This work was supported by the Seed Grant Award from California Northstate University College of Pharmacy (to AMN). The authors would like to thank California Northstate University College of Pharmacy for covering the publication cost of this article, and George Talbott for his help in editing this manuscript.

1. תחזוקה של קאקו-2 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלים בתרבית רקמה רגילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את קאקו-2 תאים מבקבוקון קפוא על ידי הצבת את הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, ומייד להוסיף אותם לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה (15% בסרום שור עוברי מחומם מראש (FBS ) בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM)). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קאקו-2 התאים הגיעו 50-70 מפגש%, לפצל אותם 1: 6 על ידי דוגרים התאים עם 3 מיליליטר של 0.05% חומצת ethylenediaminetetraacetic / 0.53 מ&quot;מ טריפסין (EDTA) על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מנותקים (15 דקות) . כדי למנוע clumping תא, לערבב את התאים מספר פעמים על ידי pipetting העדין. הוסף 0.5 מיליליטר של תאי trypsinized לצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים המכילה 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה מחוממת מראש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את המנות כמה פעמים בכיוון קדימה ואחורה ואחריו כיוון שמאלה וימינה. הימנע מתערבל המנותכפי שהוא עשוי לגרום לפיזור של תאים שאינו שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים על משטח שטוח בחממה 37 ° C מסופקת עם 5% CO 2. משטחים משופעים עשויים גם לגרום לפיזור של תאים שאינו שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את תקשורת צמיחת יום לאחר תחילת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התאים ולהקליט את היום שהם מגיעים למפגש. זה ייקח כ 1 שבוע לתאים מגיעים למפגש מהיום שהם נפרדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את תקשורת הצמיחה פעמיים בשבוע לפני התאים להגיע למפגש. ברגע שהתאים הגיעו מפגש, לשנות את תקשורת צמיחה בכל יום אחר. אחרי התאים 7 ימים לאחר מחוברות, לשנות את תקשורת הצמיחה יומית. הערה: התאים מוכנים לניסויים כאשר הם 13 ימים שלאחר מחוברות (איור 1). מאז תאי סופו של הדבר להיות פחות יעילים בייצור יפופרוטאינים, להשתמש בתאים שבין 13 עד 17 ימים לאחר מחוברות 8. עבור לשלב 3 על איך לבצע את הניסוי.</li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת הקרום החדיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי קאקו-2 תאים בכנס הקרום החדיר כמתואר בשלב 1.1.1.1. לעיל. הימנע משימוש בתאים מבקבוקון קפוא כי צמיחת התאים שלהם היא בדרך כלל איטית יותר (תקופת החלמה). בקצרה, להוסיף 0.5 מיליליטר של תאי trypsinized לתא הפסגה (תא עליון) המכיל 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה מחוממת מראש. כמו כן, להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המחוממת מראש לתא basolateral (בתא תחתון). הערה: התרגול הטוב ביותר, להוסיף את תקשורת הצמיחה לתא הפסגה הראשונה ולאחר מכן לתא basolateral. כאשר מוציא את המדיה הישנה, ​​להסיר את המדיה basolateral לפני תקשורת הפסגה. הימנע תוקע את קרום פוליקרבונט כפי שהוא עשוי להיקרע הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשל הראות לקויה תא דרך קרום פוליקרבונט, זרע קאקו-2 התאים בצלחת תרבית רקמה רגילה עם צפיפות דומה, ולהשתמש במנה זו לשפוט את מפגש התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב יםteps 1.1.2-1.1.6 לעיל. </li></ol></li></ol> 2. ג&#39;ין ביטוי יתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגישת transfection הרגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי קאקו-2 תאים בצלחת תרבית רקמה, כמתואר ב1.1.1.1.-1.1.4 לעיל. הערה: כאשר התאים כ 40-50% ומחוברות, הם מוכנים להיות transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 67 μl של מגיב transfection לμl 472 של התקשורת בסרום המופחתת בצינור microcentrifuge. יש להימנע ממגע של מגיב transfection חי עם קיר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 23 מיקרוגרם של pLL3.7 משופרים חלבון ירוק ניאון (eGFP) 9 למגיב transfection / תערובת תקשורת סרום מופחתת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת צמיחת קאקו-2 תאים עם 8 מיליליטר של 10% FBS בDMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את תערובת DNA / מגיב transfection / מדיה סרום מופחתת ירידה מבחינת לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את המנות כמה פעמים בקדימה ותואר ראשוןכיוון ckward אחרי כיוון שמאלה וימינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיה בצלחת עם 10 מיליליטר של תקשורת צמיחת יום לאחר תחילת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על ביטוי גנים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג ביטוי גנים ללא 6-diamidino-2-phenylindole צביעת 4 &#39;, (DAPI). באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לקבוע את האחוזים של תאים שהם ירוקים. אחוז מייצג את יעילות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג ביטוי גנים עם מכתים DAPI. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם מי מלח פוספט (PBS) שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של פורמלדהיד 4% ב- ​​PBS (דגירה 10 דקות ב RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בחושך במשך 15 דקות ב RT עם 8 מיליליטר של PBS המכיל 1: 500 DAPI, BSA 1%, digitonin 0.01%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uלשיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לקבוע את מספר התאים שהם בצבע ירוק / כחול ביחס לאלה ש( פנל עליון איור 2) כחול. בחישוב אחוז מייצג את יעילות transfection. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת ביטוי יתר lentivirus 10 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע אנושיים כליה עוברית (HEK) 293T בצלחת תרבית רקמת 15 סנטימטר (10% FBS בDMEM כתקשורת הצמיחה שלהם). הערה: כאשר התאים כ 60-70% ומחוברות, הם מוכנים להיות transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 162 μl של מגיב transfection ל1,133 μl של התקשורת בסרום המופחתת בצינור microcentrifuge 11. יש להימנע ממגע של מגיב transfection חי עם קיר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 24 מיקרוגרם של pLL3.7 eGFP (או מבנה אחר), 15.6 מיקרוגרם של אלמנט תגובת Rev (RRE), 6.0 מיקרוגרם של REV, ו -8.4 מיקרוגרם של גליקופרוטאין וירוס stomatitis שלפוחי (VSVG) למגיב transfection / Rתערובת תקשורת הסרום צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיה הצמיחה עם 16 מיליליטר של 10% FBS בDMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את תערובת DNA / מגיב transfection / מדיה סרום מופחתת ירידה מבחינת לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את המנות כמה פעמים בכיוון קדימה ואחורה ואחריו כיוון שמאלה וימינה. זה נורמלי לראות כמה תאי HEK293T מנותקים בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, להחליף את התקשורת בצלחת עם 25 מיליליטר של תקשורת צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הבא, לאסוף תקשורת הצמיחה המכילה lentivirus (האוסף הראשון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.2.10 לאסוף יותר lentivirus (האוסף השני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת האוסף הראשון והשני, ולהסיר פסולת תא על ידי צנטריפוגה (2500 XG במשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את האוסף עם מסנן בקבוק העליון חד פעמי (0.45 מיקרומטר נקבובית), ולרכז את הנגיף על ידי צנטריפוגה האוסף ב31,400 XG לשעה 2 ב RT (JA-20 הרוטור). סמן את החלק התחתון של צינור צנטריפוגות בי גלולה נמצא. למזוג supernatant, ולהשאיר את הצינור ההפוך ב RT במשך 15 דקות על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה המכיל וירוס עם של 1X PBS 100 μl. למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הווירוס מרוכז ב -80 ° C. הימנע מחזורים להקפיא להפשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הכמות האופטימלית של וירוס צריך transduce קאקו-2 תאים על ידי טיטרציה. כדי לחסוך בעלויות, השתמש בצלחת 24 גם (0.3 מיליליטר של תקשורת צמיחה / טוב) במקום צלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים לטיטרציה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמויות גדלות והולכות של הנגיף המרוכז (0, 1, 2, 5, 10, 25, ו -50 μl / טוב) בתוספת polybrene (ריכוז = 5 מיקרוגרם / מיליליטר סופי) ולמחוברות 40-70% קאקו-2 תאים. לנער את צלחת 24 גם בעדינות כפי שמתואר ב1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג ביטוי גנים שלהם (שלב 2.1.10.) (תחתון 2 איור4 פנלים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז הביטוי של transgene בדרך כלל נגרם, לשמור על תאי transduced לניסויים עתידיים ולפקח באופן רציף ביטוי גנים שלהם (שלב 2.1.10.). </li></ol></li></ol> 3. גירוי ההפרשה ליפופרוטאין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצלחת תרבית הרקמה הרגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת שומנים 100X על ידי ערבוב 50 מ&quot;ג של חומצה אולאית, 40 מ&quot;ג של לציטין, ו -48 מ&quot;ג של נתרן taurocholate. תביא את הנפח עד 900 μl עם PBS (מספיק עבור 8 מנות). מערבולת תערובת השומנים במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl של תערובת השומנים 100X ל89.1 מיליליטר של תקשורת צמיחה. לערבב, ולסנן את התקשורת המכיל שומנים. הריכוזים הסופיים (1X) של חומצה אולאית, לציטין, וtaurocholate נתרן הם 2.0 מ&quot;מ, 1.36 מ&quot;מ, ו1.0 מ&quot;מ, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של התקשורת המכיל שומנים לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם התקשורת המכיל שומנים במשך 4 שעות ב37° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS פעמים שלוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של תקשורת הצמיחה לתאים כדי לאסוף את הפרשת השומנים בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 2 באינקובטור 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את המדיה המכיל שומנים בדם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במערכת הקרום החדיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפעולות 3.1.1-3.1.2 להכין את תערובת השומנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של התקשורת המכיל שומנים לתא הפסגה ו -10 מיליליטר של תקשורת הצמיחה לתא basolateral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 4 שעות בחממה 37 ° C. לאסוף את המדיה המכיל ליפופרוטאין בתא basolateral. </li></ol></li></ol> 4. בידוד ליפופרוטאין (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פסולת התא מהתקשורת המכיל ליפופרוטאין על ידי צנטריפוגה (2,000 XG במשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את התקשורת לתוך שפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5.95 גרם של נתרן כלורי לתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם sample ינותח על ידי TEM, להוסיף לוח מעכבי פרוטאז קוקטייל 1 כדי לשמור על השלמות של ליפופרוטאין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את הנפח עד 23 מיליליטר עם מים (1.2 גרם מיליליטר NaCl פתרון צפיפות /). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את המומסים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג כל הפתרון לתוך צינור ultracentrifuge פוליקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות כיסוי פתרון צפיפות 1.2 גר &#39;/ מיליליטר עם 0.5 מיליליטר מים (1.0 / מיליליטר צפיפות ז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הצינור לפי משקל ולא לפי נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לטעון צינורות בהרוטור T865. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הדגימות בultracentrifuge ב429460 XG במשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לבודד את הפתרון 0.5 מיליליטר העליון על ידי pipetting העדין. שמור את הצינור כעדיין אפשרית כ. </li></ol> ניתוח 5. TEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מיליליטר של 2% חומצת phosphotungstic (w / v) ולהתאים את ה- pH 6.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן 2% חומצת phosphotungstic עם מסנן מזרק (גודל נקבובית: 0.2 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של 20 μl של מדגם ליפופרוטאין בצלחת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ירידה של 20 μl של 2% חומצת phosphotungstic המסונן ליד המדגם על אותה הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שחרר רשת EM עם הצד המשעמם נח על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את הצד של רשת EM על נייר סינון כדי להסיר את המדגם מהרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות שחרר את רשת EM עם הצד המשעמם נח על 2% חומצת phosphotungstic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפוח בעדינות את הצד של רשת EM על נייר סינון כדי להסיר את חומצת phosphotungstic מהרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות TEM, ללכוד את התמונות של ליפופרוטאין (איור 4). </li></ol>

<ol>
	<li>Drover, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+deficiency+impairs+intestinal+lipid+secretion+and+clearance+of+chylomicrons+from+the+blood.">CD36 deficiency impairs intestinal lipid secretion and clearance of chylomicrons from the blood.</a> J Clin Invest. 115 (5), 1290-1297 (2005).</li><li>Nauli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+is+important+for+chylomicron+formation+and+secretion+and+may+mediate+cholesterol+uptake+in+the+proximal+intestine.">CD36 is important for chylomicron formation and secretion and may mediate cholesterol uptake in the proximal intestine.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1197-1207 (2006).</li><li>Nauli, A. M., Zheng, S., Yang, Q., Li, R., Jandacek, R., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+alkaline+phosphatase+release+is+not+associated+with+chylomicron+formation.">Intestinal alkaline phosphatase release is not associated with chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 284 (4), G583-G587 (2003).</li><li>Lo, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+the+gut+choose+apolipoprotein+B48+but+not+B100+for+chylomicron+formation.">Why does the gut choose apolipoprotein B48 but not B100 for chylomicron formation.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G344-G352 (2008).</li><li>Jandacek, R. J., Heubi, J. E., Tso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+noninvasive+method+for+the+measurement+of+intestinal+fat+absorption.">A novel, noninvasive method for the measurement of intestinal fat absorption.</a> Gastroenterology. 127 (1), 139-144 (2004).</li><li>Nauli, A. M., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+transport+as+a+potential+determinant+of+drug+bioavailability.">Intestinal transport as a potential determinant of drug bioavailability.</a> Curr Clin Pharmacol. 8 (3), 247-255 (2013).</li><li>Tso, P., Nauli, A., Lo, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterocyte+fatty+acid+uptake+and+intestinal+fatty+acid-binding+protein.">Enterocyte fatty acid uptake and intestinal fatty acid-binding protein.</a> Biochem Soc Trans. 32 (Pt 1), 75-78 (2004).</li><li>Nauli, A. M., Sun, Y., Whittimore, J. D., Atyia, S., Krishnaswamy, G., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chylomicrons+produced+by+Caco-2+cells+contained+ApoB-48+with+diameter+of+80-200+nm.">Chylomicrons produced by Caco-2 cells contained ApoB-48 with diameter of 80-200 nm.</a> Physiol Rep. 2 (6), (2014).</li><li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells,+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference.">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33 (3), 401-406 (2003).</li><li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system.">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. (63), e4031 (2012).</li><li>Pottekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+biosynthetic+interaction+network+component,+TMEM24,+facilitates+insulin+reserve+pool+release.">Insulin biosynthetic interaction network component, TMEM24, facilitates insulin reserve pool release.</a> Cell Rep. 4 (5), 921-930 (2013).</li><li>Van Greevenbroek, M. M., van Meer, G., Erkelens, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saturated,+mono-,+and+polyunsaturated+fatty+acids+on+the+secretion+of+apo+B+containing+lipoproteins+by+Caco-2+cells.">Effects of saturated, mono-, and polyunsaturated fatty acids on the secretion of apo B containing lipoproteins by Caco-2 cells.</a> Atherosclerosis. 21 (1), 139-150 (1996).</li><li>Levy, E., Yotov, W., Seidman, E. G., Garofalo, C., Delvin, E., M&#233;nard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caco-2+cells+and+human+fetal+colon:+a+comparative+analysis+of+their+lipid+transport.">Caco-2 cells and human fetal colon: a comparative analysis of their lipid transport.</a> Biochim Biophys Acta. 1439 (3), 353-362 (1999).</li><li>Luchoomun, J., Hussain, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+secretion+of+chylomicrons+by+differentiated+Caco-2+cells.+Nascent+triglycerides+and+preformed+phospholipids+are+preferentially+used+for+lipoprotein+assembly.">Assembly and secretion of chylomicrons by differentiated Caco-2 cells. Nascent triglycerides and preformed phospholipids are preferentially used for lipoprotein assembly.</a> J Biol Chem. 274 (28), 19565-19572 (1999).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

במאמר זה, שתי מערכות שיכולים לשמש כדי לשמור קאקו-2 תאים מתוארים, כלומר, צלחת תרבית רקמה הרגילה וקרום החדיר. היתרונות של שימוש במערכת הקרום החדיר כוללים הפרדה של הפסגה ותאי basolateral, ואת יכולת דגירה תערובת השומנים ולאסוף את ההפרשה ליפופרוטאין בו זמנית. עם זאת, מוסיף קרום החדיר הם יקרים, וקרום פוליקרבונט אינו מאפשר את חשיפת תא טובה. אחד היתרונות של מודל זה במבחנה הוא שמחקרי מניפולציה גנטיים יהיו חסכוניים יותר ופחות זמן רב. ליעילות טובה יותר, יש להשתמש במערכת ביטוי lentivirus. קאקו-2 התאים transduced שומרים בדרך כלל על הביטוי של transgene. היכולת של קאקו-2 תאים לייצר chylomicrons היא בעלת חשיבות עליונה. ללא יכולת זו, קאקו-2 תאים לא יהיו מסוגלים efficiently הובלת חומרי lipophilic, לרבות אך לא רק לתרופות liphophilic, ויטמין A, D, E, K, וכל חומרים מזינים מסיסים בשומנים. השיטות הנכונים לאתגר את קאקו-2 תאים לייצר שני חלקיקי VLDL וchylomicrons מתוארים. הבידוד המוצלח של חלקיקים ליפופרוטאין אלה צריך להיות מאושר על TEM. בהתבסס על הספרות הנוכחית, קאקו-2 דגם זה מציע תחבורת שומנים היעילה ביותר בקרב קאקו-2 דגמים אחרים 12 - 14. עם זאת, במודל vivo cannulation הלימפה עדיין מעביר שומנים ביעילות רבה יותר מאשר כל מודל במבחנה. הסיבות שבבסיס כבר נדונו לאחרונה 8, כלומר כי קאקו-2 תאים לייצר 2 isoforms שונה של אפוליפופרוטאין B, קאקו-2 תאים לא יכולים לסנתז טריגליצרידים מmonoglycerides, והמרכיב קריטי בסרום לbiogenesis chylomicron עשוי להיות נמוך יותר בתקשורת הצמיחה . כמו כן, חשוב להבין את המגבלה של זה במודל חוץ גופית; מודל זה במבחנה אינו כולל כמה גורמים חשובים פוטנציאליים, כגון תנועתיות מעי, האנטומיה של המעיים, ואינטראקציה עם מערכות איברים אחרות. הגורמים העיקריים המאפשרים קאקו-2 תאים לייצר chylomicrons יעילות הם הסוג / כמות השומנים משמשים והתמיינות 8. ללא שילוב הנכון של גורמים אלה, קאקו-2 תאים לא לייצר מספר משמעותי של chylomicrons 8. ראוי לציין, ultracentrifugation שיפוע צפיפות NaCl צריך להתבצע כראוי. הבידוד המוצלח של ליפופרוטאין תלוי בעיתוי (מיידי ללא עיכוב משמעותי), מדגם טוב טיפול (חסון בלי הרבה תסיסה), וpipetting זהיר (מקבל רק את השכבה העליונה). טכניקה נכונה יכולה להיות מתורגלת באמצעות שומנים מוכתמים מראש כדי לעזור להמחיש את שכבת ליפופרוטאין 8. חוץ מזה TEM, ניתוחים ביוכימיים, כלומר, אפוליפופרוטאין B וטריגליצרידים ניתוחים, יכולים להיות גם used כדי לאשר את הבידוד המוצלח של ליפופרוטאין. ניתוחים אלה ביוכימי, שיש לנו הדיווח בעבר 8, יכולים לשמש גם שיטות בכימות קליטה. עם זאת, TEM עדיין צריכה להתבצע בשל הנטייה של ליפופרוטאין כדי לצבור 2, גרימת הערכת יתר פוטנציאל של ייצור chylomicron. מודל זה במבחנה שימושי במיוחד ללימוד ספיגת שומן תזונתי וספיגה במעי של תרופות lipophilic, ויטמינים, שומנים וחומרים מזינים מסיסים אחרים. זה גם יכול לשמש כמודל לשיפור זמינות ביולוגית ירודה של תרופות אוראליות lipophilic. מאז חומרי שומנים מסיסים ארוזים לתוך chylomicrons ידי enterocytes לתחבורה למחזור, קאקו-2 תאים מייצרי chylomicron יהיו יעילים יותר בקליטת תרופות lipophilic. בנוסף, מודל זה מאפשר לחוקרים לקבוע את תפקידו של גן מסוים בקליטת תרופה על ידי המעיים (Pharmacogenetics). זה גם מאפשר בvestigators להשוות את ההשפעה של שומנים תזונתיים שונים בזמינות ביולוגית תרופה אוראלית lipophilic. כל היישומים הללו כבר דנו בעבר 6.

מחקרים של ספיגה במעיים של שומן, ותרופות מסיסים בשומנים וויטמינים יכולים להתנהל in vivo על ידי שימוש במודל פיסטולה הלימפה 1 - 4. עם זאת, הטכניקות הניתוחיות המעורבים הן לא רק אתגר, אבל גם יקרות. למרות in vivo גישות המבוסס על ניתוח צואה עשויה להיות מנוצלת, הם משמשים בעיקר כדי לקבוע את ספיגת אחוזים על ידי מערכת עיכול 2,5. המודל במבחנה המתואר במאמר זה הוא יותר חסכוני, והטכניקות מעורבות הן ללא ספק פחות מאתגרות. מחקרי הנדסה גנטיים הם גם חסכוניים יותר ופחות כאשר הם נערכו באמצעות מודל במבחנה זה זמן רב. מאז חומרי שומנים מסיסים הנלקחים על ידי enterocytes ארוזים ליפופרוטאינים 6,7, את האפקטיביות של מודל זה במבחנה כדי לייצר ליפופרוטאינים היא קריטיות. Intestina שתי העיקריליפופרוטאינים l הם chylomicrons ומאוד ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (VLDL). Chylomicrons, מוגדר כיפופרוטאינים עם 80 ננומטר או יותר בקוטר, מיוצר אך ורק על ידי המעי הדק כאשר שומנים הם בשפע נוכחי בלומן במערכת העיכול. מאז הם יפופרוטאינים הגדולים, chylomicrons הם להעלות על הדעת מובילי שומנים יעילים ביותר. מודל זה במבחנה, שהוא מסוגל לייצר chylomicrons 8, יכול לשמש כדי לחקור קליטה תזונתית שומן, ספיגת ויטמין מסיס בשומנים על ידי המעיים, וזמינות ביולוגית תרופה אוראלית lipophilic. הנוכחות של מולקולות שומנים מסיסים, ויטמינים, או סמים בשבריר ליפופרוטאין היא אינדיקטור של קליטתם על ידי המעי הדק. כפי שנאמר קודם לכן, מודל זה יכול לשמש כדי לשפר את הזמינות הביולוגית תרופה אוראלית lipophilic 6. מאמר זה מתאר כיצד יש לשמור על קאקו-2 תאים בקרום חדיר או מנות בתרבית רקמה רגילות, איך מיל השומניםxture לגירוי ייצור ליפופרוטאין צריך להיות מוכן, איך מערכת ביטוי lentivirus יכולה להיות מועסקות על מנת להשיג ביטוי יתר יעיל, וכיצד יש לנתח יפופרוטאינים המבודדים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16750-112</td>
			<td>Pre-warm the growth media in individual tissue culture dish before adding cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>3600511</td>
			<td>We do not heat inactivate our serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Cells can be washed with PBS prior to trypsin treatment&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeable membrane system</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>7200173</td>
			<td>10-cm dish, 3-mm pore size, polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-E</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-24</td>
			<td>Tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565163</td>
			<td>Tissue culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid-based transfection reagent</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PRE2691</td>
			<td>Can be substituted with other transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 eGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td><a href="https://www.addgene.org/11795/">https://www.addgene.org/11795/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>9761120</td>
			<td>0.45 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9840454</td>
			<td>10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01383-5G</td>
			<td>Prevent freeze-thaw cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lecithin&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>IC10214625</td>
			<td>Egg lecithin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium taurocholate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9620276</td>
			<td>Product discontinued; alternative catalog number: 50-121-7956</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet (EDTA-free)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>5892791001</td>
			<td>Used mainly for samples that need TEM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate ultracentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9696153</td>
			<td>Reusing it multiple times will collapse the tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lid for ultracentrifuge tube</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9796914</td>
			<td>A tool is required to remove the tube/lid from rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-949-261</td>
			<td>Disposable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>Pore size = 0.2 mm; nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphotungstic acid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC208310250</td>
			<td>For preparing 2% phosphotungstic acid, pH 6.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-238-62</td>
			<td>Extra fine and strong tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/carbon grid</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-260-34</td>
			<td>Formvar/carbon film square grid 400 Copper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caco-2 cells to study lipid transport by the intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

איור קאקו-2 תאים נורמלים 1 מציג 13 ימים לאחר מחוברות. המראה של מבנים בצורת כיפה וטיפי שומנים תאיות אופייני של קאקו-2 תאים מובחנים. כאשר קאקו-2 התאים אינם מפוזרים באופן שווה במהלך זריעה, הם גוש ולגדול באזורים מסוימים של המנה; ויהיו כמה אזורים בצלחת ללא כל תאים. מתערבל והצבת הצלחת על משטח משופע יש להימנע. כמו כן, חשוב לשים לב שהודעת מחוברות-קאקו-2 תאים רגישים יותר לניתוק כאשר תקשורת צמיחה חדשה תתווסף לתאים בערך מדי. לכן, יש להוסיף מדיה החדשה בעדינות כדי למנוע ניתוק תא. בהתבסס על מחקרים אלה, יעילות transfection של קאקו-2 תאים הייתה בין 30-60% (איור 2 פנלים העליונים). לעומת זאת, יעילות התמרה של קאקו-2 באמצעות מערכת ביטוי lentivirus הייתה כ -100% (איור 2 </sטרונג&gt; לוחות תחתון). איור 2 הראה גם כי הכמות האופטימלית של lentivirus המרוכז הייתה 10 μl. קאקו-2 תאי transduced נשמרו עד 12 קטעים. כפי שניתן לראות, גם לאחר 12 קטעי התאים transduced עדיין הביעו eGFP. יעילות התמרה בבירור תלויה בריכוז lentivirus. האישור של יעילות transfection / התמרה הוא קריטי, ויש לבצעו כניתוח ראשוני שיגרתי לפני הניסויים בפועל. למרות שניתוח כתם מערבי ניתן להשתמש כדי להעריך את גידול אחוזים מביטוי גנים, זה לא צריך להיות השיטה העיקרית לקביעת יעילות transfection / התמרה. שימוש בשיטת NaCl שיפוע צפיפות ultracentrifugation (איור 3), ליפופרוטאינים מופרשים על ידי קאקו-2 התאים היו מבודדים ונותח על TEM. חלק מchylomicrons, ליפופרוטאין גדול יותר מ -80 ננומטר בקוטר, היו מתוארים באיור4. יפופרוטאינים הקטנים יותר, VLDLs, היו גם בהווה. זה חיוני כדי לאשר את הבידוד המוצלח של שני chylomicrons וVLDLs על TEM. כפי שנאמר בעבר 8, ניתוח ביוכימי לא צריך להיות השיטה העיקרית של אישור. היעדר יפופרוטאינים, במיוחד chylomicrons, מצביע על כך שתחבורת השומנים על ידי קאקו-2 התאים היא לא יעילה. כתוצאה מכך, הם לא ישמשו כמודל טוב ללמוד תחבורת שומנים. מספר חלקיקי chylomicron ביחס למספר הכולל של חלקיקים ליפופרוטאין ניתן לספור 8. אחוז גבוה מצביע תחבורת שומנים יעילה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53086/53086fig1.jpg" /> טיפות שומנים איור 1. מיקרוסקופ נציג של קאקו-2 תאי פוסט-מחוברות 13 יום. תאיים נראות בכמה תאים (חץ אדום). המבנים הייחודיים בצורת כיפה (חץ שחור) FOrmed על ידי כמה קאקו-2 תאים הם בדרך כלל קיים רק לאחר שהתאים הגיעו מפגש. הגדלה = 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53086/53086fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53086/53086fig2.jpg" /> איור 2. השוואה של מערכת ביטוי lentivirus היעילות של transfection השומנים מבוסס ופנל עליון:. קאקו-2 תאים היו transfected עם pLL3.7 eGFP באמצעות מגיב הלא liposomal transfection (בר = 20 מיקרומטר Scale). 4 פנלים תחתון: קאקו-2 תאים היו transduced עם pLL3.7 eGFP באמצעות מערכת ביטוי lentivirus עם כמויות משתנות (1, 2, 5, או 10 μl) של lentivirus המרוכז (LV). התאים המוצגות היו מהמעבר ה -12 של תאי transduced המקוריים. הלוחות עזבו להראות מכתים DAPI, הרשות הפלסטינית אמצענלס להראות הקרינה GFP, והלוחות מימין מראים את התמונות הממוזגות. מערכת ביטוי lentivirus הייתה כנראה יעילה יותר מtransfection השומנים מבוסס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53086/53086fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53086/53086fig3.jpg" /> בידוד איור 3. של ליפופרוטאין במעיים באמצעות ultracentrifugation שיפוע צפיפות NaCl. הצפיפות של תקשורת המכיל ליפופרוטאין מותאם ל1.2 גרם / מיליליטר ידי הוספת הכמות המתאימה של NaCl. הנפח של המדגם גם צריך להיות מותאם כך שהוא ימלא את כל צינור ultracentrifuge כדי למנוע קריסה. כדי להשיג שיפוע צפיפות, 0.5 מיליליטר של מים מעולף בעדינות על g / מיליליטר פתרון צפיפות 1.2. המדגם לאחר מכן הסתובב ב429460 XG במשך 24 שעות באמצעות T865הרוטור (שווה ערך ל 2.15 יחידות סודברג). ליפופרוטאינים המעיים צריכים להיות התאוששו באופן מיידי על ידי pipetting העדין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53086/53086fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53086/53086fig4.jpg" /> איור 4. מיקרוסקופ אלקטרונים נציג של ליפופרוטאין מיוצר על ידי קאקו-2 תאים. יפופרוטאינים מבודדים על ידי ultracentrifugation שיפוע צפיפות NaCl היה מוכתמים שלילי עם 2% חומצת phosphotungstic (pH 6.0). Chylomicrons, חלקיקי שומנים גדולים יותר מ -80 ננומטר בקוטר, וVLDLs, ננומטר קטן יותר מ -80 אלה, שניהם נמצאים. בר סולם = 100 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53086/53086fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine at JoVE.com

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

using-caco-2-cells-to-study-lipid-transport-by-the-intestine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  California Northstate University. Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Video: Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

מחשב שנוצר מודל החיה גירויים

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

בידוד טיהור תסיסנית נוירונים היקפיים על ידי מיון ביד מגנטי

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

מדידת תחבורת קטיון ידי Na, K-ו-H, K-ATPase ב<em&gt; Xenopus</em&gt; ביציות על ידי spectrophotometry קליטה האטומית: חלופית למבחני radioisotope

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing a barrier to foreign particles. Impaired epithelial transport (ion, nutrient, or drugs) has been associated with many diseases and can have consequences that extend beyond the normal physiological functions of the transporters, such as by influencing epithelial integrity and the gut microbiome. Understanding the function and regulation of transport proteins is critical for the development of improved therapeutic interventions. The biggest challenge in the study of epithelial transport is developing a suitable model system that recapitulates important features of the native intestinal epithelial cells. Several in vitro cell culture models, such as Caco-2, T-84, and HT-29-Cl.19A cells are typically used in epithelial transport research. These cell lines represent a reductionist approach to modeling the epithelium and have been used in many mechanistic studies, including their examination of epithelial-microbial interactions. However, cell monolayers do not accurately reflect cell-cell interactions and the in vivo microenvironment. Cells grown in 3D have shown to be promising models for drug permeability studies. We show that Caco-2 cells in 3D can be used to study epithelial transporters. It is also important that studies in Caco-2 cells are complemented with other models to rule out cell specific effects and to take into account the complexity of the native intestine. Several methods have been previously used to assess the functionality of transporters, such as everted sac and uptake in isolated epithelial cells or in isolated plasma membrane vesicles. Taking into consideration the challenges in the field with respect to models and the measurement of transport function, we demonstrate here a protocol to grow Caco-2 cells in 3D and describe the use of an Ussing chamber as an effective approach to measure serotonin transport, such as in intact polarized intestinal epithelia.

We describe simple methods to study the regulation of intestinal serotonin transporter (SERT) function and expression using an in vitro cell culture model of Caco-2 cells grown in 3D&#160;and an ex vivo model of mouse intestines. These methods are applicable to the study of other epithelial transporters.

שיטות לחקר תפקוד החלבון התחבורה אפיתל וביטוייה המעי Native ו קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D

The intestinal epithelium has important transport and barrier functions that play key roles in normal physiological functions of the body while providing ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

ממברנות שומנים דו-שכבתיות קשורות לניטור העברת חום בין חלקיקי זהב וממברנות שומנים

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is limited by cost, throughput, and the caveats inherent to isotopic labeling of the food Fe. Thus, there exists a critical need for an approach that is high-throughput and cost-effective. The Caco-2 cell bioassay was developed to satisfy this need. The Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability utilizes simulated gastric and intestinal digestion coupled with culture of a human intestinal epithelial cell line known as Caco-2. In Caco-2 cells, Fe uptake stimulates the intracellular formation of ferritin, an Fe storage protein easily measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ferritin forms in proportion to Fe uptake; thus, by measuring Caco-2 cell ferritin production, one can assess intestinal Fe uptake from simulated food digests into the enterocyte. 
Via this approach, the model replicates the key initial step that determines food Fe bioavailability. Since its inception in 1998, this model approach has been rigorously compared to factors known to influence human Fe bioavailability. Moreover, it has been applied in parallel studies, with three human efficacy studies evaluating Fe biofortified crops. In all cases, the bioassay correctly predicted the relative amounts of Fe bioavailability from the factors, crops, and overall diet. This paper provides detailed methods on Caco-2 cell culture coupled with the in vitro digestion process and cell ferritin ELISA necessary to conduct the Caco-2 cell bioassay for Fe bioavailability.

The Caco-2 cell bioassay for iron (Fe) bioavailability represents a cost-effective and versatile approach to assess Fe bioavailability from foods, food products, supplements, meals, and even diet regimens. Thoroughly validated to human studies, it represents the state of the art for studies of Fe bioavailability.

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במזון

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video