaklaşık 10 ul). Altı aya kadar -20 ° C&#39;de derin dondurucuda ışık ve mağaza koruyun. </li><li> PSS 30-40 dakika süreyle izole kistleri ve split-açık tübüller inkübe (mM: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2 ve pH 7.35 10 HEPES) 5 uM Fura-2:00 boya ve 0.0 içeren% 5 pluronik asit asetoksimeti esterleri dağıtmak yardımcı olur. Bunun için, yükleme kokteyli ihtiva eden 3.5 cm tabak içinde yer dokular, ışıktan korumak ve oda sıcaklığında yavaş bir karıştırıcı üzerinde inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra PSS temiz ve daha Epifloresans görüntüleme gerçekleştirmek için bir mikroskop altında dokuyu yerleştirmek için medyayı içeren Fura-2 AM değiştirin. </li><li> CCD kamera ve filtre tekerleği ile donatılmış istikrarlı bir ışık kaynağı (monokromatör sistemi) açın (her filtre pozisyon filtresi olarak adlandırılan her zaman seçili kendi zayıflama düzeyi ile ilişkili olabilir). </li><li> Parlak saha, dokuyu bulun. Floresans sinyalinin tespiti için geçiş ve sinyal doymasını önlemek için nötral yoğunluk filtreleri ve lamba gücüyle ışık kaynağının yoğunluğunu ayarlamak. </li><li> 0.125 Hz veya daha yüksek frekansı ile 340/380 nm&#39;de rasyometrik uyarma ile doku numunesinde Fura-2:00 floresan izleyin. Doğru çözünürlülüğü için 40 × / NA 1.3 veya benzeri objektif lens kullanmation görüntüsü. </li><li> Görüntü işleme ve hesaplamalar için görüntü dizisi ithal. Kanal bölmek ve bir hyperstack gri tonlama modu kullandığınızdan emin olun. Birkaç ilgi alanları (tek kist hücreleri veya kistik doku seçilen alanlar) seçin ve tercih edilen veri analiz yazılımı içine her bir kanal (340 ve 380 nm) için yoğunluk değerlerini hesaplamak; her bir veri noktasından çıkarma arka yoğunluk değerleri. </li><li> Her zaman noktası için Fura-02:00 340 380 kanalların yoğunluklarının oranı hesaplanır. Plot dağılım / her bölge için Ca 2+ geçici hat noktası-time değişiklikleri ve hesaplamak ortalama / SE değerleri. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biz ORPBH bir murin genetik modelinde elde edilen kistik epitel mono tabakaları için geleneksel kumanda klemp tekniği ve epifloresans kalsiyum görüntüleme uygulamaları tarif. Protokol en dikkat kistleri (protokoller bölümünün adım 1.5) izolasyonuna ve elektrofizyolojik çalışmalar ödenmesi gereken üç adımda, oluşur. Bu anahtar prosedürler kapsamlı eğitim ve sabır gerektiren ve okuyucu seferde hüsrana olmamalıdır. Her şeyden önce, en dikkat kist tek tabakalı izola...

İyon kanalları, hücre büyümesi ve farklılaşması dahil olmak üzere bir çok fizyolojik işlevler, önemli bir rol oynamaktadır. Otozomal dominant ve resesif polikistik böbrek hastalığı (sırasıyla ADPKD ve ORPBH) tübüler epitel hücre kökenli böbrek sıvı dolu kistlerin gelişimi ile karakterize genetik bozukluklardır. Polikistik böbrek polycystins 1 ve hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının düzenlenmesinde rol oynayan 2, zar proteinlerini kodlayan PKD1 ya PKD2 genlerin mutasyonu neden olmaktadır. Kendi başına veya PKD1 ile bir kompleks olarak PKD2 da Ca2 + geçirgen katyon kanalı 1 olarak işlev görür. PKHD1 kodlayan genin Fibrosistin (tubulogenesis ve / veya epitel polarite devamını sağlayan bir kirpikler ilişkili reseptör benzeri protein) mutasyonları ORPBH 2 genetik ivme bulunmaktadır. Kist büyümesi karmaşık bir fenomen rahatsız çoğalması 3,4, anjiyogenez 5 dediferansiyasyon ve kutupsal kaybı eşlik etmektedirtübüler hücrelerin 6-8 lık. Kistik epitel Arızalı reabsorbsiyon ve artırılmış salgı lümen ve kist genişlemesi 9,10 sıvı birikimine katkıda bulunur. Bozulmuş akım bağımlı [Ca 2 +] i sinyal de PKD 11-15 döneminde cystogenesis ile bağlantılı olmuştur. Burada, tek bir kanal aktivitesi ve PCK sıçanlardan izole edilen kistik epitel mono tabakaları, hücre içi Ca + 2 seviyeleri patch-clamp ölçümleri için uygun bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, başarılı bir epitelyal Na + kanalı (ENaC) 10 aktivitesinin karakterize edilmesi için tarafımızdan uygulandı ve [Ca2 +] i Ca2 + geçirgen TRPV4 ve purinerjik sinyal kaskadı 13 tarafından uyarılan işlemleri bağımlı. Bu çalışmalarda, biz PCK fareleri PKHD1 geninde kendiliğinden mutasyon nedeniyle ORPBH bir model kullanılır. PCK zorlanma originall olduSprague-Davvley (SD) sıçanlarda 16 böylece SD sıçanlarına PCK soyu ile karşılaştırma için uygun bir kontrol olarak kullanılır türetilen y. Bunun bir sonucu olarak, aynı PCK sıçanlardan izole edilen sıçan SD nefron segment ve Genişletilmemiş toplama kanalları hem kistik epitelyum üzerinde deneyler için iki farklı karşılaştırma grupları olarak kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Polikistik böbrek hastalığı sırasında Kist başlatma ve genişletme tübüler hücre çoğalması, lümen sıvı birikimi ve hücre dışı matriks oluşumu anormallikleri ile karakterize karmaşık bir süreçtir. Iyon kanalları ve hücre içi kalsiyum sinyalizasyon aktivitesi tübüler epitelyum işlevlerini belirleyen temel fizyolojik parametrelerdir. Biz taze böbrek kistleri izole epitel mono tabakaları hücre içi Ca 2 + düzeyinin patch-kelepçe tekniği ve kayıt iyon kanalları aktivitenin gerçek zamanlı gözlem için uygun bir yöntem geliştirdi. PCK sıçan, otozomal resesif polikistik böbrek hastalığı (polikistik böbrek hastalığı) genetik bir modelidir, iyon kanalları ve kalsiyum akışının ex vivo analiz için kullanılmıştır. Burada anlatılan tek kanal aktivitesini ve hücre içi Ca + 2 dinamiklerini kistik mono tabakaları ve PCK veya normal Sprague Dawley (SD) sıçanların olmayan dilate tübüller izole ve izlemek için tasarlanmıştır ayrıntılı bir adım-adım bir yöntemdir.Bu yöntem, enzimatik işleme gerektiren ve taze izole epitel Tek tabakalı bir yerli ortamda analiz izin vermez. Ayrıca, bu teknik, hücre içi kalsiyum değişikliklere çok duyarlı olduğu ve hassas ölçümler için yüksek çözünürlüklü görüntüler üretir. Son olarak, izole edilmiş bir kistik epitel Antikorların ya da boyalar, çeşitli biyokimyasal deneyler için birincil kültürleri hazırlanması ve saflaştırılması ile lekeleme için kullanılabilir.

Cystogenesis potansiyel ENaC tutulumu ORPBH murin modelleri ve doku kültürleri 26-28 PKD ilerlemesi 22-25 ve anormal sodyum reabzorpsiyonunda sinyal kesintiye epidermal büyüme faktörü (EGF) gözlemlenen çeşitli çalışmalar tarafından ortaya konmuştur. Örneğin, Veizis ve ark., Amiloride duyarlı Na + absorpsiyon ORPBH 29 olmayan ortolog BPK fare modelinde CD hücrelerinde azalmış olduğunu göstermiştir. Biz son zamanlarda kistleri bozulmuş sodyum ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium at JoVE.com

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Görüntüleme.  Medical College of Wisconsin.  Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın. 

Video: Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Kaliks Patch Kelepçe Kapasitans Kayıtlar Yöntemleri

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

Biyoloji

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Geliştirilmiş Patch-kelepçe kayıt için Basınç-parlatma Pipetler

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Görüntüleme ve Patch-Kelepçe Elektrofizyoloji için dev Liposome Hazırlık

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...