The authors thank the Swedish Society for Medical Research, the Promobilia Foundation, the Crown Princess Lovisa Foundation, the Freemason Foundation for Children&#8217;s Welfare, the Swedish Society of Medicine, the Solstickan Foundation, Karolinska Institutet, and the Stockholm City Council for financial support.

Tüm hayvan protokolleri Hayvanlar Stockholm İl Komitesi tarafından önceden onaylanmış ve tüm işlemler hayvan kullanımı yanı sıra, ilgili federal yasalar için düzenlemeler uymuştur. 1. Hayvan Prosedürleri <ol><li> Cerrahi Hayvan Hazırlama <ol><li> steril koşullar altında çalışması için gerekli tüm malzeme ve enstrümanlar ile cerrahi tablo hazırlayın. enfeksiyon riskini azaltmak ve hayatta kalma cerrahi koşulları optimize etmek için steril koşullar altında sadece ameliyat. </li><li> ameliyat öncesi 12 saat boyunca hayvan oruç ve ağırlığını ölçün. premedikasyonu azaperone bir kas içine enjeksiyon (2 mg / kg) uygulayınız. tiletamine hipoklorit (2.5 mg / kg), zolazepam hipoklorit (2.5 mg / kg), medetomidin (25 ug / kg) ve atropin (/ kg 25 ug) kas içine enjeksiyon ile hayvan anestezisi. </li><li> phenobarbiturate enjekte (15 mg / kg) endotrache önceal entübasyon ve% 0.8 -2% izofluran ile genel anestezi devam eder. tek kulakta bir periferik ven kateteri yerleştirin ve hayvan refahını korumak için intravenöz işlem sırasında glikoz (25 mg / ml) demlenmeye. </li><li> ısısını, kan basıncını, doygunluk ve periferik nabız kontrol etmek için kulak veya kuyruk izleme cihazları yerleştirin. kulakları veya toynakları ağrı stimülasyonu ile kontrol anestezi. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlere merhem sürün. </li></ol></li><li> Mesane Biyopsi Numune eksizyonu <ol><li> Yarı steril koşullarda idrar boşaltmak için üretra görüntüleyebilir ve üretra yoluyla katater takmak bir spekulum tanıtarak ve mesane içine 10 Fransız silikon kateter kullanılarak mesaneye kateter. 20-25 cm H2O, yaklaşık 100-300 ml bir basınca, steril tuzlu su çözeltisi ile mesane doldurmak ve daha sonra, boş O 2 cm, H 20 (yakl. 8 ml / kg vücut ağırlığı). </li><li> the domuz dikkatli bir yan konumuna döndürülmüş klorheksidin glukonat uygulama ile deri temel bir ameliyat öncesi sterilizasyon gerçekleştirin. Tıraş makası ile pelage kaldırdıktan sonra omuz bir diatermi plaka uygulayın. </li><li> sırtüstü pozisyonda dikkatlice domuz çevirin ve tıraş makas kullanılarak karın pelage kaldırmak ve klorheksidin glukonat uygulaması ile karın derisinin temel preoperatif sterilizasyon yapmak. <ol><li> Yumuşak giysilerle ekstremite embed ekstremitelerde eklemlere hiperekstansiyon zarar görme riskini en aza indirmek için. klorheksidin glukonat ardışık uygulamaları ile hayvanın karın cildi sterilize ve cerrahi alan etrafında steril dökümlü yerleştirin. </li></ol></li><li> cilt insizyonu önce, göbek altındaki orta hat buprenorfin (45 ug / kg), karprofen (3 mg / kg) ve lidokain lokal enjeksiyonu içeren bir damar içi analjezik uygulanır. sk tutarak ağrı reaksiyonu kontrol edinforseps ile. fasya yoluyla daha düşük bir orta hat kesi yapmak ve kanama kontrolü için diatermi kullanarak periton. domuz tamamen intraperitoneal bir konuma sahiptir ve serbestçe cerrahi yara aracılığıyla seferber ederek maruz kalabilirler mesane yerelleştirilmesine. </li><li> forseps ile mesanenin tutun ve steril bir ölçüm bandı ile ölçmek ve bir steril kalem kullanarak, uzunlamasına yaklaşık 2 cm ve enine 1 cm veya daha küçük bir eliptik şekilli biyopsi örneği işaretlemek (domuz mesane boyutu çeyrek azalma tahammül çok iyi). , Işaretli alana tüketim bir neşter kullanılarak, ve steril şartlar altında DMEM mesane biyopsi örneği yerleştirin. </li><li> biotransplant ile ototransplantasyon gerçekleştirin veya iki kat 5-0 vicryl ile dikilmesi yoluyla mesane kapatın. 2-0 ya da 3-0 Vikril çalışan özenle karın fasya kapatın. 3-0 vicryl ile subkutiste ve 3-0 etilon ile cilt kapatın. Yaranın üzerine dikkatle bir pansuman yerleştirinanestezi yeterince kurtarıldı ve ağrıyı ifade etmez kadar hayvana eğilimindedir. </li><li> postoperatif bakım koşullarını sağlamak için hayvan bakım tesisi için hayvan taşımak. bir ısıtma lambası ile tek bir kafeste hayvan koyun ve katılmak hayvana anestezi tam iyileşme kadar ve daha sonra hayvanlar çiftler halinde durmuş olsun. </li><li> ağrı ve refahı ile ilgili olaysız bir kurtarma sağlamak ve beş gün boyunca günde bir kez üç gün boyunca günde iki kez intramüsküler postoperatif analjezi ve trimetoprim (4 mg / kg) ve sülfonamid (20 mg / kg) için buprenorfin (45 ug / kg) yönetmek ve ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltır. </li></ol></li><li> Cilt Biyopsi Numune eksizyonu <ol><li> gerekli tüm malzemeler ile cerrahi tablo hazırlayın. Daha önce 1.1 de tarif edildiği gibi hayvan anestezisi. , Balmumu kullanarak pelage çıkarın yıkayın ve betadin ve% 70 alkol ile kesi alan sterilize ve daha sonra steril dökümlü aroun koyunkesi alanı d. </li><li> 0.3 mm parsiyel kalınlıkta deri biyopsi örneği hasat bir dermatom kullanın. 2.2 de tarif edildiği gibi, kıyma önce DMEM deri örneği yerleştirin. yağlı merhem ve bir pansuman ile yara alanı kapsayacak. </li></ol></li></ol> 2. Kıyma Doku Hazırlanması <ol><li> mesane Mukoza <ol><li> DMEM içinde iki kez mesane biyopsisi yıkayın. yukarı bakacak şekilde mukoza ile steril diseksiyon tabağa mesane biyopsi örneği yerleştirin ve diseksiyon pimleri kullanarak plaka taraflardan biri düzeltmek. </li><li> Ince makas ve forseps (Şekil 3) kullanılarak detrusor kas mukozal doku ayırın ve bunun üzerine tuz veya DMEM damlayan nemli mukoza tutun. </li><li> mukoza üzerinde yerleştirerek kıyma cihazı kullanın ve daha sonra 0.8 mm x 0.8 mm kıyılmış doku parçalarını elde etmek için manuel basınç uygulayarak, dikey ve yatay bir uçtan diğer uca cihazı pass (0.8 mm rotatin arasındaki mesafeg) kesme bıçakları. </li></ol></li><li> cilt <ol><li> cilt biyopsisi ile eğer kalın: steril diseksiyon plaka üzerine cildi yerleştirin ve deri altı yağ ve dermis epidermis ayırmak için cerrahi makas kullanın. epidermis ince ve saydam (yakl. 0,3 mm) o kıyma için hazır olduğunda. </li><li> epidermis üzerine yerleştirerek kıyma aygıtı kullanın. baskı ile, 0.8 mm X 0.8 mm kıyılmış doku parçalarını elde etmek için yatay olarak dikey olarak bir uçtan diğer uca cihazı geçerek. </li></ol></li></ol> Plastik Sıkıştırılmış PCL / Kollajen Otogreftlerin 3. hazırlanması <ol><li> soğuk tutmak için buz üzerinde tüm malzemeyi yerleştirin. gerekli Kaplar: Falcon tüp, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH ve sıçan kuyruğu kollajen tip 1. <ol><li> 1. 1 N NaOH, damla damla ekleme yoğun arasında değişen pH göstermelidir ortam içinde 7,4-8 (renk pH değerine getirmek için kollajen tip 12 ml 10x DMEM (dikkatli bir şekilde kabarcıklarını önlemek için) 2 ml karıştırın pin sarık). Buna ek olarak, bir pH kağıdının kullanımı. </li><li> Dikkatle 1x DMEM 2 ml ekleyin ve çözüm karıştırın. Çelik levha dikdörtgen kalıp (20x30x10 mm) her kollajen, yaklaşık 2 ml, 37 ° C&#39;de inkübe 10 dakika boyunca% 5 CO2 içinde ° C. Not: kolajen konsantrasyonu 2.06 mg /% 0.6 asetik asit ilave edin ve bir kolajen 1 mi / cm2 kadar olmalıdır. </li><li> kollajen kalıba ayarladığında, kolajen jeli (20 mm x 30 mm) üzerine biyo materyal (PCL) yerleştirin ve üstünde kalan kollajen (yaklaşık 6 mi) dökün. 20 dakika boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> kollajen jel üstünde: kıyılmış doku (6 genişleme 1) yerleştirin. Aşağıdaki gibi plastik sıkıştırma kullanarak mekanik kuvvet tarafından yapının suyu dışarı basın (Şekil 3 ve 4). </li><li> steril bir yüzey üzerinde gazlı bez kalın bir tabaka yerleştirin. Gauz üstünde bir paslanmaz çelik hasır (kalın 400 mikron) yerleştirine yastıkları ve naylon örgü (kalın 110 mikron) ve daha sonra bir levha. Dikkatle naylon örgü üzerine kollajen jel / kıyılmış doku transferi ve dikkatli bir şekilde dikdörtgen çelik kalıp çıkarmak. </li><li> kollajen jel / kıyılmış doku üstünde naylon örgü yeni bir katman yerleştirin. Naylon filtre üzerine kurulu bir ikinci çelik örgü yerleştirin. Pozisyonda, 5 dakika boyunca 120 g (yani, cam plaka) en az ağırlık basıncı veya yükleme plaka koyun. </li><li> ağırlık, naylon ve çelik kafes çıkarın. Otogreftleri şimdi tam kalınlıkta deri yaraları domuz mesane dikilir ya da in vitro kültür için hazırız. </li><li> In vitro kültür için, 12 gözlü levhalar monte küçük parçalar halinde ince bir yapı kesti. keratinosit ortamın 1 ml ilave edilir. 37 ° C, 6 haftaya kadar% 5 CO 2 ve kültür kuvöz tabak yerleştirin ve haftada orta 3 kez değiştirin. </li></ol></li></ol> Otogreftlerin 4. Dikiş <ol><li> otogreftin sütür ileDomuz mesaneye kıyılmış mesane mukozası <ol><li> bekleme süresi boyunca DMEM nemli otogreft tutun. İnce çalışan monofilament sütür ile otogreft dikin. araştırma amaçlı emilmeyen 5-0 etilon kullanın. </li><li> üriner kateter aracılığıyla serum fizyolojik ile mesane doldurularak su geçirmez olmadığını kontrol edin. Mümkünse, büyük omentum bir tabaka ile otogreft kapsamaktadır. 1.2.6 açıklandığı gibi karın duvarı, deri altı dokusu ve cilt kapatın. bir yara pansuman uygulayın. </li></ol></li><li> Tam kat Yara için Kıyma Cilt Epidermis ile otogreftin sütür <ol><li> bekleme süresi boyunca DMEM nemli otogreft tutun. </li><li> yakından alttaki yüzeye bağlı otogreft tutmak için köşelerde suturlarla ve otogreftin ortasında yara cilt tam kalınlıkta altına otogreft dikin. </li><li> yara nemli tutan plastik bir örtü ile yarayı örtün. </li></ol></li></ol><ol><li> kas içi zolazepam hipoklorit enjeksiyonu (2.5 mg / kg) ve medetomidin&#39;den (25 ug / kg) önce fesih ve kulak veya kuyruk izleme cihazları uygulamak ile oturaklı hayvan nabız ve kan basıncı kontrol etmek için. </li><li> intravenöz pentobarbital sodyum (60-140 mg / kg) öldürücü bir miktarının uygulanması ile hayvan öldürülür. ölüm meydana gelmiştir kadar nabız ve kan basıncını kontrol edin. </li></ol> 6. İn Vitro Kültür Not: histolojik, in vitro olarak PCL / kollajen yapılarında kıyılmış doku ilerlemesini değerlendirmek için, kollajen / PCL / kıyılmış yamalar keratinosit ortamı kullanılarak 12 oyuklu plakalar içerisinde kültürlendi. <ol><li> keratinosit ortamının hazırlanması: <ol><li> 500 ml&#39;lik bir cam şişe sterilize edin. </li><li> (1: Karışım 4) Ham F12, 100 ml DMEM 400 ml karıştırın. % 10 fetal bovin serumu ile takviyesi, 5 ug / ml insülin,0.4 ug / ml hidrokortizon, 21 ug / ml adenin, 10 -10 mol / L kolera toksin, 2 x 10 -9 mol / L triiyodotironin / ml transferin, 10 ng / ml, epidermal büyüme faktörü, 50 U / ml penisilin 5 ug ve / ml streptomisin 50 ng. </li><li> 0.2 um&#39;lik bir filtre içinden filtre etme ile sterilize ve steril 500ml şişe içinde süzüntü toplanır. </li></ol></li></ol> 7. İmmünhistokimya NOT: immünhistokimya protokolü genellikle aşağıdaki adımları ayrılır: (1) tespit ve parafin gömme, (2) mikro-kesit 5 mikron dilimleri, slaytlar, deparaffination ve rehidrasyon yerleştirme için, (3) antijen maskesinin düşürülmesi, boyama ve montaj . immünhistokimya prosedüründe son adımları başlamadan önce, yıkama tamponlar ve antijen maskesinin düşürülmesi solüsyonu (ayrı malzeme detaylarını görmek) hazırlar. Kullanmadan önce, ABC kompleksi çözeltisi, en azından 30 dakika hazırlayın. <ol><li> tespit HAYIRT: aşağıdaki gibi in vitro kültürü sonunda, yamalar gidermek: <ol><li> % 4 tamponlu formaldehit (PFA) 1 ml Eppendorf tüpleri hazırlayın (Dikkat:.. Formaldehit zehirli olan bu kimyasal ile çalışmaya başlamadan önce malzeme güvenlik bilgi formlarını okuyun eldiven ve koruyucu gözlük takın ve bir davlumbaz içine solüsyon hazırlanır Lütfen). </li><li> % 4 PFA içeren bir Eppendorf tüpüne, kolajen yamalar her transfer. Oda sıcaklığında gece boyunca sabitleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de uzun süreli depolama için% 70 etanol içinde Örnekleri. Numuneler artık dehidratasyon hazır ve kesit önce parafin bloklarda gömme vardır. </li></ol></li><li> rehidrasyon <ol><li> 15 dakika boyunca X-tra Solv bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. X-tra Solv ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. 10 dakika boyunca mutlak etanol ile bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. mutlak etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. % 95 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar, 10 dakika boyunca ve daha sonra, koyun10 dakika süre ile,% 70 etanol olan bir boyama kavanoza. Son olarak damıtılmış su ile 5 dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın. </li></ol></li><li> antijeninin ortaya çıkartılması <ol><li> TE çözeltisi ile Coplin kavanoza slaytlar koyun ve 20 dakika için kaynamaya bir su banyosu içinde kavanoza koyun. dikkatle su banyosu dışında kavanoz alın. 30 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar slaytlar soğutun ve Tris tamponu içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkanır. 10 dakika süre ile% 3 hidrojen peroksit ile boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. Tris tampon maddesi içinde 5 dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın. kalem işaretleme bir su itici kullanarak numunelerin etrafında bir daire çizin. </li><li> bloklama çözeltisi 100-300 ul kullanılarak antikorun spesifik olmayan bağlanmayı bloke eder. Engelleme çözeltisini çıkarın ve Tris tamponu içinde önerilen yoğunlukta çözüldü birincil antikor 100-300 ul ekle. gece inkübe edin. Antikor çözeltisi çıkarın ve 5 dakika boyunca iki kez Tris tamponu bölümleri yıkayın. </li><li> oda sıcaklığında bir 1 saat için ikincil antikor ile inkübeure. Tris tampon maddesi içinde 5 dakika boyunca iki kez yıkanır. ABC Elite Kiti (üreticinin talimatlarına uyun) kullanılarak 30 dakika inkübe edin. Tris tampon maddesi içinde iki kez yıkayın. </li><li> üreticinin talimatlarına (1-7 dk inkübasyon genellikle açık mor yoğunluğu üretir), Vektör VIP Kit kullanarak takip ederek antikor reaksiyonu geliştirin. distile su slaytlar koyun. 30 sn Mayer&#39;in hematoksilen ile counterstain. </li><li> 5 dakika boyunca akan su içinde yıkayın. 1 dakika boyunca% 70 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. % 70 etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. 1 dakika boyunca% 95 etanol olan bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. % 95 etanol ile yeni bir boyama kavanoz kullanarak tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca X-tra Solv bir boyama kavanoz slaytlar yerleştirin. nemli tutmak için bir seferde, tek çıkarın. Her bir slayt üstüne montaj orta bir damla koyun ve üstüne bir cam kapak (hava kabarcıklarını önlemek için çok dikkatle yapmak) koyun. slaytlar gecede kurumasını bekleyin ve bir mikro altında slaytları görüntülemekkapsamı. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+cultivation+of+strains+of+human+epidermal+keratinocytes:+the+formation+of+keratinizing+colonies+from+single+cells.">Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells.</a> Cell. 6, 331-343 (1975).</li><li>Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+multilayered+urinary+tissue+in+vitro.">Engineering of multilayered urinary tissue in vitro.</a> Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).</li><li>Salmikangas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing,+characterization+and+control+of+cell-based+medicinal+products:+challenging+paradigms+toward+commercial+use.">Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use.</a> Regen Med. 10, 65-78 (2015).</li><li>Fossum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minced+skin+for+tissue+engineering+of+epithelialized+subcutaneous+tunnels.">Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels.</a> Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).</li><li>Fossum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minced+urothelium+to+create+epithelialized+subcutaneous+conduits.">Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits.</a> The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).</li><li>Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+autologous+minced+bladder+mucosa+for+a+one-step+reconstruction+of+a+tissue+engineered+bladder+conduit.">Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit.</a> BioMed Research International. 2013, 212734 (2013).</li><li>Meek, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+microdermagrafting+using+the+Meek-Wall+microdermatome.">Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome.</a> Am J Surg. 96, 557-558 (1958).</li><li>Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mesh+skin+graft.">The Mesh skin graft.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).</li><li>Svensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+skin+transplantation:+comparison+of+minced+skin+to+other+techniques.">Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques.</a> The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).</li><li>Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-stage+tissue+engineering+of+bladder+wall+patches+for+an+easy-to-use+approach+at+the+surgical+table.">One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).</li><li>Engelhardt, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collagen-poly(lactic+acid-co-varepsilon-caprolactone)+hybrid+scaffold+for+bladder+tissue+regeneration.">A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration.</a> Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).</li><li>Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrarapid+engineering+of+biomimetic+materials+and+tissues:+fabrication+of+nano-+and+microstructures+by+plastic+compression.">Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression.</a> Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).</li><li>Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-gripping+mesh+versus+staple+fixation+in+laparoscopic+inguinal+hernia+repair:+a+prospective+comparison.">Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison.</a> Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).</li><li>Muangman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+Wound+Management+Utilizing+an+Artificial+Dermal+Matrix.">Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix.</a> Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).</li><li>Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constructs+of+electrospun+PLGA,+compressed+collagen+and+minced+urothelium+for+minimally+manipulated+autologous+bladder+tissue+expansion.">Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion.</a> Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).</li><li>Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-seeded+tubularized+scaffolds+for+reconstruction+of+long+urethral+defects:+a+preclinical+study.">Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study.</a> Eur Urol. 63, 531-538 (2013).</li><li>Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+tissue-engineered+skin+and+nerve+regeneration+in+burn+treatment.">Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment.</a> Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).</li><li>Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+contractility+and+growth+in+plastic+compressed+collagen+gel+scaffolds+with+microstructures+correlated+with+hydraulic+permeability.">Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability.</a> J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma, cerrahi masada transplantasyon için otolog doku ile mesane duvar yamaları üretmek için kolay kullanımlı bir yaklaşım sunuyor. Yamalar ve plastik sıkıştırma ile kombinasyon halinde, dış yüzeylerde kıyılmış doku olmayan orta ve kollajen biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer örgü kombinasyonu ile oluşturulur. Plastik sıkıştırma yöntemi daha önce başka yazarlar tarafından tanımlanan ve kolajen jellerin 12,13 sıvının hızla dışarı itilmesini olarak tanıml...

Deri ve ürogenital sistem için transplantasyon en doku mühendisliği çalışmaları özel donanımlı hücre kültürleme tesislerde 1,2 sağlıklı doku ve hücre genişlemesi otolog hücre hasat içerir. Hasta otogreft almaya hazır olduğunda hücre genişlemesi sonra hücreler, genellikle daha sonra kullanılmak üzere saklanır. Azot dondurucular -150 ° C veya daha düşük düşük sıcaklıklarda uzun süreli depolama izin. donma süreci dikkatli ve hücreleri kaybetmemek için kontrol olmalıdır. hücre ölümü biri risk hücre zarlarının yırtılmasına yol açabilir çözdürme işlemi sırasında hücre içi su kristalleşme olduğunu. Hücre dondurma, genellikle hücre, fetal sığır serumu ve dimetil sülfoksit yüksek konsantrasyonu kullanılarak, yavaş ve kontrollü bir soğutma (-1 ° C başına dakika) ile gerçekleştirilir. Çözündükten sonra, hücreler dondurma orta çıkarılması ve hücre kültürü plastik ya da ilgili kültürlenmesiyle yeniden işlenmesi gerekenhastaya geri transplantasyon öncesi biyomalzeme. Yukarıda belirtilen adımları zaman alıcı ve zahmetli olan, 3 masraflı. Buna ek olarak, hasta transplantasyon için öngörülen hücrelerin in vitro işleme son derece düzenlenir ve iyi eğitimli ve akredite personel ve laboratuarlar 4 gerektirir. Sonuçta, teknik sadece teknik olarak gelişmiş merkezlerin çok az sayıda kurulabilir ve sık cerrahi hastalıklarda daha geniş bir kullanım şüpheli, güvenli ve güvenilir bir üretim süreci temin etmek. Laboratuar ortamında hücre kültürü içinde sınırlamalarını aşmak için, in vivo olarak, hücre genişlemesi için kıyılmış doku nakli kavramı biyoreaktör olarak vücut kendisini kullanarak sokulur. Bu amaçlar için, otogreft tercihen i organı nihai yeniden düzenleme için gerekli olan şekle göre olan bir 3 boyutlu kalıp üzerinde nakledilen olacaktır5-7 nterest. Başlangıçta, kıyılmış epitel nakli fikri o epiteli bir yara kenarlarından nasıl büyür açıklanan 1958 yılında Meek tarafından sunuldu. O cildin küçük bir parça (Şekil 1) 8 dik yönde iki parça kesilerek 100% oranında ve böylece hücre genişlemesi için potansiyel marjlarını artırmak ve olduğunu göstermektedir. Teori cilt transplantasyon 9 fileli kısmi kalınlıkta deri grefti kullanımı ile desteklenen ve deride modelleri 10 yara iyileşmesi olmuştur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53061/53061fig1.jpg" width="600" /> Şekil 1:. Meek teori Meek teorisine göre, epitel bir yara kenarlarından büyür. kıyma teknolojisi ile maruz alanını arttırarak, kıyılmış doku birçok noktalardan yaralar epithelializes. Bu çalışma hipo dayanmaktadırAynı ilke, bir kalıp etrafında kıyılmış epitel yerleştirerek deri altı dokuya uygulanabilir tezi. (Iç vücuttan yabancı cisim (kalıp) yara alanı kaplar ve ayıran sürekli neoepithelium oluşturmak için epitel hücreleri yara alanları (göç) kapak, kıyılmış nakli (yeniden) den seferber olur ve bölme (genişletmek) Şekil 2). <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53061/53061fig2.jpg" /> Şekil 2:. Meek teorisine göre, in vivo vücut içi doku genişlemesi için kıyılmış epiteli ile 3D kalıp Karikatür deri altı dokuya bir kalıp üzerine yerleştirilir ve daha sonra nakledilen kıyılmış doku kullanarak, hipotez epitel hücreleri göç olduğunu kıyılmış doku kenarları, yeniden, ve yara alanı kaplar ve iç gövde arasında yabancı cisim (kalıp) ayıran bir kesintisiz neoepithelium oluşturacak şekilde genişler. Önceki in vivo çalışmalar umut verici sonuçlar gösterse de rejenere epitel iyi 7 mekanik travma dayanacak, böylece daha fazla iyileştirmeler otogrefti takviye ile elde edilebilir. kolay besin ve atık ürünlerin yayılması, olasılık kalıbına 3D bir şekilde ve cerrahi işleme kolaylığı: Bu amaçla, başarılı bir biyomalzeme önemli bir önkoşul gibi, tespit edilmiştir. Sonuçlar bu ihtiyaçların kıyılmış dokuya kompozit biyo materyal ekleyerek karşılanabileceğini yapılmıştır. kıyılmış dokudan oluşan bir iskele geliştirmeyi amaçlayan mevcut çalışma biyolojik olarak parçalanabilir bir kumaş takviye çekirdek içeren kollajen plastik sıkıştırılmış. Bu sayede, canlı hücreler kıyılmış doku parçacıklarının göç olabilir ve orijinal epiteli (deri veya ürotelyum) morfolojik özellikleri karakteristiği ile çoğalırlar. Plastik sıkıştırma kullanarak, iskele azaltmak olduyaklaşık 420 um kıyılmış parçacıkları olarak 1 cm arasında D üst katman kolajen kaplı edildi. Çekirdek kumaşın herhangi bir polimer olabilir, ancak kapsayan kollajen tabakaların 11, birbirleriyle amacıyla hidrofilik yüzey ile değiştirilmesi gereken olabilir. yöntem kıyılmış mesane mukozasını veya domuz kıyılmış cilt kültürü için bir iskele olarak kullanarak iki plastik sıkıştırılmış kollajen jel içinde poli (ε-kaprolakton) oluşan bir örgü örgü (PCL) dahil ederek gelişmiş bir iskele bütünlüğü sağlanmış. Yapı, iyi konsolide hibrid yapısı üstünde tabakalı, çok katmanlı ürotelyum ve skuamöz deri epitelyumunun başarılı oluşumu gösteren in vitro en fazla 6 hafta içinde, hücre kültür koşullarında muhafaza edilmiştir. yapı işlemek için kolay oldu ve mesane büyütme amaçlı veya cilt kusurlarının örtülmesini yerine dikilir olabilir. Doku iskele tüm parçaları FDA onaylı ve teknik vardırDoku kıyma hasat, plastik sıkıştırma ve tek aşamalı müdahale olarak hastaya geri nakli tek aşamalı işlemleri için kullanılabilir. Prosedür herhangi bir genel cerrahi ünitesinde steril koşullar altında doku genişletme ve yeniden inşası için yapılabildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Silicone catheter 10-French</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 10X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31885-023</td>
			<td>Plastic compression section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td>Plastic compression section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#39;3,&#39;5-Triiodothyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>IRMM469</td>
			<td>&#160; In vitro culture; Section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Labmed Solutions</td>
			<td>200-001-8</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Histolab</td>
			<td></td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>PK6102</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>1399.01</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8626</td>
			<td>&#160; In vitro culture; Section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine 25 &#956;g/kg&#160;</td>
			<td>Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azaperone 2&#8201;mg/kg&#160;</td>
			<td>Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Level 2 hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plastic compression; Section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution:&#160; Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.</td>
			<td>Vector</td>
			<td>The blocking solution depends of the&#160; origin of&#160; first antibody</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine 45 &#956;g/kg</td>
			<td>Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen 3&#8201;mg/kg&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Rimadyl, Orion Pharma, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine gluconate&#160;</td>
			<td>Hibiscrub 40&#8201;mg/mL, Regent Medical, England</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8052</td>
			<td>&#160; In vitro culture; Section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar: staining jar for boiling</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>6150</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless mold&#160; (33x22x10 mm) custom made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plastic compression; Section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3188-5023</td>
			<td>Plastic compression section 4. Keep on ice&#160; when using it in plastic compression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td>&#160; In vitro culture; Section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Surgery, Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-036</td>
			<td>Plastic compression section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (Adison with tooth)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze (Gazin Mullkompresse)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#180;s F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31765-027</td>
			<td>Plastic compression section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Histolab</td>
			<td>1820</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity chamber</td>
			<td>DALAB</td>
			<td></td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>&#160; In vitro culture; Section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide Solution 30%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3536</td>
			<td>&#160; In vitro culture; Section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine 5 mg/ml</td>
			<td>Xylocaine, AstraZeneca, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucose 25&#8201;mg/mL&#160;</td>
			<td>Baxter, Deerfield, IL</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marker pen pap pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine 25 &#956;g/kg&#160;</td>
			<td>Domitor, Orion Pharma, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mincing device</td>
			<td>Applied Tissue Technologies LLC</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Minced tissue preparation, section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl (absorbable monofilament)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Surgery, Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH 1N</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106462</td>
			<td>Plastic compression section 4 and cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plastic compression; Section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oculentum simplex APL: ointment for eye protection</td>
			<td>APL</td>
			<td>Vnr 336164</td>
			<td>Surgery, Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Plastic compression section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Plastic compression section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenobarbiturate 15&#8201;mg/kg&#160;</td>
			<td>Pentobarbital, APL, Sweden</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLGA Knitted fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plastic compression; Section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail collagen</td>
			<td>First LINK, Ltd, UK</td>
			<td>60-30-810</td>
			<td>Plastic compression section 4, keep on ice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade - 15</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaving shears</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plastic compression; Section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steril gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gowns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drapes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilium</td>
			<td>Bode Chemie HAMBURG</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thread Ethilon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris/1 mM EDTA,&#160; adjust pH to&#160; 9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiletamine hypochloride 2,5&#8201;mg/kg</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8158</td>
			<td>&#160; In vitro culture; Section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base, H2NC&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector VIP kit: Enzyme&#160; peroxidase substrate&#160; kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK4600</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl (absorbable braded)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Surgery, Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TE solution: Make 10X&#160; (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml&#160; distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with&#160; distilled water. Dilute to 1X with distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tra solv (solvent)</td>
			<td>DALAB</td>
			<td>41-5213-810</td>
			<td>Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zolazepam hypochloride</td>
			<td>Zoletil, Virbac, France</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory wax strips</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td>Preparing the animal for surgery , Section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium</td>
			<td>Lundbeck</td>
			<td></td>
			<td>Termination, Section 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minced tissue in compressed collagen: a cell-containing biotransplant for single-staged reconstructive repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Bu çalışma, kollajen ve kıyılmış doku plastik sıkıştırma kullanarak nakli için bir biyo materyal üretmek için nasıl gösteren bir yöntem sunar. Mesane mukozasının ve cilt hasat edilmiş ve daha sonra mekanik olarak küçük parçacıklar (Şekil 3) içine kıyılmış edilebilir. Plastik sıkıştırma ile, kıyılmış partiküller bir kollajen jel (Şekil 4) dış tabakaları içinde mekanik olarak güçlü olan bir merkezi olarak yerleş...

Watch this Scientific Journal Video about Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair at JoVE.com

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Doku mühendisliği genellikle doku rejenerasyonu için Otogreft yaratmak için in vitro genişlemesinde içerir. Bu çalışmada, genişleme, doku, yenilenme ve in vivo olarak yeniden yapılanma için bir yöntem olup vücut dışında hücreleri ve biyolojik malzemelerin işlenmesi en aza indirmek için geliştirilmiştir.

Sıkıştırılmış Kolajen kıyılmış Doku: Tek aşamalı Rekonstrüktif Onarım için Cep içeren Biotransplant

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

minced-tissue-compressed-collagen-cell-containing-biotransplant-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K Görüntüleme.  Karolinska Institutet.  Doku mühendisliği genellikle doku rejenerasyonu için Otogreft yaratmak için in vitro genişlemesinde içerir. Bu çalışmada, genişleme, doku, yenilenme ve in vivo olarak yeniden yapılanma için bir yöntem olup vücut dışında hücreleri ve biyolojik malzemelerin işlenmesi en aza indirmek için geliştirilmiştir. 

Video: Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Biyomühendislik

Fabrication and Application of Rose Bengal-chitosan Films in Laser Tissue Repair

Photochemical tissue bonding (PTB) is a sutureless technique for tissue repair, which is achieved by applying a solution of rose bengal (RB) between two tissue edges1,2. These are then irradiated by a laser that is selectively absorbed by the RB. The resulting photochemical reactions supposedly crosslink the collagen fibers in the tissue with minimal heat production3. In this report, RB has been incorporated in thin chitosan films to fabricate a novel tissue adhesive that is laser-activated. Adhesive films, based on chitosan and containing ~0.1 wt% RB, are fabricated and bonded to calf intestine and rat tibial nerves by a solid state laser (&lambda;=532 nm, Fluence~110 J/cm2, spot size~0.5 cm). A single-column tensiometer, interfaced with a personal computer, is used to test the bonding strength. The RB-chitosan adhesive bonds firmly to the intestine with a strength of 15 &plusmn; 6 kPa, (n=30). The adhesion strength drops to 2 &plusmn; 2 kPa (n=30) when the laser is not applied to the adhesive. The anastomosis of tibial nerves can be also completed without the use of sutures. A novel chitosan adhesive has been fabricated that bonds photochemically to tissue and does not require sutures.

Sutures are usually needed to repair tissue during surgical procedures. However, their application can be problematic as they are invasive and may damage tissue. The fabrication and application methods of a novel tissue adhesive are here reported. This adhesive film is laser-activated and does not require the use of sutures.

Fabrikasyon ve Lazer Doku Onarımı Rose Bengal-kitosan Film Uygulamaları

Photochemical tissue bonding (PTB) is a sutureless technique for tissue repair, which is achieved by applying a solution of rose bengal (RB) between two ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Cilt Tip I Kolajen hazırlanması için geliştirilmiş bir yöntem

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Doğallığı Kollajen Tellerinin Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Ve<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kafesli Kollajen Mimetik Peptidlerinin Fotoğraf-tetiklenen Hybridization yoluyla

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Polarize Sinir Doku Engineered 3D İpek-kolajen bazlı Modeli

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue Sabitleme için mikroakışkan Cihazlar Katman-katman Kolajen Biriktirme

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.