Bu protokol, insan bağırsak organoidlerinde lipid damlacık oluşumunu ölçmek için bazı yöntemleri açıklamaktadır. Lipid damlacık oluşumunu modüle eden ilaçlar için test etmek için yüksek iş letiye tarama platformu olarak kullanılabilir. Tarif ettiğimiz yöntem lipid damlacıklarına özgü boya ve biyopsi kaynaklı intestinal organoidlere dayanmaktadır.
Bu nedenle lipid damlacık oluşumu için kararlı, doğru ve fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar. Bu protokol, örneğin DGAT1 eksikliği olan hastalarda lipid damlacıklarının oluşumunu modüle eden hastaya özel yeni ilaç adaylarının taranması için kullanılabilir. Bu lipid damlacık oluşumu tsay da diğer hücre tiplerinde lipid metabolizması çalışmak için organoid kültürlerin diğer türleri uygulanabilir.
Tsur önemli ölçüde organoid kültürün yoğunluğuna bağlıdır. Örnekler ve deneyler arasında tutarlı bir organoid yoğunluğu sağlamaya çalışın. Bu testin görsel gösterimi önemlidir, çünkü organoidin nasıl kültüre alınması gerektiğini ve lipid damlacık oluşumunun doğru analizini sağlamak için nasıl ele alınması gerektiğini göstermek önemlidir.
Organoidler hazırlandıktan sonra, dikkatle bodrum membran matris damlacıkları rahatsız etmeden kültür ortamı aspire. Organoidlerin ilk kuyusu için soğuk bazal orta 500 mikrolitre ekleyin. Bir P1000 pipet kullanarak, hafifçe pipet yukarı ve aşağı organoidler ile bodrum membran matris damlacıkları bozmak için.
Bu prosedürleri bir sonraki ortamda aynı ortamda gerekli olduğu kadar tekrarlayın, ancak 500 mikrolitre bazal ortam için ikiden fazla kuyu hasat etmeyin. Organoidleri düşük bağlayıcı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpte toplayın ve 15 ila 20 saniye boyunca mini masa üstü bir santrifüjde döndürün. Bükülmüş organoidlere 400 mikrolitre tripsin ekleyin.
37 derecede bir su banyosunda beş dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, kalan hücre toplamlarını bozmak için süspansiyonu yavaşça yukarı ve aşağı pipetlemek için P200 pipetkullanın. 37 derecede bir su banyosunda beş dakika kuluçkaya yat.
Sadece tek hücreler kaldığında, bir mililitre bazal ortam ekleyin ve hücreleri 15 ila 20 saniye boyunca mini masa üstü bir santrifüjde aşağı döndürün. Supernatant'ı tamamen aspire edin. 200 mikrolitre taze hSI-EM'deki tek hücreleri yeniden askıya almak ve 800 mikrolitre hSI-EM eklemek için Bir P200 pipet kullanın.
Daha sonra askıya alınan hücre sayısını sayın ve son hücre yoğunluğu için gereken hücre hacmini hesaplayın. Uygun süspansiyon hacmini çıkarve yoğunluğu mikrolitre başına 750 hücreye ayarlayın. Hücre süspansiyonuna ikiye bir oranında bodrum membran matrisi ekleyin.
Yavaşça kabarcıklar oluşturmaktan kaçınmak için dikkatli olmak karıştırmak için süspansiyon pipet. Önceden ısıtılmış bir kültür plakasında, plakada 24 kuyu veya her kuyuda 96 kuyu varsa, kuyu başına bir adet beş mikrolitrelik damlacık varsa, kuyu başına üç adet 10 mikrolitrelik damlacık çıkar. Damlacıkları katılaştırmak için plakayı 37 derecede yüzde beş karbondioksitle 10 ila 15 dakika boyunca kuvöze yerleştirin.
Bu arada, 37 santigrat derece bir su banyosunda hSI-EM +Y uygun bir hacim Önceden ısıtın. Bundan sonra, plakanın her kuyuya önceden ısıtılmış hSI-EM+Y'yi dikkatlice ekleyin. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
2-3 gün sonra ortamı hSI-EM ile değiştirin ve haftada 2-3 kez yenilediğinden emin olun. İlk olarak, oda sıcaklığında sıvı oleik asit 0,2 gram tartın. Kültür sınıfı steril PBS 1,5 mililitre ekleyin ve aralıklı girdap emin olmak için bir saat boyunca 70 santigrat derece karışımı ısı.
Daha sonra, yağ asidi içermeyen BSA 5,89 gram tartmak ve PBS 33,9 mililitre içinde eritin. BSA tamamen eriyene kadar karışımı 37 santigrat derecede bir su banyosunda ısıtın. Girdap oleik asit karışımı tekrar ince damlacıkların bir emülsiyon oluşturmak ve hemen bir cam pipet kullanarak BSA çözeltisi ekleyin.
Açık sarımsı bir çözelti kalana kadar karışımı 37 derecede 30 dakika bekletin. Daha önce açıklandığı gibi organoidler geçiş ve siyah bir açık alt 96-iyi plaka içine organoid kaynaklı tek hücreleri tohum. HSI-EM'de kültür ortamının altıncı gününde, oleik asit ve BSA konjuge bir milimolar içeren hSI-EM ile kültür ortamını değiştirin.
0.1 mikromolar DGAT1 inhibitörü varlığı veya yokluğunda 37 santigrat derece 16 ila 17 saat boyunca hücreleri kuluçka. Bundan sonra, bodrum membran matris damlacıkları rahatsız etmeden orta aspire. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyulara %4 nötr tamponlu formaldehitin 100 mikrolitresini ekleyerek organoidleri sabitleyin.
Formaldehiti nazikçe çıkarın ve hücreleri her kuyuda 150 mikrolitre PBS ile dikkatlice yıkayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca mililitre LD540 başına 025 miligram ve PBS'de DAPI ile lipid damlacıkları için hücreleri lekeleyin. Daha sonra kuyuları PBS ile dikkatlice yıkayın.
Tüm organoidlerin genel bakış görüntüleri için konfokal floresan görüntüleme için uygun bir 40X öznel kullanın. Burada gösterilen uyarma ve emisyon ayarlarını kullanarak mikroskobu DAPI ve LD540 boyaiçin görüntüye ayarlayın. Yeterli z ekseni çözünürlüğü için iğne deliği boyutunu tek bir havadar üniteye ayarlayın.
Küresel bir organoidin yarısını görmek için yaklaşık 85 mikrometreye kadar bir z destesi ayarlayın. Uygun bir görüntü işleme sistemi kullanarak, Görüntü, Yığınlar, Z Projesi'ni tıklatarak her organoidin z yığınını maksimum projeksiyona dönüştürün. En yüksek projeksiyon eşiğini, Görüntü, Ayarla, Eşik'e tıklayarak BSA araç kontrol numunesinde görünür olmayan LD540 sinyalinin olmadığı bir seviyeye ayarlayın.
Her görüntüyü eşiğe getirmek için bu ayarları kullanın. Daha sonra analiz, parçacıkları analiz et işlevini kullanarak her maksimum projeksiyon için toplam floresan alanını ölçün. Lipid damlacık oluşumunun doğru analizi için, organoidler oleik asit ve sonraki boyama ile stimülasyon öncesinde çok yoğun tohumlu olmamalıdır.
Örtüşen organoidler floresan ile müdahale edebilir beri bu konfokal ve plaka okuyucu okuma için özellikle önemlidir. Bir gecede oleik asit milimolar ile uyarılmasından sonra, lipid damlacık oluşumu ters parlak alan mikroskobu ile görüntülenebilir. Lipid damlacıklarının birikmesi ışığı saçar ve bu nedenle organoidler daha koyu görünür, uyarılmayan organoidler ise yarı saydam bir görünüme sahiptir.
Oleik asit uyarılmış organoidler sabit ve lekeli sonra, lipid damlacık oluşumu bir konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilmiş olabilir. Organoidler 3D yapılar olduğundan, düzenli bir epifloresan mikroskop odak dışı arka plan sinyali nedeniyle uygun değildir, bu yüzden organoidlerde LDF karakterize etmek için bir konfokal z-stack kullanılır. Konfokal mikroskopi örneklerinin sayısallaştırılması, floresan Hoechst sinyaline normalleştirilmiş floresan plaka okuyucu suması kullanılarak da yapılabilir.
Plaka okuyucu analizi, dgat1 inhibitörü ile tedavi edilen organoid hücrelerde LD540 sinyalinde tedavi edilmeyen organoidlere göre önemli bir düşüş olduğunu gösterir. Tek tek hücrelerde LD oluşumunun nicelleştirilmesi bir akış sitometresi kullanılarak elde edilebilir. Burada gösterilen gating stratejisi ayrışmış insan bağırsak organoidleri içindir.
Son canlı hücre popülasyonunun hem SSC-A hem de LD540 sinyali için temsili histogramlar lipid damlacıklarının hücre içi lipid damlacıklarının oluşumuna bağlı olarak SSC-A'da artışa yol açacağını göstermektedir. Buna ek olarak, lipid damlacıkları depolanan lipidler için LD540 lekeleri, ve sinyal de lipid damlacık oluşumunun indüksiyon uyupüzerine artacaktır. Bu nedenle, lipid damlacık oluşumu hem SSC-A ve LD540 ortalama floresan yoğunluğu nda bir kayma olarak ölçülür.
Bu protokolün en önemli adımları insan bağırsak organoidleri kültürü ve BSA için oleik asit uygun olukluluk vardır. Daha fazla koşul alabilmek için, bu test floresan plaka okuyucu kullanılarak analiz edilebilir. Her kuyudaki organoid sayısını düzeltmek için LD540 sinyali DAPI sinyaline normalleştirildi.
Bu teknikle, araştırmacılar organoid sistemlerde lipid damlacık oluşumunu inceleyebilir ve bulgularını doğrulamak için elektron mikroskobu gibi çeşitli analiz tekniklerini geliştirebilirler.
