This work was supported by the Seed Grant Award from California Northstate University College of Pharmacy (to AMN). The authors would like to thank California Northstate University College of Pharmacy for covering the publication cost of this article, and George Talbott for his help in editing this manuscript.

1. תחזוקה של קאקו-2 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלים בתרבית רקמה רגילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את קאקו-2 תאים מבקבוקון קפוא על ידי הצבת את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, ומייד להוסיף אותם לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה (15% בסרום שור עוברי מחומם מראש (FBS ) בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM)). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קאקו-2 התאים הגיעו 50-70 מפגש%, לפצל אותם 1: 6 על ידי דוגרים התאים עם 3 מיליליטר של 0.05% חומצת ethylenediaminetetraacetic / 0.53 מ&quot;מ טריפסין (EDTA) על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מנותקים (15 דקות) . כדי למנוע clumping תא, לערבב את התאים מספר פעמים על ידי pipetting העדין. הוסף 0.5 מיליליטר של תאי trypsinized לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה מחוממת מראש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את המנות כמה פעמים בכיוון קדימה ואחורה ואחריו כיוון שמאלה וימינה. הימנע מתערבל המנותכפי שהוא עשוי לגרום לפיזור של תאים שאינו שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים על משטח שטוח בחממה 37 ° C מסופקת עם 5% CO 2. משטחים משופעים עשויים גם לגרום לפיזור של תאים שאינו שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את תקשורת צמיחת יום לאחר תחילת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התאים ולהקליט את היום שהם מגיעים למפגש. זה ייקח כ 1 שבוע לתאים מגיעים למפגש מהיום שהם נפרדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את תקשורת הצמיחה פעמיים בשבוע לפני התאים להגיע למפגש. ברגע שהתאים הגיעו מפגש, לשנות את תקשורת צמיחה בכל יום אחר. אחרי התאים 7 ימים לאחר מחוברות, לשנות את תקשורת הצמיחה יומית. הערה: התאים מוכנים לניסויים כאשר הם 13 ימים שלאחר מחוברות (איור 1). מאז תאי סופו של הדבר להיות פחות יעילים בייצור יפופרוטאינים, להשתמש בתאים שבין 13 עד 17 ימים לאחר מחוברות 8. עבור לשלב 3 על איך לבצע את הניסוי.</li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת הקרום החדיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי קאקו-2 תאים בכנס הקרום החדיר כמתואר בשלב 1.1.1.1. לעיל. הימנע משימוש בתאים מבקבוקון קפוא כי צמיחת התאים שלהם היא בדרך כלל איטית יותר (תקופת החלמה). בקצרה, להוסיף 0.5 מיליליטר של תאי trypsinized לתא הפסגה (תא עליון) המכיל 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה מחוממת מראש. כמו כן, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המחוממת מראש לתא basolateral (בתא תחתון). הערה: התרגול הטוב ביותר, להוסיף את תקשורת הצמיחה לתא הפסגה הראשונה ולאחר מכן לתא basolateral. כאשר מוציא את המדיה הישנה, ​​להסיר את המדיה basolateral לפני תקשורת הפסגה. הימנע תוקע את קרום פוליקרבונט כפי שהוא עשוי להיקרע הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשל הראות לקויה תא דרך קרום פוליקרבונט, זרע קאקו-2 התאים בצלחת תרבית רקמה רגילה עם צפיפות דומה, ולהשתמש במנה זו לשפוט את מפגש התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב יםteps 1.1.2-1.1.6 לעיל. </li></ol></li></ol> 2. ג&#39;ין ביטוי יתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגישת transfection הרגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי קאקו-2 תאים בצלחת תרבית רקמה, כמתואר ב1.1.1.1.-1.1.4 לעיל. הערה: כאשר התאים כ 40-50% ומחוברות, הם מוכנים להיות transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 67 μl של מגיב transfection לμl 472 של התקשורת בסרום המופחתת בצינור microcentrifuge. יש להימנע ממגע של מגיב transfection חי עם קיר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 23 מיקרוגרם של pLL3.7 משופרים חלבון ירוק ניאון (eGFP) 9 למגיב transfection / תערובת תקשורת סרום מופחתת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת צמיחת קאקו-2 תאים עם 8 מיליליטר של 10% FBS בDMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את תערובת DNA / מגיב transfection / מדיה סרום מופחתת ירידה מבחינת לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את המנות כמה פעמים בקדימה ותואר ראשוןכיוון ckward אחרי כיוון שמאלה וימינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיה בצלחת עם 10 מיליליטר של תקשורת צמיחת יום לאחר תחילת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על ביטוי גנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג ביטוי גנים ללא 6-diamidino-2-phenylindole צביעת 4 &#39;, (DAPI). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לקבוע את האחוזים של תאים שהם ירוקים. אחוז מייצג את יעילות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג ביטוי גנים עם מכתים DAPI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם מי מלח פוספט (PBS) שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של פורמלדהיד 4% ב- ​​PBS (דגירה 10 דקות ב RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בחושך במשך 15 דקות ב RT עם 8 מיליליטר של PBS המכיל 1: 500 DAPI, BSA 1%, digitonin 0.01%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uלשיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לקבוע את מספר התאים שהם בצבע ירוק / כחול ביחס לאלה ש( פנל עליון איור 2) כחול. בחישוב אחוז מייצג את יעילות transfection. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת ביטוי יתר lentivirus 10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע אנושיים כליה עוברית (HEK) 293T בצלחת תרבית רקמת 15 סנטימטר (10% FBS בDMEM כתקשורת הצמיחה שלהם). הערה: כאשר התאים כ 60-70% ומחוברות, הם מוכנים להיות transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 162 μl של מגיב transfection ל1,133 μl של התקשורת בסרום המופחתת בצינור microcentrifuge 11. יש להימנע ממגע של מגיב transfection חי עם קיר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 24 מיקרוגרם של pLL3.7 eGFP (או מבנה אחר), 15.6 מיקרוגרם של אלמנט תגובת Rev (RRE), 6.0 מיקרוגרם של REV, ו -8.4 מיקרוגרם של גליקופרוטאין וירוס stomatitis שלפוחי (VSVG) למגיב transfection / Rתערובת תקשורת הסרום צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיה הצמיחה עם 16 מיליליטר של 10% FBS בDMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את תערובת DNA / מגיב transfection / מדיה סרום מופחתת ירידה מבחינת לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את המנות כמה פעמים בכיוון קדימה ואחורה ואחריו כיוון שמאלה וימינה. זה נורמלי לראות כמה תאי HEK293T מנותקים בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, להחליף את התקשורת בצלחת עם 25 מיליליטר של תקשורת צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, לאסוף תקשורת הצמיחה המכילה lentivirus (האוסף הראשון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.2.10 לאסוף יותר lentivirus (האוסף השני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת האוסף הראשון והשני, ולהסיר פסולת תא על ידי צנטריפוגה (2500 XG במשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את האוסף עם מסנן בקבוק העליון חד פעמי (0.45 מיקרומטר נקבובית), ולרכז את הנגיף על ידי צנטריפוגה האוסף ב31,400 XG לשעה 2 ב RT (JA-20 הרוטור). סמן את החלק התחתון של צינור צנטריפוגות בי גלולה נמצא. למזוג supernatant, ולהשאיר את הצינור ההפוך ב RT במשך 15 דקות על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה המכיל וירוס עם של 1X PBS 100 μl. למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הווירוס מרוכז ב -80 ° C. הימנע מחזורים להקפיא להפשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות האופטימלית של וירוס צריך transduce קאקו-2 תאים על ידי טיטרציה. כדי לחסוך בעלויות, השתמש בצלחת 24 גם (0.3 מיליליטר של תקשורת צמיחה / טוב) במקום צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים לטיטרציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמויות גדלות והולכות של הנגיף המרוכז (0, 1, 2, 5, 10, 25, ו -50 μl / טוב) בתוספת polybrene (ריכוז = 5 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) ולמחוברות 40-70% קאקו-2 תאים. לנער את צלחת 24 גם בעדינות כפי שמתואר ב1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג ביטוי גנים שלהם (שלב 2.1.10.) (תחתון 2 איור4 פנלים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז הביטוי של transgene בדרך כלל נגרם, לשמור על תאי transduced לניסויים עתידיים ולפקח באופן רציף ביטוי גנים שלהם (שלב 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. גירוי ההפרשה ליפופרוטאין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצלחת תרבית הרקמה הרגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת שומנים 100X על ידי ערבוב 50 מ&quot;ג של חומצה אולאית, 40 מ&quot;ג של לציטין, ו -48 מ&quot;ג של נתרן taurocholate. תביא את הנפח עד 900 μl עם PBS (מספיק עבור 8 מנות). מערבולת תערובת השומנים במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl של תערובת השומנים 100X ל89.1 מיליליטר של תקשורת צמיחה. לערבב, ולסנן את התקשורת המכיל שומנים. הריכוזים הסופיים (1X) של חומצה אולאית, לציטין, וtaurocholate נתרן הם 2.0 מ&quot;מ, 1.36 מ&quot;מ, ו1.0 מ&quot;מ, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של התקשורת המכיל שומנים לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם התקשורת המכיל שומנים במשך 4 שעות ב37° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת הצמיחה לתאים כדי לאסוף את הפרשת השומנים בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 2 באינקובטור 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המדיה המכיל שומנים בדם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת הקרום החדיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפעולות 3.1.1-3.1.2 להכין את תערובת השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של התקשורת המכיל שומנים לתא הפסגה ו -10 מיליליטר של תקשורת הצמיחה לתא basolateral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 4 שעות בחממה 37 ° C. לאסוף את המדיה המכיל ליפופרוטאין בתא basolateral. </li></ol></li></ol> 4. בידוד ליפופרוטאין (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פסולת התא מהתקשורת המכיל ליפופרוטאין על ידי צנטריפוגה (2,000 XG במשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את התקשורת לתוך שפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5.95 גרם של נתרן כלורי לתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם sample ינותח על ידי TEM, להוסיף לוח מעכבי פרוטאז קוקטייל 1 כדי לשמור על השלמות של ליפופרוטאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הנפח עד 23 מיליליטר עם מים (1.2 גרם מיליליטר NaCl פתרון צפיפות /). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את המומסים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג כל הפתרון לתוך צינור ultracentrifuge פוליקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות כיסוי פתרון צפיפות 1.2 גר &#39;/ מיליליטר עם 0.5 מיליליטר מים (1.0 / מיליליטר צפיפות ז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הצינור לפי משקל ולא לפי נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לטעון צינורות בהרוטור T865. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הדגימות בultracentrifuge ב429460 XG במשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לבודד את הפתרון 0.5 מיליליטר העליון על ידי pipetting העדין. שמור את הצינור כעדיין אפשרית כ. </li></ol> ניתוח 5. TEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מיליליטר של 2% חומצת phosphotungstic (w / v) ולהתאים את ה- pH 6.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן 2% חומצת phosphotungstic עם מסנן מזרק (גודל נקבובית: 0.2 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של 20 μl של מדגם ליפופרוטאין בצלחת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של 20 μl של 2% חומצת phosphotungstic המסונן ליד המדגם על אותה הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שחרר רשת EM עם הצד המשעמם נח על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את הצד של רשת EM על נייר סינון כדי להסיר את המדגם מהרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שחרר את רשת EM עם הצד המשעמם נח על 2% חומצת phosphotungstic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את הצד של רשת EM על נייר סינון כדי להסיר את חומצת phosphotungstic מהרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות TEM, ללכוד את התמונות של ליפופרוטאין (איור 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood.">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li><li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine.">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li><li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation.">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li><li>Lo, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation.">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li><li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption.">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li><li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability.">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li><li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein.">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li><li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm.">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li><li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+biosynthetic+interaction+network+component,+TMEM24,+facilitates+insulin+reserve+pool+release.">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li><li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saturated,+mono-,+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells.">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li><li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., M&#233;nard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+and+human+fetal+colon:+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport.">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li><li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly.">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

במאמר זה, שתי מערכות שיכולים לשמש כדי לשמור קאקו-2 תאים מתוארים, כלומר, צלחת תרבית רקמה הרגילה וקרום החדיר. היתרונות של שימוש במערכת הקרום החדיר כוללים הפרדה של הפסגה ותאי basolateral, ואת יכולת דגירה תערובת השומנים ולאסוף את ההפרשה ליפופרוטאין בו זמנית. עם זאת, מוסיף קרום ה...

מחקרים של ספיגה במעיים של שומן, ותרופות מסיסים בשומנים וויטמינים יכולים להתנהל in vivo על ידי שימוש במודל פיסטולה הלימפה 1 - 4. עם זאת, הטכניקות הניתוחיות המעורבים הן לא רק אתגר, אבל גם יקרות. למרות in vivo גישות המבוסס על ניתוח צואה עשויה להיות מנוצלת, הם משמשים בעיקר כדי לקבוע את ספיגת אחוזים על ידי מערכת עיכול 2,5. המודל במבחנה המתואר במאמר זה הוא יותר חסכוני, והטכניקות מעורבות הן ללא ספק פחות מאתגרות. מחקרי הנדסה גנטיים הם גם חסכוניים יותר ופחות כאשר הם נערכו באמצעות מודל במבחנה זה זמן רב. מאז חומרי שומנים מסיסים הנלקחים על ידי enterocytes ארוזים ליפופרוטאינים 6,7, את האפקטיביות של מודל זה במבחנה כדי לייצר ליפופרוטאינים היא קריטיות. Intestina שתי העיקריליפופרוטאינים l הם chylomicrons ומאוד ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (VLDL). Chylomicrons, מוגדר כיפופרוטאינים עם 80 ננומטר או יותר בקוטר, מיוצר אך ורק על ידי המעי הדק כאשר שומנים הם בשפע נוכחי בלומן במערכת העיכול. מאז הם יפופרוטאינים הגדולים, chylomicrons הם להעלות על הדעת מובילי שומנים יעילים ביותר. מודל זה במבחנה, שהוא מסוגל לייצר chylomicrons 8, יכול לשמש כדי לחקור קליטה תזונתית שומן, ספיגת ויטמין מסיס בשומנים על ידי המעיים, וזמינות ביולוגית תרופה אוראלית lipophilic. הנוכחות של מולקולות שומנים מסיסים, ויטמינים, או סמים בשבריר ליפופרוטאין היא אינדיקטור של קליטתם על ידי המעי הדק. כפי שנאמר קודם לכן, מודל זה יכול לשמש כדי לשפר את הזמינות הביולוגית תרופה אוראלית lipophilic 6. מאמר זה מתאר כיצד יש לשמור על קאקו-2 תאים בקרום חדיר או מנות בתרבית רקמה רגילות, איך מיל השומניםxture לגירוי ייצור ליפופרוטאין צריך להיות מוכן, איך מערכת ביטוי lentivirus יכולה להיות מועסקות על מנת להשיג ביטוי יתר יעיל, וכיצד יש לנתח יפופרוטאינים המבודדים.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>16750-112</td><td>Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher</td><td>3600511</td><td>We do not heat inactivate our serum</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Permeable membrane system</td><td>Fisher</td><td>7200173</td><td>10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td>Tissue culture dish</td></tr><tr><td>15 cm dish</td><td>Fisher</td><td>08-772-24</td><td>Tissue culture dish</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Fisher</td><td>12565163</td><td>Tissue culture plate</td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Fisher</td><td>PRE2691</td><td>Can be substituted with other transfection reagent</td></tr><tr><td>Reduced serum media</td><td>Invitrogen</td><td>11058021</td><td>For transfection</td></tr><tr><td>pLL3.7 eGFP</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.addgene.org/11795/&quot;&gt;https://www.addgene.org/11795/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Bottle-top filter</td><td>Fisher</td><td>9761120</td><td>0.45 mm pore</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Oleic acid</td><td>Sigma</td><td>01383-5G</td><td>Prevent freeze-thaw cycle</td></tr><tr><td>Lecithin&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>IC10214625</td><td>Egg lecithin&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium taurocholate</td><td>Fisher</td><td>NC9620276</td><td>Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free)</td><td>Fisher</td><td>5892791001</td><td>Used mainly for samples that need TEM analysis</td></tr><tr><td>Polycarbonate ultracentrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>NC9696153</td><td>Reusing it multiple times will collapse the tube</td></tr><tr><td>Lid for ultracentrifuge tube</td><td>Fisher</td><td>NC9796914</td><td>A tool is required to remove the tube/lid from rotor</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Fisher</td><td>50-949-261</td><td>Disposable</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td>Pore size = 0.2 mm; nylon</td></tr><tr><td>Phosphotungstic acid</td><td>Fisher</td><td>AC208310250</td><td>For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0</td></tr><tr><td>Tweezer</td><td>Fisher</td><td>50-238-62</td><td>Extra fine and strong tips</td></tr><tr><td>Formvar/carbon grid</td><td>Fisher</td><td>50-260-34</td><td>Formvar/carbon film square grid 400 Copper</td></tr></tbody></table>

using caco-2 cells to study lipid transport by the intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

איור קאקו-2 תאים נורמלים 1 מציג 13 ימים לאחר מחוברות. המראה של מבנים בצורת כיפה וטיפי שומנים תאיות אופייני של קאקו-2 תאים מובחנים. כאשר קאקו-2 התאים אינם מפוזרים באופן שווה במהלך זריעה, הם גוש ולגדול באזורים מסוימים של המנה; ויהיו כמה אזורים בצלחת ללא כל...

Watch this Scientific Journal Video about Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine at JoVE.com

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

using-caco-2-cells-to-study-lipid-transport-by-the-intestine

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  California Northstate University. Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Video: Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Cholesterol Efflux Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of cellular membranes, apoptosis and necrosis 1. Cells can source cholesterol from intracellular synthesis and from plasma lipoproteins, both sources are sufficient to fully satisfy cells' requirements for cholesterol. The processes of cholesterol synthesis and uptake are tightly regulated and deficiencies of cholesterol are rare 2. Excessive cholesterol is more common problem 3. With the exception of hepatocytes and to some degree adrenocortical cells, cells are unable to degrade cholesterol. Cells have two options to reduce their cholesterol content: to convert cholesterol into cholesteryl esters, an option with limited capacity as overloading cells with cholesteryl esters is also toxic, and cholesterol efflux, an option with potentially unlimited capacity. Cholesterol efflux is a specific process that is regulated by a number of intracellular transporters, such as ATP binding cassette transporter proteins A1 (ABCA1) and G1 (ABCG1) and scavenger receptor type B1. The natural acceptor of cholesterol in plasma is high density lipoprotein (HDL) and apolipoprotein A-I. 
The cholesterol efflux assay is designed to quantitate the rate of cholesterol efflux from cultured cells. It measures the capacity of cells to maintain cholesterol efflux and/or the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol released from cells. The assay consists of the following steps. Step 1: labelling cellular cholesterol by adding labelled cholesterol to serum-containing medium and incubating with cells for 24-48 h. This step may be combined with loading of cells with cholesterol. Step 2: incubation of cells in serum-free medium to equilibrate labelled cholesterol among all intracellular cholesterol pools. This stage may be combined with activation of cellular cholesterol transporters. Step 3: incubation of cells with extracellular acceptor and quantitation of movement of labelled cholesterol from cells to the acceptor. If cholesterol precursors were used to label newly synthesized cholesterol, a fourth step, purification of cholesterol, may be required.
The assay delivers the following information: (i) how a particular treatment (a mutation, a knock-down, an overexpression or a treatment) affects the capacity of cell to efflux cholesterol and (ii) how the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol is affected by a disease or a treatment. This method is often used in context of cardiovascular research, metabolic and neurodegenerative disorders, infectious and reproductive diseases.

The cholesterol assay is designed to quantitate the rate of cholesterol efflux from cultured cells and the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol released from cells. The assay consists of labelling cells with cholesterol, equilibration of cholesterol among intracellular pools and release of cholesterol to an extracellular acceptor.

בזרימת כולסטרול Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

Medicine

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. Additionally, traversing cellular barriers in the body is crucial for both oral delivery of therapeutic NCs into the circulation and transport from the blood into tissues, where intervention is needed. NC transport across cellular barriers is achieved by: (i) the paracellular route, via transient disruption of the junctions that interlock adjacent cells, or (ii) the transcellular route, where materials are internalized by endocytosis, transported across the cell body, and secreted at the opposite cell surface (transyctosis). Delivery across cellular barriers can be facilitated by coupling therapeutics or their carriers with targeting agents that bind specifically to cell-surface markers involved in transport. Here, we provide methods to measure the extent and mechanism of NC transport across a model cell barrier, which consists of a monolayer of gastrointestinal (GI) epithelial cells grown on a porous membrane located in a transwell insert. Formation of a permeability barrier is confirmed by measuring transepithelial electrical resistance (TEER), transepithelial transport of a control substance, and immunostaining of tight junctions. As an example, ~200&#160;nm polymer NCs are used, which carry a therapeutic cargo and are coated with an antibody that targets a cell-surface determinant. The antibody or therapeutic cargo is labeled with 125I for radioisotope tracing and labeled NCs are added to the upper chamber over the cell monolayer for varying periods of time. NCs associated to the cells and/or transported to the underlying chamber can be detected. Measurement of free 125I allows subtraction of the degraded fraction. The paracellular route is assessed by determining potential changes caused by NC transport to the barrier parameters described above. Transcellular transport is determined by addressing the effect of modulating endocytosis and transcytosis pathways.

Many therapeutic applications require safe and efficient transport of drug carriers and their cargoes across cellular barriers in the body. This article describes an adaptation of established methods to evaluate the rate and mechanism of transport of drug nanocarriers (NCs) across cellular barriers, such as the gastrointestinal (GI) epithelium.

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

Bioengineering

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Exploring the Regulation of Lipid Droplet Catabolism through Lipophagy

Macroautophagy, commonly referred to as autophagy, is a highly conserved cellular process responsible for the degradation of cellular components. This process is particularly prominent under conditions such as fasting, cellular stress, organelle damage, cellular damage, or aging of cellular components. During autophagy, a segment of the cytoplasm is enclosed within double-membrane vesicles known as autophagosomes, which then fuse with lysosomes. Following this fusion, the contents of autophagosomes undergo non-selective bulk degradation facilitated by lysosomes. However, autophagy also exhibits selective functionality, targeting specific organelles, including mitochondria, peroxisomes, lysosomes, nuclei, and lipid droplets (LDs). Lipid droplets are enclosed by a phospholipid monolayer that isolates neutral lipids from the cytoplasm, protecting cells from the harmful effects of excess sterols and free fatty acids (FFAs). Autophagy is implicated in various conditions, including neurodegenerative diseases, metabolic disorders, and cancer. Specifically, lipophagy -- the autophagy-dependent degradation of lipid droplets -- plays a crucial role in regulating intracellular FFA levels across different metabolic states. This regulation supports essential processes such as membrane synthesis, signaling molecule formation, and energy balance. Consequently, impaired lipophagy increases cellular vulnerability to death stimuli and contributes to the development of diseases such as cancer. Despite its significance, the precise mechanisms governing lipid droplet metabolism regulated by lipophagy in cancer cells remain poorly understood. This article aims to describe confocal imaging acquisition and quantitative imaging analysis protocols that enable the investigation of lipophagy associated with metabolic changes in cancer cells. The results obtained through these protocols may shed light on the intricate interplay between autophagy, lipid metabolism, and cancer progression. By elucidating these mechanisms, novel therapeutic targets may emerge for combating cancer and other metabolic-related diseases.

Lipophagy is a selective form of autophagy that involves the degradation of lipid droplets. Dysfunctions in this process are associated with cancer development. However, the precise mechanisms are not yet fully understood. This protocol describes quantitative imaging approaches to better understand the interplay between autophagy, lipid metabolism, and cancer progression.

חקר הוויסות של קטבוליזם טיפות שומנים באמצעות ליפופגיה

Macroautophagy, commonly referred to as autophagy, is a highly conserved cellular process responsible for the degradation of cellular components. This ...

Cancer Research

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between colorectal tumor cells and the immune system. Colorectal carcinoma is among the most common type of cancer, typically treated by surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Advantages of radiotherapy in targeting the tumor are well known. However, even limited exposures of healthy tissues are of great concern, particularly regarding the effects on the intestinal barrier and the immune system. The adopted setup allows to study the interplay between two cell populations in a condition more similar to the physiological one, when compared to normal cell cultures. For this purpose, we resort to different techniques and we used an in vitro co-culture model, based on Caco-2 cells differentiated as a monolayer and PBMC, sharing the same culture medium. This protocol has been developed to focus on both macroscopic effects, i.e. cell viability and Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER), and, through western blot, molecular alterations, i.e. the activation of inflammatory pathway in immune cells and the tight junction protein expression in Caco-2 cells. Initial evaluation of radiation effects on Caco-2 cell viability was assessed via the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan blue assays, while TEER was measured at fixed time intervals through an ohmmeter specifically designed for co-culture systems. In this way, the effects due to radiation, the presence of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), and eventually their synergistic effect, can be demonstrated. Through these complementary techniques, we observed a high radio-resistance of Caco-2 within the range of 2 - 10 Gy of X-rays and an increased Caco-2 monolayer permeability when PBMCs were added. In particular, PBMC presence was found to be associated with the variation in the tight junction scaffold proteins expression.

We present a protocol to investigate the crosstalk between X-ray-irradiated Caco-2 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The protocol starts with Caco-2 irradiation and set-up of the co-culture with PBMC; subsequently, trans-epithelial electrical resistance is measured regularly over 48 h and western blot performed in both Caco-2 and PBMC.

שיטה תרבות משותפת לחקור Crosstalk בין רנטגן מוקרן קאקו-2 תאים, PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

Immunology and Infection

Lipid Exchange Assay in Living Cells

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the outer leaflet drives the membrane&#39;s propensity to form lipid rafts. The transient nature of lipid rafts makes it difficult to study in living cells. Therefore, methods that add or remove raft-forming lipids at&#160;the outer leaflet of living cells facilitate studying the characteristics of rafts, such as their effects on membrane proteins. Lipid exchange experiments developed in our lab utilize lipid-loaded cyclodextrins to remove and add exogenous phospholipids to change the lipid constitution of the plasma membrane. Substituting the membrane with a raft or non-raft-forming lipid can aid in studying the effects on transmembrane protein activity. Here, we describe a method for lipid exchange on the outer leaflet of the plasma membrane using lipid-loaded cyclodextrin. We demonstrate the preparation of the exchange media and the subsequent treatment of attached mammalian cells. We also showcase how to measure the efficiency of exchange using HP-TLC. This protocol yields a nearly complete replacement of the outer leaflet with exogenous lipids without altering cellular viability, permitting further experimentation on modified intact plasma membranes.

We describe a method for using cyclodextrin to mediate exchange between lipids of the plasma membrane with exogenous lipids. This technique can be paired with experiments studying transmembrane proteins, which behave differently in lipid raft-like environments than they do in non-raft-like environments.

בדיקת חילופי שומנים בתאים חיים

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Biochemistry

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) molecules, before they are packaged into chylomicrons for transport to the lymph or into cytosolic lipid droplets (LDs) for intracellular storage. A crucial step for the formation of LDs is the catalytic activity of diacylglycerol acyltransferases (DGAT) in the final step of TG synthesis. LDs are important to buffer toxic lipid species and regulate cellular metabolism in different cell types. Since the human intestinal epithelium is regularly confronted with high concentrations of lipids, LD formation is of great importance to regulate homeostasis. Here we describe a simple assay for the characterization and quantification of LD formation (LDF) upon stimulation with the most common unsaturated fatty acid, oleic acid, in human intestinal organoids. The LDF assay is based on the LD-specific fluorescent dye LD540, which allows for quantification of LDs by confocal microscopy, fluorescent plate reader, or flow cytometry. The LDF assay can be used to characterize LD formation in human intestinal epithelial cells, or to study human (genetic) disorders that affect LD metabolism, such as DGAT1 deficiency. Furthermore, this assay can also be used in a high-throughput pipeline to test novel therapeutic compounds, which restore defects in LD formation in intestinal or other types of organoids.

This protocol describes an assay for the characterization of lipid droplet (LD) formation in human intestinal organoids upon stimulation with fatty acids. We discuss how this assay is used for quantification of LD formation, and how it can be used for high throughput screening for drugs that affect LD formation.

שיטת פלואורסצנטית מבוססת על האפיון והקוונפיקציה של היווצרות Droplet ליפיד בגוף מעיים אנושי

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing a barrier to foreign particles. Impaired epithelial transport (ion, nutrient, or drugs) has been associated with many diseases and can have consequences that extend beyond the normal physiological functions of the transporters, such as by influencing epithelial integrity and the gut microbiome. Understanding the function and regulation of transport proteins is critical for the development of improved therapeutic interventions. The biggest challenge in the study of epithelial transport is developing a suitable model system that recapitulates important features of the native intestinal epithelial cells. Several in vitro cell culture models, such as Caco-2, T-84, and HT-29-Cl.19A cells are typically used in epithelial transport research. These cell lines represent a reductionist approach to modeling the epithelium and have been used in many mechanistic studies, including their examination of epithelial-microbial interactions. However, cell monolayers do not accurately reflect cell-cell interactions and the in vivo microenvironment. Cells grown in 3D have shown to be promising models for drug permeability studies. We show that Caco-2 cells in 3D can be used to study epithelial transporters. It is also important that studies in Caco-2 cells are complemented with other models to rule out cell specific effects and to take into account the complexity of the native intestine. Several methods have been previously used to assess the functionality of transporters, such as everted sac and uptake in isolated epithelial cells or in isolated plasma membrane vesicles. Taking into consideration the challenges in the field with respect to models and the measurement of transport function, we demonstrate here a protocol to grow Caco-2 cells in 3D and describe the use of an Ussing chamber as an effective approach to measure serotonin transport, such as in intact polarized intestinal epithelia.

We describe simple methods to study the regulation of intestinal serotonin transporter (SERT) function and expression using an in vitro cell culture model of Caco-2 cells grown in 3D&#160;and an ex vivo model of mouse intestines. These methods are applicable to the study of other epithelial transporters.

שיטות לחקר תפקוד החלבון התחבורה אפיתל וביטוייה המעי Native ו קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video