Name: optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers at JoVE.com

The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA, 
Telethon - Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).

Fotoaktif Substratlar hazırlanması 1. <ol><li> Bir P3HT hazırlayın: PCBM çözeltisi: benzen (1 ağ / ağ 1) 20 g / L&#39;lik bir konsantrasyonda P3HT. 60 ° C&#39;de en az 4 saat boyunca manyetik bir karıştırıcı ile çözelti karıştırın. Her bir taban hazırlanacak çözeltinin 150 ul&#39;lik bir hacim düşünün. </li><li> Temiz İTO kaplı cam slaytlar bir sonikatöre deiyonize su, aseton ve izopropanol ardışık banyolar ile (R, s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, kalınlık 170 um) (her bir aşama için 10 dakika). Bir azot tabancası ile lamelleri kurulayın. 10 dakika boyunca 100 W gücünde bir plazma temizleyici örnekleri koyun. </li><li> Döndürmeli kaplama ile temizlenmiş alt tabakalar üzerinde aktif tabakanın ince bir film oluşturur. <ol><li> Bir Elmas ucu olan, İTO kaplı yüzeylerde aynı yanal boyutları bir mikroskop cam slayt, (kalınlık ≈ 1 mm) kesti. Sıcak plakadan PCBM çözeltisi ve bu, ortam sıcaklığına kadar soğuması: P3HT çıkarın. </li><li> Iki st ayarlamaeps spin-lak programı: i) 800 rpm&#39;de 30 sn; ii) 1600 rpm&#39;de 30 saniye. Spin-kaplayıcının aynanın slayt yerleştirin ve bunu düzeltmek için vakum başlar. İTO kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde slayt aseton bir damla ve daha sonra temizlenmiş substrat, koyun. Fazla aseton kurtulmak için spin-lak rotasyon başlatın. </li><li> Yüzeylerde PCBM çözümü ve tekrar spin-kaplayıcı (1.3.2 açıklanan aynı protokolü kullanın) başlatın: P3HT 150 ul koyun. </li><li> Spin-kaplayıcı bittikten sonra, örneği kaldırmak ve dikkatle cam slayt kaplı alt tabakayı çıkarın. Aseton batırılmış bir bez ile temiz oda substrat arkasını temizleyin. Not: kullanılana kadar fotoaktif alt-tabakalar ile karanlık bir kutu içinde birkaç gün muhafaza edilebilir. Daha uzun süreler için, soy gaz ile bir eldiven kutusu içinde tutmak. </li></ol></li></ol> Hücre Kültürü Orta ve Elektrofizyoloji Çözümleri 2. Hazırlık <ol><li> Tam büyüme ortamı (CGM) hazırlayınHEK-293 hücreleri: Dulbecco&#39;nun Eagle ortamında ısı ile inaktive edilmiş olup% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin ile takviye edilmiş (DMEM) değiştirildi. 4 ° C &#39;de 0.2 um filtrasyon sistemi ve mağaza ile orta sterilize edin. </li><li> 135 NaCl, 5.4 KCl, 5 HEPES, 10 Glikoz, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2: ultra-saf su (mM olarak konsantrasyonlar) hücre dışı çözelti hazırlayın. NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlayın. 4 ° C &#39;de 0.2 um filtrasyon sistemi ve mağaza ile çözelti sterilize edin. </li><li> (MM konsantrasyonları) hücre içi ultra saf su ile çözüm hazırlayın: 12 KCI, 125 K-Glukonat, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. ATP-Na 2 ısıya duyarlı olduğunu unutmayın ve en son ekleyin. NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlayın. -20 ° C&#39;de, bir 0.2 mikron filtre sistemi ile bir çözüm, kısım 1 ml&#39;lik tüplerde ml ve mağaza sterilize edin. </li></ol> 3. Kaplama HEK-293 hücreleriAktif Yüzeyler üzerinde <ol><li> Bir cam kabın alüminyum ya da kapalı bir Petri kabı kapatıldı ve sterilizasyon için 2 saat boyunca 120 ° C&#39;de bir fırına konulur olarak fotoaktif substrat yerleştirin. Itibaren bu andan itibaren, steril şartlarda tüm işlemleri gerçekleştirmek. Steril bir kaput örnekleri koymak ve onları soğumasını bekleyin. </li><li> Coat bir yapışma tabakası ile fotoaktif yüzey yüzey hidrofobikliğini azaltmak ve hücre yapışmasını teşvik etmek. <ol><li> Bir P35 Petri kabındaki aktif yüzeylerde veya 6 çukurlu plaka koyun. Konjuge polimer tabakasının hidrofobisitesi göz önüne alındığında, bir polidimetilsiloksan (PDMS) iyi örnek düzeltmek ve çözümler sınırlandırmak için yapmak. <ol><li> Viskoz bir bulamaç elde etmek için, bir cam çubuk ile 1 oranında a 10 PDMS ve katalizör karıştırılır. </li><li> Her bir yarısı karşılamak için yeterli bir miktar dağıtma, 6 oyuklu bir plaka içerisinde bulamaç dökün. </li><li> Oda sıcaklığında PDMS polimerizasyonu için bekleyin. </li><li> Obta için ortada vulkanize PDMS KesilmişPolimer numunenin aynı boyutta bir kare şekli ining. </li><li> En az 30 dakika boyunca% 70 etanol-su karışımı içine daldırma ile PDMS kuyu sterilize edin. </li></ol></li><li> Iyi PDMS kullanıyorsanız, iyi hücre kültürü sonrası PDMS sökerken tüm katmanın ayrılmasını önlemek için, sivri cımbız ile kuyunun bütün sınır boyunca fotoaktif tabaka çizmeyin. </li><li> Fibronektin çözeltisi (PBS içinde 2 mg / L) ile, her numunenin tüm yüzeyini kaplar. Bir PDMS iyi (: 15x15 mm 2 de net yüzeyini) kullanıldığı takdirde numune başına 500-750 ul arasında bir hacim genellikle yeterlidir. De PDMS olmadan fibronektin çözeltinin yaklaşık 2 mi numuneyi tamamen sokmak için gerekli olan; çözeltisi eklenirken alt-tabaka taşmaması açısından dikkat edin. En az 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir cam pipet ile fibronektin çözeltisi çıkarın ve 2 ml PBS ile bir kez yıkanır. </li></ol></li><li> Pl15.000 hücre / tam büyüme ortamında cm2 yoğunluğunda fibronektin tedavi edilen örnekler üzerinde HEK-293 hücreleri yedi. Bir kullanıldığında iyi PDMS, aksi takdirde 2-3 mi CGM&#39;nin gerekli olan, her bir örnek için CGM&#39;nin 750-1,000 ul bir hacim kullanın. 24-48 st için CO 2 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve% 5. </li></ol> 4. Optik Uyarım Protokol ve Elektrofizyolojik Ölçümler <ol><li> Isıtmaları için 37 ° C&#39;da bir su banyosu içinde, hücre dışı çözelti koyun; , hücre içi bir çözüm çözülme 34 gauge iğne ile 1 ml şırınga koymak ve ATP bozulmasını önlemek için buz ile temas halinde tutun. </li><li> Dikkatle PDMS kaldırarak de eğer mevcut, inkübatör hücre kaplı alt tabaka atın. Bir cam pipet ile büyüme ortamı çıkarın ve ekstrasellüler çözümü ile numuneyi durulayın. Hücre dekolmanı önlemek için yavaş yavaş ilerleyin. </li><li> Hücre dışı solutio ile elektrofizyoloji istasyonunun numune tutucu içine cihazı koymakn ve referans elektrot. Bir çekici ile yama-kelepçe taze cam mikropipetler hazırlayın (ideal direnç aralığında 2-4 M? Içindedir). Hücre içi çözelti ile pipet yarısını doldurun ve mikromanipülatör monte edilir. </li><li> Cihaz üzerinde yama sağlıklı bir hücrenin arayın. Fotoaktif substratın istenmeyen uyarma önlemek için, mikroskop aydınlatıcının önünde uzun dalga boylu geçiş filtresi (örneğin, bir kesik dalga boyu λ = 750 nm görünür emen polimerler için kullanılabilir) yerleştirilmesi, görüntüleme için IR aydınlatma kullanıldığında. </li><li> Seçili hücreyi yama ve mikroskobu (Şekil 1) floresan uyarma yol üzerinden numune ışık sunarak optik uyarılması için istenen protokolü uygulamak. Patch-clamp protokolünün detaylı tarifi burada referans 20 bulunabilir. <ol><li> Bir mikrometrik manipülatör ile hücre zarına yakın yama pipet yerleştirin. Yer belirleme sırasında, overpressur geçerlidirsırayla pipet e ucunda kir yapışmasını önlemek için. Pipet hücre üzerinde birkaç mikron olmalıdır. </li><li> Yama kontrol yazılımı üzerinde pipet direnci kontrol ederken hücre zarının doğru pipet düşürücü başlayın. Pipet direnci yaklaşık 1 M? Arttığında pipet ve hücre zarı arasında gigaseal oluşturmak üzere, bir hafif bir emme uygularken, pipet fazla basıncı çıkarın (yani, ölçülen direnç 1 GΩ daha yüksek değerlerde artmalıdır) . </li><li> Mühür istikrara kavuşturmak için potansiyel (HEK293 -40 potansiyeli hücre için mV kullanılabilir) istirahat beklenen hücreye yakın pipet bir negatif potansiyel uygulayın. Nedeniyle yama amplifikatörü ve / veya yama kontrol yazılımı göreli komutlarla pipet kapasitans kapasitif transientler dengeleyin. </li><li> Kısa ve yoğun emme darbe uygulayarak hücre sitoplazması elektrik erişime izin vermek için membran kırınpipet. Hücre membran potansiyeli izlemek için (hücreye enjekte hiçbir geçerli olan, yani I = 0) geçerli kelepçe moduna yama amplifikatör ayarlayın. Hücre potansiyeli kararlı olup olmadığını görmek için birkaç dakika bekleyin. </li><li> Hücreye istenen aydınlatma protokolünü uygulayın ve membran potansiyeli üzerindeki etkisini kaydedin. Not: aydınlatma mikroskop mimarisine bağlı olarak alttan veya üstten ya numune teslim edilebilir. <ol><li> De aktif madde tarafından emilir bir eksitasyon dalga boyu seçin; P3HT için iyi: PCBM harmanı, 450-600 nm aralığında bir dalga boyunda kullanılabilir. Uygun photoexcitation yoğunlukları aralığı 10-100 mW / mm 2 bulunmaktadır. Not: Sonuç (10-20 msn altında) Işığın Kısa darbeleri hücrenin geçici depolarizasyon, uzun süreli aydınlatma ise ışığı kapatılana kadar sürekli hiperpolarizasyon görülmektedir (milisaniye veya daha uzun bakliyat yüzlerce). </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

<ol>
	<li>Alivisatos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotools+for+Neuroscience+and+Brain+Activity+Mapping.">Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping.</a> ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).</li><li>Spira, M. E., Hai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-electrode+array+technologies+for+neuroscience+and+cardiology.">Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology.</a> Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li><li>Bareket-Keren, L., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+interfaces+for+light+directed+neuronal+stimulation:+advances+and+challenges.">Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges.</a> Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).</li><li>Antognazza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+Light+on+Living+Cells.">Shedding Light on Living Cells.</a> Adv. Mater. , (2014).</li><li>Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+semiconductors+for+artificial+vision.">Organic semiconductors for artificial vision.</a> J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).</li><li>Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic-based+tristimuli+colorimeter.">Organic-based tristimuli colorimeter.</a> Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509 (2007).</li><li>Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+Organic+Electronics+in+Biology:+Materials+and+Devices.">Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices.</a> Adv. Mater. , (2014).</li><li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuroGrid:+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain.">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).</li><li>Campana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrocardiographic+Recording+with+Conformable+Organic+Electrochemical+Transistor+Fabricated+on+Resorbable+Bioscaffold.">Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold.</a> Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).</li><li>Bonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lysinated+Thiophene-Based+Semiconductor+as+a+Multifunctional+Neural+Bioorganic+Interface.">A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2015).</li><li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transparent+organic+transistor+structure+for+bidirectional+stimulation+and+recording+of+primary+neurons.">A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons.</a> Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).</li><li>Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rise+of+Organic+Bioelectronics.">The Rise of Organic Bioelectronics.</a> Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).</li><li>Pires, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+differentiation+by+electrical+stimulation+using+a+cross-linked+PEDOT+substrate:+Expanding+the+use+of+biocompatible+conjugated+conductive+polymers+for+neural+tissue+engineering.">Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering.</a> BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).</li><li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+bioorganic+interface+for+neuronal+photoactivation.">A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation.</a> Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).</li><li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymer+optoelectronic+interface+restores+light+sensitivity+in+blind+rat+retinas.">A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas.</a> Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).</li><li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+of+Whole-Cell+Conductance+in+Primary+Rat+Neocortical+Astrocytes+Mediated+by+Organic+Semiconducting+Thin+Films.">Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films.</a> Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).</li><li>Martino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+cellular+stimulation+in+functional+bio-polymer+interfaces.">Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces.</a> Sci. Rep. 5 (8911), (2015).</li><li>Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+solid-liquid+polymer+photodiode+for+the+bioenvironment.">A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment.</a> Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Neuroscience.+Patch+Clamp+Electrophysiology.">Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology.</a> JoVE Science Education Database. , (2015).</li><li>Scarpa, G., Idzko, A. L., G&#246;tz, S., Thalhammer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatibility+Studies+of+Functionalized+Regioregular+Poly(3-hexylthiophene)+Layers+for+Sensing+Applications.">Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications.</a> Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).</li><li>Bellani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+P3HT/Oxygen+Charge+Transfer+Complex+Identification+in+Thin+Films+Exposed+to+Direct+Contact+with+Water.">Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).</li><li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+stimulation+of+neural+tissue+in+vivo.">Optical stimulation of neural tissue in vivo.</a> Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).</li><li>Duke, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+selective+suppression+of+neural+activity+with+infrared+light.">Transient and selective suppression of neural activity with infrared light.</a> Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hücrelerin optik uyarımı esas olarak ışığa duyarlı polimer seçimi, ısıl sterilizasyon parametreleri, yoğunluğu ve ışık uyaranlara süresini ilgilidir in vitro için rapor edilen protokol kritik adım. Bir P3HT: iyi zamansal ve elektrokimyasal stabiliteyi garanti beri PCBM ince film, burada seçildi. Ancak, bir bütün ışığa duyarlı polimerler aydınlatma üzerine daha spesifik, 22 analog performansları sunabilir dikkat etmelidir. Buna ek olarak, bu durumda parametre polimerin op...

Hassas bir uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücre aktivitesini işlemek için bir olasılık sinirbilimsel araştırma ve nörolojik ve psikiyatrik bozuklukların tedavisinde çok önemli bir strateji temsil eder. 1 geleneksel metotlar çevresinde veya temas sağlayacak şekilde yerleştirilmiş elektrotlar kullanılarak hücrelerin elektrik stimülasyonu dayanmaktadır (in vivo beyin dokularında, tek hücre, hücresel şebeke, beyin dilimleri) farklı karmaşıklık olabilir hedeflenen sistem, 2. Geçtiğimiz yüzyılda, yama-kelepçe, metal ve yüzey entegre elektrotların kullanılması fizyolojisi ve tek nöronların ve sinir ağları işleyişi mekanizmalarının patofizyolojisi detaylı bir resmini sağladı. Ancak, elektriksel uyarım önemli sınırlamalar muzdarip. İlki nedeniyle kolayca adapte olamaz elektrotlar ve sabit geometri fiziksel boyutlar, bir genellikle kötü uzamsal çözünürlük ile ilgilidirBiyolojik dokuların gibi karmaşık organize sistemlere. Ayrıca, elektrotlar empedansına ve stimülasyon ve kayıt sistemler arasında çapraz konuşma ile ilgili sorunlar ölçümlerinin son sinyal-gürültü oranını etkileyebilir. 3 Öte yandan, stimülasyon için ışık kullanılması bir çok sınırlamalar üstesinden gelmeye yardımcı olabilir Elektrik yaklaşım. Her şeyden önce, bu mümkün, belirli hücre tipleri ve hatta alt-hücre bölmeleri hedef yapım görülmemiş uzaysal (&lt;1 mikron) ve temporal çözünürlük (&lt;1 msn) sunmaktadır. Bu ilgi doku ile herhangi bir fiziksel temas önler ve kayıttan stimülasyon disentangles beri ek olarak oldukça non-invaziv olduğunu. Ayrıca, ışık yoğunluğu ve dalga boyu, hem tam olarak kontrol edilebilir ve bu şekilde, farklı stimülasyon protokolleri uygulanabilir. 3,4 Bununla birlikte, hayvan hücrelerinin büyük bir çoğunluğu ışığa herhangi bir hassasiyet göstermezler. Optik stimulatio için çeşitli stratejilern, böylece, her iki yakın veya hücre içinde, ışığa duyarlı bir molekül mediatörler istismar veya hücre yakınında harici olarak yerleştirilen fotoaktif cihazı kullanılarak önerilmiştir. Birinci kategori görünür veya kızılötesi (IR) ışık ile uyarılması, hem de photocleavable / photoisomerizable bileşikler ya da ışığa molekül aktüatörler (optogenetics) &#39;deki genetik ekspresyonu ya da kullanımı gibi endojen mekanizmaları belirtmektedir. Bu ikinci tür inorganik nano / mikro-parçacıklar ya da foto-iletken silikon alt tabakaların kullanılması ile elde edilen dışsal uyan tekniklerini içerir. 5 Bununla birlikte tüm bu sistemler, parlak taraf ve dezavantajları vardır. Özellikle, görünür aralığında hücrelerin endojen emme, zayıf ve güvenilir değildir ve reaktif oksijen türlerinin üretimi eşlik hücre için zararlı olabilir. Genel olarak, İR nedeniyle su emme yerel termal ısıtma indüklemek için kullanılır, ancak suyun yok olma katsayısı dolayısıyla st gerektiren küçük,Standart mikroskop optik aracılığıyla teslim etmek ve in-vivo uygulamalar için güvenlik endişeleri oluşturabilecek zordur (onlarca W / mm 2 yüzlerce) rong kızılötesi ışık. Diğer taraftan, foto-değiştirilebilir kafes bileşikleri süresi sınırlı bir etkiye sahip olduğu ve çoğu zaman, sınırlı doku penetrasyonu sunmak için çok UV ışığı gerektirir. Ayrıca onlar aydınlatılmış alanı dışında photolysis üzerine aktive bileşiklerin difüzyon sorunları muzdarip. Son olarak, optogenetic araçları belirli hücresel subpopülasyonu ve alt bölmeleri hedef bilim adamları izin ve hızla sinirbilimsel araştırma anahtar teknolojilerden biri olarak ortaya çıkmaktadır. Ancak, viral vektör yoluyla eksojen DNA segmentini ekleyerek özellikle insan hastalarda benimsenmesi açısından önemli güvenlik sorunlarını ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenlerle 5,6, hücre optik manipülasyon yeteneğine sahip yeni malzemeler ve cihazlar üzerinde araştırmalar son derece sıcak bir konudur. Son yıllarda, yenietkin bir şekilde hücre elektriksel aktivitenin bir modülasyon giren bir optik uyaran transdüse mümkün ışığa duyarlı konjuge polimerlerin kullanımına dayalı bir yaklaşım, ileri sürülmüştür. 7 Onlar, biyouyumlu yumuşak ve uyumlu ve onların mekanik esneklik dokusu ile samimi bir arayüze sağlar; onlar görünür aralığında ışığa özünde duyarlıdır: Polimer Photoexcitation Hücre Stimülasyon (CSPP) tekniği, tipik organik yarı iletkenler birçok anahtar sağlayan özellikleri patlatır in-vitro ve in-vivo olarak her iki 8-10. Bunun dışında, onlar kolayca daha sondalama ve yeteneklerini algılama, belirli uyarma etkinleştirmek için canlı hücreler ile arayüzüne uyum, ve fonksiyonel hale getirilebilir. 11,12 Ayrıca, kombinasyon için idealdir, iyonik ulaşım yanı sıra elektronik destekleyen elektronik reklam biyoloji. İlginçtir 13,14, onlar harici önyargı f uygulamak gerek kalmaz, fotovoltaik modda çalışabilirya da verimli hücre optik uyarım. 15 CSPP tekniğinin güvenilirliği daha önce primer nöron, 15,16 astrositler, 17, ikincil hücre çizgileri 18 ve eksplante retina dokular da dahil olmak üzere, çeşitli sistemlerde ortaya konmuştur. Bu çalışmada 16, gerekli olan bütün aşamalar, ışığa duyarlı bir biyo-polimer imal etmek için in vitro sistemlerin optik uyarılması için bir arayüz 19 detaylı bir şekilde tarif edilmektedir. Olarak hareket eden bir elektron vericisi olarak işlev uygulama durumlarında, bölge normal poli (3-hexylthiophene) içindeki bir prototip organik fotovoltaik harmanı (rr-P3HT), ve fenil-C61-butirik asit-metil ester (PCBM) olarak elektron alıcısı kullanılır. Biyolojik bir sistem olarak, insan embriyonik böbrek (HEK-293) hücreleri kullanılır. Elektrofizyolojik ölçümler yoluyla hücre aktivitesi göreli kayıt ile photostimulation protokolünün bir örneği temin edilmiştir. Tarif platformuBununla birlikte, genel geçerliliğinin ve kolayca düzgün hücre kültürü protokolü değiştirilmesi istenen işlem ve zamanı kaplama ile, farklı hücre tipleri ((uygun çözelti hazırlama süreci ve çökelme parametrelerini ayarlayarak) diğer birleşik polimerlerin kullanılması uzatılabilir Hücre tohumlama ve çoğalması) ve farklı stimülasyon protokolleri (ışık dalga boyu, uyarı sıklığı ve süresi, photoexcitation yoğunluğu) için.

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ITO-coated substrates</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>chlorobenzene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acetone&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>HEK cells</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8008-</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>LGC standards srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

optical control of living cells electrical activity by conjugated polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Hücreler P3HT kolayca kültürlenebilir: PCBM substratları (tarif edilen protokol aşama 3,2 kullanılan fibronektin benzeri) uygun bir tutunma katmanı yatırılır koşuluyla. P3HT: Görünür spektrumun yeşil kısmında PCBM optik soğurma zirveleri; bununla birlikte diğer ışığa duyarlı eşlenik polimerler Tercih edilen photostimulation dalga boyları aralığında (Şekil 2) göre seçilebilir. . PCBM filmi gösterilmiştir: Bu alt-tabakaların Biyouyumluluk...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers at JoVE.com

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K Görüntüleme.  Istituto Italiano di Tecnologia. A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Video: Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Genetik

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Biyomühendislik

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.

This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.

Altın Nöronal Hücrelerde optik Uyarım Nanorod destekli

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Nörobilim

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, regardless of the method used. Toward this goal, optogenetic gene expression systems have gained much attention over the past decade for spatiotemporal control of protein levels in mammalian cells. However, most existing circuits controlling light-induced gene expression vary in architecture, are expressed from plasmids, and utilize variable optogenetic equipment, creating a need to explore characterization and standardization of optogenetic components in stable cell lines. Here, the study provides an experimental pipeline of reliable gene circuit construction, integration, and characterization for controlling light-inducible gene expression in mammalian cells, using a negative feedback optogenetic circuit as a case example. The protocols also illustrate how standardizing optogenetic equipment and light regimes can reliably reveal gene circuit features such as gene expression noise and protein expression magnitude. Lastly, this paper may be of use for laboratories unfamiliar with optogenetics who wish to adopt such technology. The pipeline described here should apply for other optogenetic circuits in mammalian cells, allowing for more reliable, detailed characterization and control of gene expression at the transcriptional, proteomic, and ultimately phenotypic level in mammalian cells.

Reliably controlling light-responsive mammalian cells requires the standardization of optogenetic methods. Toward this goal, this study outlines a pipeline of gene circuit construction, cell engineering, optogenetic equipment operation, and verification assays to standardize the study of light-induced gene expression using a negative-feedback optogenetic gene circuit as a case study.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely accepted by the scientific community, these systems are still limited in longevity due to the absence of non-invasive stimulation techniques. Phototransducers provide an efficient stimulation method, offering a wireless approach with high temporal and spatial resolution while minimizing invasiveness in stimulation processes. In this manuscript, we present a fully optical method for stimulating and detecting the activity of an in vitro cardiac microphysiological model. Specifically, we fabricated engineered laminar anisotropic tissues by seeding human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) generated in a 3D bioreactor suspension culture. We employed a phototransducer, an amphiphilic azobenzene derivative, named Ziapin2, for stimulation and a Ca2+ dye (X-Rhod 1) for monitoring the system&#39;s response. The results demonstrate that Ziapin2 can photomodulate Ca2+ responses in the employed system without compromising tissue integrity, viability, or behavior. Furthermore, we showed that the light-based stimulation approach offers a similar resolution compared to electrical stimulation, the current gold standard. Overall, this protocol opens promising perspectives for the application of Ziapin2 and material-based photostimulation in cardiac research.

Using light to control cardiac cells and tissue enables non-contact stimulation, thereby preserving the natural state and function of the cells, making it a valuable approach for both basic research and therapeutic applications.

Genetik Olmayan Optik Stimülasyon Yoluyla Ca2+ Yayılımını İncelemek için Kardiyak Mikrofizyolojik Bir Sistem

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective neural modulation or monitoring. As specific types of neuronal cells can be genetically modified to express opsin proteins, optogenetics enables optical stimulation or inhibition of the selected neurons. There have been several technological advances in the optical system for optogenetics. Recently, it was proposed to combine the optical waveguide for light delivery with electrophysiological recording to simultaneously monitor the neural responses to optogenetic stimulation or inhibition. In this study, an implantable optrode array (2x2 optical fibers) was developed with embedded multichannel electrodes. 
A light-emitting diode (LED) was employed as a light source, and a microfabricated microlens array was integrated to provide sufficient light power at the tip of the optical fibers. The optrode array system comprises the disposable part and the reusable part. The disposable part has optical fibers and electrodes, while the reusable part has the LED and electronic circuitry for light control and neural signal processing. The novel design of the implantable optrode array system is introduced in the accompanying video in addition to the procedure of the optrode implantation surgery, optogenetic light stimulation, and the electrophysiological neural recording. The results of in vivo experiments successfully showed time-locked neural spikes evoked by the light stimuli from hippocampal excitatory neurons of mice.

Here, we present the fabrication method of an optrode system with optical fibers for light delivery and an electrode array for neural recording. In vivo experiments with transgenic mice expressing channelrhodopsin-2 show the feasibility of the system for simultaneous optogenetic stimulation and electrophysiological recording.

Eşzamanlı Optogenetik Modülasyon ve Elektriksel Nöral Kayıt için Optrode Dizisi

During the last decade, optogenetics has become an essential tool for the investigation of neural signaling due to its unique capability of selective ...

A Light-Stimulation Grid Approach to Study Cellular Optogenetic Protein

Mapping the Cellular Distribution of an Optogenetic Protein Using a Light-Stimulation Grid

Our goal was to accurately track the cellular distribution of an optogenetic protein and evaluate its functionality within a specific cytoplasmic location. To achieve this, we co-transfected cells with nuclear-targeted cAMP sensors and our laboratory-developed optogenetic protein, bacterial photoactivatable adenylyl cyclase-nanoluciferase (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc, when stimulated with 445 nm light or luciferase substrates, generates adenosine 3&#39;,5&#39;-cyclic monophosphate (cAMP). We employed a solid-state laser illuminator connected to a point scanning system that allowed us to create a grid/matrix pattern of small illuminated spots (~1 &#181;m2) throughout the cytoplasm of HC-1 cells. By doing so, we were able to effectively track the distribution of nuclear-targeted bPAC-nLuc and generate a comprehensive cAMP response map. This map accurately represented the cellular distribution of bPAC-nLuc, and its response to light stimulation varied according to the amount of protein in the illuminated spot. This innovative approach contributes to the expanding toolkit of techniques available for investigating cellular optogenetic proteins. The ability to map its distribution and response with high precision has far-reaching potential and could advance various fields of research.

This protocol involves transfecting cAMP sensors and bPAC-nLuc, an optogenetic protein, to accurately track its cellular distribution and response to light stimulation. The innovative approach of creating a cAMP response map using a point scanning system holds the potential for advancing research with optogenetic proteins in different fields.