This work was supported by the Seed Grant Award from California Northstate University College of Pharmacy (to AMN). The authors would like to thank California Northstate University College of Pharmacy for covering the publication cost of this article, and George Talbott for his help in editing this manuscript.

CACO-2 hücrelerinin 1. Bakım <ol><li> Düzenli doku kültürü yemekleri kullanma <ol><li> (FBS, 37 ° C su banyosu içinde şişe yerleştirerek bir dondurulmuş şişesinden alınan Caco-2 hücreleri çözülme ve hemen önceden ısıtılmış büyüme ortamı (% 15 fetal bovin serumu, 10 ml içeren 10 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı eklemek ) Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)) &#39;de. <ol><li> Caco-2 hücreleri% 50-70 kaynaşmaya ulaştığı zaman, onları 1 bölünmüş: müstakil kadar 37 ° C&#39;de% 0.05 tripsin / 0.53 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 3 ml ile hücrelerin inkübe edilmesi ile 6 (15 dk) . Hücre topaklaşmayı önlemek yumuşak pipetleme hücreler karıştırmak için birkaç kez. Önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml içeren 10 cm&#39;lik bir doku kültürü kabı tripsinize edilmiş hücre 0.5 ml ilave edilir. </li></ol></li><li> Yavaşça bir sola ve sağa yön ardından ileri ve geri yönde yemeklere birkaç kez sallayın. Yemekler dönen kaçınıngibi eşit olmayan bir hücre dispersiyonu ile sonuçlanabilir. </li><li> % 5 CO 2 ile birlikte 37 ° C inkübatör düz bir yüzeye yerleştirin yemekleri. Eğimli yüzeyler de eşit olmayan bir hücre dispersiyonu ile sonuçlanabilir. </li><li> Inkübasyon başladıktan sonra büyüme Ortam bir gün değiştirin. </li><li> Hücreleri izlemek ve izdiham ulaşmak günü kaydedin. Hücreler bölünür günden itibaren izdiham ulaşmak için yaklaşık 1 hafta sürer. </li><li> Hücreler izdiham ulaşmadan haftada iki kez büyüme ortamı değiştirin. Hücreler izdiham ulaştığınızda, her gün büyüme ortamı değiştirmek. Hücreler 7-günler sonrası konfluent olduktan sonra, günlük büyüme ortamı değiştirmek. Not: 13-günler sonrası konfluent (Şekil 1) olduğunda hücreler deneyler için hazırız. Hücreler sonunda lipoproteinlerin üreten daha az etkili hale gelecektir yana, 8 sonrası birleşik 13-17-gün arasında olan hücreleri kullanır. Deney yapmak için nasıl adım 3&#39;e gidin.</li></ol></li><li> Geçirgen zar sistemi kullanılarak <ol><li> Aşama 1.1.1.1 tarif edildiği gibi geçirgen zar ekinde Caco-2 hücreleri, tohum. Yukarıda. Onların hücre büyümesi (iyileşme dönemi) normalde yavaş çünkü dondurulmuş şişesinden alınan hücreler kullanılarak kaçının. Kısaca, önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml içeren apikal (üst bölmesi) tripsinize edilmiş hücre 0.5 ml ilave ediniz. Ayrıca, bazolateral bölme (alt bölmesi) önceden ısıtılmış büyüme ortamı 10 ml. Not: En iyi uygulama için, bazolateral odasına ilk ve daha sonra apikal odasına büyüme ortamı ekleyin. Eski medya çıkartırken, apikal medya önünde bazolateral ortamı çıkarın. Bu membran rüptürü olabilir polikarbonat membran alay kaçının. </li><li> Nedeniyle polikarbonat zardan kötü hücre görünürlüğe, benzer yoğunlukta düzenli bir doku kültürü çanak Caco-2 hücreleri tohum ve hücre izdiham yargılamak için bu yemeğin kullanın. </li><li> S izleyinTeps&#39;in 1.1.2-1.1.6, yukarıda. </li></ol></li></ol> 2. Gene overekspresyonu <ol><li> Normal transfeksiyon yaklaşımı kullanarak <ol><li> Yukarıda 1.1.1.1.-1.1.4 de tarif edildiği gibi bir doku kültürü tabağına Caco-2 hücreleri, tohum. Not: hücreler yaklaşık% 40-50 konfluent olduğunda, transfekte hazırdır. </li><li> Mikrosantrifüj tüpü içinde düşük serum ortamında 472 ul transfeksiyon reaktifi 67 ul ekle. Tüp duvar ile sulandırılmamış transfeksiyon reaktif temasından kaçının. </li><li> PLL3.7 23 ug transfeksiyon reaktifi / düşük serum ortamında karışımına, yeşil flüoresan protein (EGFP) 9 Geliştirilmiş ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> DMEM içinde% 10 FBS 8 ml Caco-2 hücreleri, büyüme ortamı değiştirin. </li><li> Damla damla çanak DNA / transfeksiyon reaktif / azaltılmış serum medya karışımı ekleyin. </li><li> Yavaşça ileri ve ba yemekleri birkaç kez sallayınBir sola ve sağa yönde takip ckward yön. </li><li> 37 ° C inkübatör çanak yerleştirin. </li><li> Kuluçka başladıktan sonra büyüme ortamı 10 ml her gün bir çanak ortamı değiştirin. </li><li> Gen ifadesini izleyin. <ol><li> 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyanmamış olan gen ekspresyonunu izlemek. Floresan mikroskobu kullanılarak, yeşil hücrelerin yüzde belirler. yüzde transfeksiyon verimini gösterir. </li><li> DAPI boyama ile gen ifadesini izleyin. <ol><li> Fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez hücreler yıkanır. </li><li> PBS (oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon) içinde% 4 formaldehit, 10 ml ekleyerek hücreleri saptamak. </li><li> PBS üç kez hücreleri yıkayın. </li><li> 500 DAPI,% 1 BSA,% 0.01 digitonin: 1 içeren PBS 8 ml ile oda sıcaklığında 15 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri. </li><li> PBS üç kez hücreleri yıkayın. </li><li> U, bir flüoresan mikroskop şarkı, mavi (Şekil 2 üst panel) ki bu yeşil / mavi göreli hücre sayısını belirler. hesaplanan yüzde transfeksiyon verimini gösterir. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Lentivirüs aşırı sistemi 10 kullanılarak <ol><li> 15 cm&#39;lik bir doku kültürü çanağı içinde Tohum, insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri (DMEM içinde% 10 FBS büyüme ortamı olarak). Not: hücreler yaklaşık% 60-70 konfluent olduğunda, transfekte hazırdır. </li><li> Mikrosantrifüj tüpü 11 düşük serum ortamı 1133 ul transfeksiyon reaktifi 162 ul ekle. Tüp duvar ile sulandırılmamış transfeksiyon reaktif temasından kaçının. </li><li> Ekle 24 pLL3.7 eGFP (ya da başka bir yapı) ug, 15.6 REV karşılık elemanının ug (RRE), REV 6.0 ug, ve transfeksiyon reaktifi / r içine veziküler stomatit virüsü glikoprotein 8.4 ug (VSVG)educed serum ortamında karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle inkübe karışımı. </li><li> DMEM içinde% 10 FBS ve 16 ml büyüme ortamı değiştirin. </li><li> Damla damla çanak DNA / transfeksiyon reaktif / azaltılmış serum medya karışımı ekleyin. </li><li> Yavaşça bir sola ve sağa yön ardından ileri ve geri yönde yemeklere birkaç kez sallayın. Bu noktada müstakil HEK293T hücrelerinin bazılarını görmek için normaldir. </li><li> Inkübatör çanak yerleştirin. </li><li> Kuluçkalamadan 24 saat sonra, büyüme ortamı, 25 ml çanak ortamı değiştirin. </li><li> Ertesi gün, lentivirüs (birinci toplama) içeren büyüme ortamı toplar. </li><li> Adımı yineleyin 2.2.10 fazla lentivirüs (ikinci toplama) toplamak için. </li><li> (5 dakika boyunca 2.500 xg) birinci ve ikinci toplama havuzu ve santrifüj hücre enkaz kaldırmak. </li><li> Tek kullanımlık şişe üstü filtre (0.45 mikron gözenek) ile toplama Filtre veRT (JA-20 rotor) 2 saat süre ile 31.400 x g&#39;de santrifüje toplama virüsü konsantre edilir. Pelet bulunduğu santrifüj tüpünün dibine işaretleyin. Süpernatant tortusundan ayırma, ve yaklaşık 15 dakika boyunca oda sıcaklığında ters tüpü terk. </li><li> 1X PBS, 100 ul virüs içeren pelletini. Kabarcıkları kaçının. </li><li> -80 ° C &#39;de konsantre edilir virüs saklayın. Donma-çözülme döngüleri kaçının. </li><li> Titrasyon ile, Caco-2 hücreleri nakletmek için gerekli virüs optimal miktarının belirlenmesi. Maliyet tasarrufu için, 24-çukurlu plaka (iyi büyüme ortamı / 0.3 ml) kullanılarak titrasyonu için 10 cm&#39;lik bir doku kültürü çanağı kullanın. <ol><li> Konsantre edilmiş virüs artan miktarlarda ekleyin (0, 1, 2, 5, 10, 25, ve 50 ul / kuyucuk)% 40-70 konfluent Caco-2 hücreleri için polibren (nihai konsantrasyon = 5 ug / ml) ile takviye edilmiştir. 1.1.2 tarif edildiği gibi hafifçe 24 oyuklu plaka çalkalayın. </li><li> Onların gen ifadesini Monitör (Adım 2.1.10.) (Şekil 2 alt4 paneller). </li></ol></li><li> Transgen ifadesi genellikle sürekli olduğundan, gelecek deneyler için transdüse hücreleri korumak ve sürekli olarak gen ifadesini izlemek (Adım 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. Lipoprotein salgılanmasını uyararak <ol><li> Düzenli doku kültürü çanak kullanma <ol><li> Oleik asit, 50 mg, lesitin, 40 mg, ve sodyum taurokolat ve 48 mg karıştırılarak bir 100X yağ karışım hazırlayın. (8 yemekler için yeterli) PBS ile 900 ul hacim kazandırın. Kuvvetli bir şekilde lipit karışımı karıştırın. </li><li> Büyüme ortamı 89.1 ml 100X lipit karışımı 900 ul ekleyin. Mix ve lipid içeren medya filtre. oleik asit, lesitin, ve sodyum taurokolat ve nihai konsantrasyonlar (1X) 2.0 mM, 1.36 mM ve sırası ile 1.0 mM vardır. </li><li> Hücrelere lipid içeren ortam, 10 ml ilave edilir. </li><li> 37 4 saat boyunca lipit-içeren ortam ile inkübe hücreleriC inkübatör °. </li><li> PBS üç kez hücreleri yıkayın. </li><li> Lipoprotein salgılanmasını toplamak için hücrelerin büyüme ortamı 10 ml ilave edilir. </li><li> 37 ° C kuluçka makinesi içinde 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Lipoprotein içeren medya toplayın. </li></ol></li><li> Geçirgen zar sistemi kullanılarak <ol><li> Adımları 3.1.1-3.1.2 lipit karışımı hazırlamak için. </li><li> Apikal bölmeye lipid içeren ortam 10 ml ve bazolateral bölmeye büyüme ortamı 10 ml ilave edilir. </li><li> 37 ° C kuluçka makinesi içinde 4 saat süreyle inkübe edin. Bazolateral bölme lipoprotein ihtiva eden ortam toplayın. </li></ol></li></ol> 4. lipoprotein İzolasyon (Şekil 3) <ol><li> Santrifüj (5 dakika boyunca 2.000 xg) lipoprotein içeren medyanın hücre enkaz kaldırmak. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine ortamı süzün. </li><li> Ortam, sodyum klorür 5.95 g ekleyin. </li><li> Sa Eğermple TEM ile analiz edilecektir, lipoproteinlerin bütünlüğünü korumak için 1 proteaz önleyici kokteyl tablet ekleyin. </li><li> Su ile 23 ml hacmi (1.2 g / ml NaCI yoğunluk çözeltisi) getirin. </li><li> Tamamen çözünmüş çözülür. </li><li> Polikarbonat ultrasantrifüjdeki tüp içine çözeltinin Tümünü süzün. </li><li> Yavaşça, 0.5 ml, su (1.0 ug / ml yoğunlukta), 1.2 ug / ml yoğunlukta çözelti kaplar. </li><li> Hacimce ağırlıkça değil tüp dengeleyin. </li><li> Yavaşça T865 rotor tüpler yükleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca 429.460 x g&#39;de ultrasantrifüjdeki örnekleri dönerler. </li><li> Hemen Nazik pipetleme üst 0.5 ml solüsyon izole. Mümkün olduğunca hareketsiz tüp tutun. </li></ol> 5. TEM analizi <ol><li> (A / h) ile pH 6,0&#39;a ayarlanır% 2 fosfotungstik asit 5 ml hazırlayın. </li><li> (: 0.2 mikron gözenek boyutu) bir şırınga filtresi ile% 2 fosfotungstik asit Filtre. </li><li> Steril bir çanak lipoprotein numunenin 20 ul bırakın. </li><li> Bir sonraki aynı yemeğin üzerine örnek süzülmüş% 2 fosfotungstik asit 20 ul bırakın. </li><li> Yavaşça donuk yan numune üzerinde oturan bir EM ızgara bırakın. </li><li> 1 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Yavaşça ızgara örneği kaldırmak için bir filtre kağıdına EM ızgara tarafı dokunun. </li><li> Yavaşça donuk tarafı% 2 fosfotungstik asit dayayarak EM ızgara bırakın. </li><li> 1 dakika süre ile, oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Yavaşça ızgara fosfotungstik asit ayrılması için bir filtre kağıdı üzerinde EM ızgara yan dokunun. </li><li> Bir TEM kullanarak, lipoproteinler (Şekil 4) görüntüleri yakalamak. </li></ol>

<ol>
	<li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood.">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li><li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine.">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li><li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation.">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li><li>Lo, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation.">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li><li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption.">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li><li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability.">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li><li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein.">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li><li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm.">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li><li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+biosynthetic+interaction+network+component,+TMEM24,+facilitates+insulin+reserve+pool+release.">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li><li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saturated,+mono-,+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells.">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li><li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., M&#233;nard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+and+human+fetal+colon:+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport.">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li><li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly.">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

Bu yazıda, kullanılabilecek iki sistem Caco-2 hücreleri, yani düzenli doku kültürü çanak ve geçirgen zar açıklanmıştır korumak için. geçirgen zar sistemi kullanmanın faydaları apikal ayrılmasını ve bazolateral bölmeleri ve lipid karışımı inkübe ve aynı zamanda lipoprotein salgılanmasını toplamak için yeteneği vardır. Ancak, geçirgen zar ekler pahalıdır, ve polikarbonat membran iyi bir hücre görünürlüğü izin vermez. Bu in vitro modelin avantajlarından biri genetik man...

4 - diyet yağ ve lipid içinde çözünür ilaçlar ve vitaminler intestinal çalışmaları lenf fistül MODEL 1 kullanılarak in vivo olarak gerçekleştirilebilir. Ancak, ilgili cerrahi teknikler sadece zor değil, aynı zamanda pahalı değil. In vivo kullanılabilmektedir dışkı analizi dayalı yaklaşımlar da, mide-barsak sisteminde 2,5 yüzdesi alımını belirlemek için temel olarak kullanılmaktadır. Bu yazıda anlatılan in vitro model daha düşük maliyetli olduğunu ve ilgili teknikler tartışmalı az zorlayıcı bulunmaktadır. Genetik modifikasyonlar çalışmaları da zaman alıcı, bu in vitro bir model kullanılarak gerçekleştirilmiştir zaman daha ekonomik ve daha az bulunmaktadır. Enterositler tarafından alınır lipit çözünür malzeme lipoproteinler 6,7 içine paketlenmiş olduğundan, lipoproteinlerin üretmek için bu in vitro modelin etkinliği çok önemlidir. iki ana intestinal lipoproteinler kilomikronlar, çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL) vardır. Lipidler mide-bağırsak lümeninde bol mevcut olduğunda çapı 80 nm ya da daha fazlası ile lipoproteinler olarak tanımlanan kilomikronlar, küçük bağırsak tarafından sıkı bir şekilde üretilir. Onlar büyük lipoproteinler olduğundan, şilomikronlar makul en verimli lipit taşıyıcıları vardır. Şilomikron 8 üretebilen bu in vitro modeli, diyet yağ emme, gut lipid çözünür vitamini emme ve oral lipofilik ilaç biyo-incelemek için kullanılabilir. lipoprotein fraksiyonuna lipid çözünür moleküller, vitaminler ya da ilaçların bulunması, ince bağırsakta kendi emilme bir göstergesidir. Daha önce ele alındığı gibi, bu model, oral lipofilik ilaç biyo-6 geliştirmek için de kullanılabilir. Bu kağıt Caco-2 hücreleri geçirgen zar veya normal doku kültürü yemekleri, nasıl lipit mi muhafaza edilmelidir açıklanırLipoprotein üretimini stimüle etmek için soğutun lentivirüs sentezleme sisteminin etkin aşırı ekspresyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir nasıl hazırlanmalı ve izole lipoproteinler kadar analiz edilmelidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16750-112</td>
			<td>Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3600511</td>
			<td>We do not heat inactivate our serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane system</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7200173</td>
			<td>10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-E</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-24</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565163</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid-based transfection reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PRE2691</td>
			<td>Can be substituted with other transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 eGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9761120</td>
			<td>0.45 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9840454</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01383-5G</td>
			<td>Prevent freeze-thaw cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lecithin&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>IC10214625</td>
			<td>Egg lecithin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurocholate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9620276</td>
			<td>Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5892791001</td>
			<td>Used mainly for samples that need TEM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9696153</td>
			<td>Reusing it multiple times will collapse the tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lid for ultracentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9796914</td>
			<td>A tool is required to remove the tube/lid from rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-949-261</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>Pore size = 0.2 mm; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC208310250</td>
			<td>For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-238-62</td>
			<td>Extra fine and strong tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/carbon grid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-260-34</td>
			<td>Formvar/carbon film square grid 400 Copper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caco-2 cells to study lipid transport by the intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

1 görüntüler, normal 13-gün sonrası birleşik Caco-2 hücreleri Şekil. Kubbe-şekilli yapılar ve hücre içi lipid damlacıkları görünümü farklılaşmış Caco-2 hücreleri için karakteristiktir. Caco-2 hücreleri tohumlama sırasında eşit dağılmış değil, onlar kümelenir ve yemeğin belirli alanlarda sarmak olacaktır; ve herhangi bir hücrelerde olmadan çanak birkaç alanları olacaktır. Swirling ve eğimli bir yüzeye çanak yerleştirilmesi kaçınılmalıdır....

Watch this Scientific Journal Video about Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine at JoVE.com

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

using-caco-2-cells-to-study-lipid-transport-by-the-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K Görüntüleme.  California Northstate University. Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.