This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Avrupa Sözleşmesi 123 / Avrupa Konseyi ve Direktifi 86/609 / EEC sayılı ile anlaşarak Valladolid Üniversitesi hayvan barınağı tesisi tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde ele alınmıştır. Sıçan Hipokampal Nöronlar 1. Kısa ve Uzun Vadeli Kültürü <ol><li> Poli-D-lisin hazırlanması, 12 mm cam lamelleri kaplama. <ol><li> En az 24 saat süre ile etanol içinde 12 mm çapında bir cam lamelleri sterilize edin. Bunları steril koşullar altında kurumaya bırakın. </li><li> Petri kabındaki parafilm şeridi lamelleri dağıtın. 1 mg / ml poli-D-lisin 200 ul her bir lamel yüzeyi kapatılır. O / N tedavi izin verin. </li><li> Ertesi gün, steril koşullar altında 90 dakika boyunca iki kez damıtılmış, steril su ile her 15 dakikada bir lamelleri yıkayın. </li><li> Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ile dört sıra çok kaplı plaka Dolgu ile sabitleştirilir. Neurobasal Kültür Ortamı ile takviye edilmelidir% 10 fetal bovin serumu,% 2 B27, 1 ug / ml gentamisin ve 2 mM L-glutamin. </li><li> Çok kaplı plaka lamelleri yerleştirin. Kullanılana kadar nemlendirilmiş 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör koruyun. </li></ol></li><li> Yenidoğan sıçanlarda hipokampal nöronlar izolasyonu. <ol><li> Steril koşullar altında, bir şişeye (20 ul / ml) içinde 1,8 ml papain çözeltisi (şirketinden satın alınmış) hazırlayın: 20 ul&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için / 1.8 mi Hank artı% 0.6 BSA içinde 40 ul papain ilave ml (ul hesaplanmalıdır ) satıcılar koşullarına bağlı olarak değişebilir. Hank% 0.6 BSA% 4 sığır serumu albümini 15 ml HBSS ortamı 85 ml karıştırılması ile hazırlanır (BSA, 100 mi HBSS içinde BSA 4 g çözme hazırlanır). Steril bir kaput içinde hazırlayın. </li><li> Kullanımdan önce 37 ° C &#39;de 30 dakika boyunca Hank artı% 0.6 BSA içinde papain inkübe edin. Kullanım öncesi 0,22 um filtre kullanılarak çözelti filtre. </li><li> Dulbecco&#39;nun ekleyerek Ham F-12 ortamı hazırlamakIki kez damıtılmış steril su içinde 900 ml Eagle Ortamı tozu (L başına 13.5 g) modifiye edilmiştir. Sonra 6 gr HEPES ve 336 mg NaHCO 3 ekleyebilir ve NaOH 4 N. 1 L çözelti elde ve 0.20 mikron polietersülfon kullanarak filtrelemek için steril su ekleyin kullanarak 7.42 pH ayarlamak (PES) üst filtreyi şişe. Bir steril bir muhafaza içinde bu işlemi uygulayın. Sonunda Kullanmadan önce steril koşullar altında CO 2 ile çözüm doyurabilecek. Mağaza çözümleri 4 ºC de ve onları soğutulmuş kullanın. </li><li> Dekapitasyon yenidoğan (P0) fare yavrular Euthanize ve steril HBS orta kafa yıkayın. Steril makas yardımı ile kafatası açın. Bir spatula ile beyin ekstrakte edin ve Ham F-12 ortamı içinde hızlı bir şekilde yıkayın. </li><li> Her yarımkürede (Şekil 1B) bir neşter yardımıyla bir çapraz kesim yapın ve Ham F-12 orta içeren Petri taşımak. </li><li> Diseksiyon forseps yardımıyla ve büyüteç altında dikkatlice atın meninksler. </li> &lt;li&gt; büyüteç kullanarak korteks üzerinde karakteristik bir içbükey konumda hipokampus tanımlayın. Sonra bir sınır dikkatlice çekerek ve göz makas kullanarak konumundan kaldırarak korteksten hipokampus ayırın. </li><li> Steril Hank ortamında Ca + 2 ve Mg yoksun 2+ artı% 0.6 BSA ile doldurulmuş bir 4-iyi levhaya hipokampal doku transferi ve hipokampal doku yıkayın. Çıkarmadan medya aynı göz makas kullanarak küçük parçalar halinde doku (2 x 2 civarında mm) kesti. </li><li> 1,8 ml önceden süzüldü papain çözeltisi ihtiva eden bir şişeye hipokampal parçaları aktarın. Sonra sıra, hafifçe çalkalanarak 37 ºC&#39;de inkübe. 15 dakika sonra, (nihai 50 ng / ml), DNase I çözeltisinin 90 ul ve 15 dk daha inkübe edilir. </li><li> 10 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın ve taze Neurobasal Kültür Ortamı ile fragmanları yıkayın. 5 ml&#39;lik plastik pip ile doku parçaları geçirerek hücre süspansiyonu eldeette. </li><li> 5 dakika boyunca 160 x g&#39;de santrifüjleyin hücre süspansiyonu. Bir plastik steril Pasteur pipeti kullanarak Süpernatantı ve Neurobasal Kültür Orta 1 ml pipet otomatik bir 1 ml dikkatlice pelet askıya. </li><li> Bir Neubauer sayım odasını kullanarak hücre yoğunluğu ölçün. Neubauer odasına üzerine cam lamel koyun. Hücre süspansiyonu 10 ul ekle. Hücre süspansiyonu homojen ve hiçbir kabarcıklar yapma odasına girer emin olun. Mikroskop altında hücrelerin sayısını ve 30 x 10 3 hücre içeren 40-80 ul uygun bir damla elde etmek için gelen hesaplamaları gerçekleştirmek. Toplam hücre sayısı, kullanılan hayvanların sayısına bağlı olacaktır. </li></ol></li><li> Kısa ve sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültür. <ol><li> Her bir ila yaklaşık 50 ul arasında bir damla yaklaşık 30 x 10 3 hücreleri Neurobasal Kültür Ortamı 500 ul ihtiva eden dört oyuklu çok kaplı plaka üzerinde önce hazırlanan ve inkübatör plaka muhafazade bir poli-D-lizin kaplı 12 mm çapında bir cam lamel ihtiva eden çok kaplı plaka. </li><li> Kültür değiştirmeden deneylerde önce in vitro 2-5 gün (DIV, kısa vadeli, genç kültürler) ya da&gt; 15 DIV (Uzun vadeli, yaşlı kültürler) için nemlendirilmiş 37 ºC ve% 5 CO2 inkübatör primer hipokampal hücreleri korumak Ortam. </li></ol></li></ol> Sitosolik Ca 2. Floresans Görüntüleme 2+ Konsantrasyon <ol><li> Floresan görüntüleme test çözümleri hazırlanması. <ol><li> NaCl 145, KCI 5, MgCl2 1, CaCl2 1, glükoz 10, sodyum HEPES, 10 (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın. </li><li> NaCl 146, KCI 5, glükoz CaCl 2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42): mM ihtiva eden bir dış, Mg2 + içermeyen, HEPES-tamponlu tuzlu su (HBA) çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir Fina NMDA Mg2 +, -ücretsiz olarak, HEPES-tamponlu salin (HBA) çözme100 mcM l konsantrasyonu ve 10 mcM glisin ile tamamlar. </li><li> (MM olarak) çözerek yerine NaCl KCI ihtiva eden bir HBS çözeltisi hazırlayın: KCI 145, MgCl2 1, CaCl2 1, 10 ve 10 HEPES (pH 7.42) glikoz. </li></ol></li><li> Floresan kalsiyum prob fura2 / AM ile hipokampal hücre yükleme. <ol><li> Inkübatör kapalı lamelleri içeren hücre kültürü alın ve 500 HBS ul başına iyi içeren yeni bir dört iyi çok kaplı plaka aktararak RT&#39;de HBS ortamı ile yıkayın. </li><li> Fura2 kuluçkaya bırakılır / karanlık bir yerde, oda sıcaklığında (25 ° C) sıcaklıkta 60 dakika boyunca (aynı HBA ortam içinde hazırlandı) AM 4 uM. </li><li> 60 dakika sonra, taze HBS orta lamelleri yıkayın. </li></ol></li><li> Sitozolik kaydedilmesi floresan görüntüleri [Ca 2 +] kültürlü hücrelerde. <ol><li> Lamba, mikroskop, perfüzyon sistemi, floresan kamera ve bilgisayarı açın. </li><li> Bir termostatlı bir platformda lamelleriters mikroskop sahnede açık 12 mm cam lamelleri ve 40X objektif (1.3 yağ, NA) kullanarak mikroskobik alanı seçin. Ya da yokluğunda test maddelerinin mevcudiyetinde (37 ° C) önceden ısıtılmış HBS ortamı ile sürekli hücreleri serpmek. / Dakika yaklaşık 5-10 ml bir oranda akış muhafaza edin. Not: canlı hücreler için hücre perfüzyon Sistem, açık 12 mm cam lamelleri için termostatlı bir platform içine monte edilir. Bir valf kontrol cihazı ile donatılmış 8 hatları yerçekimi ile çalışan bir perfüzyon sistemi çözümleri serpmek için kullanılır. Bir vakum pompası herhangi bir aşırı yayıcıyı çıkarmak için sorumludur. Solutions içinde boru ısıtma sistemi kullanılarak ısıtılır. </li><li> Deklanşör hem uyarma dalga boylarında kapalı bir arka plan görüntüsü yakalama. </li><li> 340 ve 380 nm dönüşümlü hücreler Epi-aydınlatır. Tutanak ışığı 520 nm bir fura-2 dikroik ayna tarafından süzülür bir floresan kamera, her 5-10 sn yayılan. </li><li> Kayıt süresi bittiğinde, tam sekans o saklamakf görüntüleri daha fazla analiz için bilgisayara 520 nm&#39;de yayılan. </li></ol></li><li> Kaydedilen floresan görüntü analizi. <ol><li> Deney dosyasını açın. AQUACOSMOS yazılımı kullanarak, &#39;Oranı&#39; üzerine tıklayın ve istediğiniz oran aralığını seçin. Oranı görüntü bir dizi elde etmek için elde edilen görüntüler olarak piksel oranı piksel hesaplayın. </li><li> &#39;Arka plan eleme&#39; ayarlayarak arka plan çıkarın. Basın &#39;başlangıç ​​hesabı&#39;. </li><li> Basın &#39;her zaman dizisi&#39; düğmesi ve ilgi antik bölgeleri silmek (ROI). Tek tek hücrelerin kantitatif analiz için, bireysel nöronlar karşılık gelen faiz veya İB&#39;nin yeni bölgeleri kurmak. Her ROI ve her görüntüye karşılık gelen her bir piksel ortalama tüm oran değerleri, bireysel ROI (hücreler) için bu oran floresan değerleri bir kayıt elde etmek. </li><li> Bir grafik progr her ROI karşılık gelen oran floresan değerlerini ihraç bireysel kayıtları grafiğini içinduyuyorum. </li><li> Uygun bir veri analizi kullanılarak her bir uyarıya cevap olarak oran floresanın artışların büyüklüğü tahmin edilmesi ve yazılımı grafik için ilgili hesaplamalar sağlayın. </li></ol></li></ol> Mitokondriyal Ca 3. Biyoparlaklık Görüntüleme 2+ Konsantrasyon <ol><li> MitGAmut plazmid ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar transfeksiyonu. NOT: Hücreler ilk olarak mitokondri hedefli sekans ve yeşil flüoresan proteini (GFP) kaynaşmış bir Ca2 + bağlama sahası eksik mutasyona uğramış Aequorini içeren mitGAmut plazmid ile transfekte edilir. Bu yapı, mitokondriyal Ca 2 + alımı büyük artışlar algılar ve GFP floresan ile transfekte edilmiş hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Plazmid geliştirilmiş ve nazik P. brulet ve birlikte çalışanlar 18 (CNRS, Paris, Fransa) tarafından temin edildi. <ol><li> Cenin sığır serumu eksik Neurobasal kültür vasatı içeren, Neurobasal TF Hazırlama, B27, gentamicve 2 mM L-glutamin. </li><li> Neurobasal TF 50 ul artı bir viyal (Çözelti A) 2.5 ul transfeksiyon reaktifi hazırlayın. 50 Neurobasal TF ul artı 4 ug bir şişe içinde mitGAmut plazmid (Çözelti B) hazırlayın. Sallayarak olmadan 20 dakika boyunca karıştırma izin çözüm A. üzerinde hafifçe çözüm B ekleyin. </li><li> Taze Neurobasal TF 200 ul içeren yeni çok kaplı plakalara hipokampal nöron içeren lamelleri aktarın. </li><li> Her lamel üzerinde damla çözüm A + B 100 ul damla ekleyin. 30 dakika boyunca çalkalayarak kuluçkalayın. Orta çıkarın. Taze Neurobasal TF hücrelerin bir kez yıkayın. Orijinal Neurobasal Kültür Orta lamelleri dönün. </li><li> 37 ° C ve% 5 transfeksiyonundan sonra CO2 seviyesinde ilave bir 24 saat boyunca kültür nöronları etkin ekspresyonu ve probun hedef izin vermek. </li></ol></li><li> Biyoparlaklık görüntüleme için deney çözeltilerinin hazırlanması. <ol><li> Olarak NMDA 100 uM ya da 145 mM KCI içeren HBS çözümler hazırlayınYukarıda (2.1 Adım). 10 mM Ca içeren 2+ artı 100 mcM digitonin HBS çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li><li> Coelenterazine n mitokondri hedefli aequorin Sulandırma. <ol><li> HBS 200 ul ihtiva eden bir dört plaka transfekte hipokampal nöronlar içeren transfer lamelleri. </li><li> 4 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde boyunca HBS&#39;de 200 ul coelenterazine n (200 uM) 4 ul ekleyin ve yavaşça karıştırın. RT (25 ° C), 2 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. </li></ol></li><li> Mitokondriyal kaydedilmesi biyolüminesans görüntüleri [Ca 2 +]. <ol><li> Mikroskop, lamba, perfüzyon sistemi, biyolüminesans kamera ve bilgisayarı açın. </li><li> Termostatlı bir (37 ° C) perfüzyon odasına yeniden lamelleri aktarın ve 5-10 ml / dk&#39;lık bir oranda önceden ısıtılmış HBS çözeltisi ile sürekli olarak serpmek. </li><li> 40X objektif (yağ, NA: 1.3) kullanılarak, a ifade hücreleri içeren mikroskobik alan seçinFITC filtreleri kullanarak yeşil flüoresan proteini (GFP) ekspresyonu ile bağlantılı bir floresan emisyonu ile gösterildiği gibi poaequorins. Tipik bir alanı 1-2 transfekte edilmiş hücreleri içerebilir. Bir CCD kamera kullanarak, GFP floresan görüntü yakalamak. </li><li> Mikroskop ışığı kapatın. Işık yolunda bulunan dichroic içeren kutu çıkarın. Uyarma ışık kapatın ve tam karanlık koyu-kutusunu kapatın. </li><li> Ya da test solüsyonları 37 ° C&#39;de önceden ısıtılmış olmayan HBS ortamı ile 5-10 ml / dakika hücreleri serpmek. </li><li> Fotonik emisyon görüntüleri bir görüntü işlemcisi ile ele bir foton sayma makinesi ile her 10 saniyede yakalayın. </li><li> Her bir deneyin sonunda, kalan tüm foton emisyon serbest bırakmak için HBS&#39;de 10 mM digitonin 0.1 mM CaCl2 ile hücreleri geçirgenliği. Not: Bu fotonik emisyonlar toplam fotonik emisyonları, Ca 2 + konsantrasyonlarda kalibrasyon için gerekli bir değerini tahmin etmek için yukarı eklenmelidir &lt;./ li&gt; <li> GFP ilişkili floresan görüntü ile bilgisayarda saklayın biyolüminesans görüntüleri foton sayma görüntüleme önce ele geçirdi. </li></ol></li><li> Mitokondriyal [Ca2 +] yansıtan biyoışıldama görüntülerin analizi. <ol><li> Özel bir yazılım kullanılarak fotonik emisyonları ölçmek. Fotonik emisyon mitokondriyal serbest Ca dönüştürülebilir 2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] mit) Brini ve ark., 15 tarafından tarif edilen algoritmasını kullanarak yapar. </li><li> Deney ve GFP floresan görüntüyü açın. Deneyin başında çekilen floresan görüntülerine göre transfekte hücrelerin şekli çizerek özel yazılım yardımı ile ilgi (ROI) Seç bölgeleri. </li><li> Her görüntü aynı ROI yapıştırın. Her ROI toplam fotonik emisyonları zaman içinde her noktada her hücre için parlaklık emisyon değeri (L) elde etmek için özel bir yazılım ile hesaplanır. </li><li> Tüm fotonik emiss ekleyinTüm fotonik emisyonları içeren bir biyoışıldama görüntü elde etmek, özel bir yazılım kullanarak, permeabilization digitonin sonra elde edilenler dahil biyoışıldama görüntüleri, iyonlar. </li><li> Hesaplamalar için belirli bir yazılıma ilgi her bölge için fotonik emisyonların ihracat değerleri. Bunu yapmak için, her zaman her ROI için biyoparlaklık değerlerini hesaplamak için &#39;Grafik&#39; üzerine tıklayın. &#39;Toplam değeri&#39; seçin ve &#39;tüm görüntüleri mevcut yatırım getirisini kullanın. Basın &#39;hesapla&#39;. Bir çalışma sayfasına &#39;txt.file&#39; ve ihracat verileri kaydetmek. Her ROI için, [Ca 2 +] mit aşağıdaki algoritmayı kullanılarak hesaplanır: [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; burada, R = [L / (L toplam λ)] 1 / n L ilgi her bölgede ölçüm zamanında yayılan lüminesan olup. L toplamıdırÇevrede her bir bölgesi için ölçüm zamanında o anda dokusunda mevcut sayım eklenmesinden sonra kalan toplam lüminesans. λ, K TR K R ve n, değerleri aequorin kombinasyonuna bağlıdır (doğal tipte veya mutasyona uğramış) ile coelenterazin kullanılan (vahşi tip veya n tipi) sabitler yanı sıra kayıt sıcaklığı 16 bulunmaktadır. Burada kullanılan kombinasyon için 37 ºC&#39;de, (AEQ ve coelenterzine n mutasyona uğramış), aşağıdaki değerleri kullanılır: K R = 8.47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n 1204 ve λ = 0.138 =. </li></ol></li><li> Uygun bir veri analizi kullanılarak her uyarıcıya yanıt olarak biyolüminesans artışların boyutunu tahmin ve yazılım grafik için ilgili hesaplamalar yapmak. </li></ol>

<ol>
	<li>Sattler, R., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+glutamate+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+cell+death.">Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death.</a> Molecular Neurobiology. 24 (1-3), 107-129 (2001).</li><li>MacDermott, A. B., Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Smith, S. J., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA-receptor+activation+increases+cytoplasmic+calcium+concentration+in+cultured+spinal+cord+neurones.">NMDA-receptor activation increases cytoplasmic calcium concentration in cultured spinal cord neurones.</a> Nature. 321 (6069), 519-522 (1986).</li><li>Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+neurotoxicity+in+cortical+cell+culture.">Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (2), 357-368 (1987).</li><li>Kure, S., Tominaga, T., Yoshimoto, T., Tada, K., Narisawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+triggers+internucleosomal+DNA+cleavage+in+neuronal+cells.">Glutamate triggers internucleosomal DNA cleavage in neuronal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 179 (1), 39-45 (1991).</li><li>Calvo, M., Sanz-Blasco, S., Caballero, E., Villalobos, C., Nunez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+to+excitotoxicity+in+aged+hippocampal+cultures+and+neuroprotection+by+non-steroidal+anti-inflammatory+drugs:+role+of+mitochondrial+calcium.">Susceptibility to excitotoxicity in aged hippocampal cultures and neuroprotection by non-steroidal anti-inflammatory drugs: role of mitochondrial calcium.</a> Journal of Neurochemistry. 132 (4), 403-417 (2015).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunits+have+differential+roles+in+mediating+excitotoxic+neuronal+death+both+in+vitro+and+in+vivo.">NMDA receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (11), 2846-2857 (2007).</li><li>Zhou, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+NMDA+neurotoxicity+reflect+developmental+changes+in+subunit+composition+of+NMDA+receptors.">Developmental changes in NMDA neurotoxicity reflect developmental changes in subunit composition of NMDA receptors.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2956-2963 (2006).</li><li>Brewer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vulnerability+of+hippocampal+neurons+with+age+in+culture:+temporal+association+with+increases+in+NMDA+receptor+current,+NR2A+subunit+expression+and+recruitment+of+L-type+calcium+channels.">Increased vulnerability of hippocampal neurons with age in culture: temporal association with increases in NMDA receptor current, NR2A subunit expression and recruitment of L-type calcium channels.</a> Brain Research. 1151, 20-31 (2007).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+remodelling+and+disease.">Calcium signalling remodelling and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (2), 297-309 (2012).</li><li>Stout, A. K., Raphael, H. M., Kanterewicz, B. I., Klann, E., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-induced+neuron+death+requires+mitochondrial+calcium+uptake.">Glutamate-induced neuron death requires mitochondrial calcium uptake.</a> Nature Neuroscience. 1 (5), 366-373 (1998).</li><li>Pivovarova, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons.">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (24), 5611-5622 (2004).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297 (5868), 681-683 (1982).</li><li>Geinisman, Y., Detoledo-Morrell, L., Morrell, F., Heller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+markers+of+age-related+memory+dysfunction:+behavioral,+electrophysiological+and+morphological+perspectives.">Hippocampal markers of age-related memory dysfunction: behavioral, electrophysiological and morphological perspectives.</a> Progress in Neurobiology. 45 (3), 223-252 (1995).</li><li>Sodero, A. O., Weissmann, C., Ledesma, M. D., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+stress+from+excitatory+neurotransmission+contributes+to+cholesterol+loss+in+hippocampal+neurons+aging+in+vitro.">Cellular stress from excitatory neurotransmission contributes to cholesterol loss in hippocampal neurons aging in vitro.</a> Neurobiology of Aging. 32 (6), 1043-1053 (2011).</li><li>Brini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfected+aequorin+in+the+measurement+of+cytosolic+Ca2++concentration+([Ca2+]c).+A+critical+evaluation.">Transfected aequorin in the measurement of cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]c). A critical evaluation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (17), 9896-9903 (1995).</li><li>Villalobos, C., Alonso, M. T., Garc&#236;a-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+calcium+oscillations+inside+intracellular+organelles.">Bioluminescence imaging of calcium oscillations inside intracellular organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 574, 203-214 (2009).</li><li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redistribution+of+Ca2++among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells.">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> FASEB Journal. 16, 343-353 (2002).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (3), 597-610 (2005).</li><li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM.">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), 1067 (2009).</li></ol>

None of the authors have competing interests or conflicting interests.

Yaşlanan beyinde hücre içi Ca 2+ yeniden şekillenmesi homeostasis bilişsel kaybı ile ilgili olmuştur, iskemik hasar, eksitotoksisite ve nörodejenerasyon yatkınlık artmıştır. In vitro bu hipotezi araştırmak için Ca 2+ görüntüleme prosedürleri mevcuttur. Ne yazık ki, eski hipokampal nöronlar uygulanabilir kültürleri güvenilir değildir. Son zamanlarda, bu gözlenmiştir olduğu sıçan hipokampal nöronlarının ROS birikimi lipofusin granüller, heterokromatik odakl...

Eksitotoksisite NOS&#39;nin, iskemi gibi nörolojik akıntılar nöronal hasar ve hücre ölümüne neden olan en önemli mekanizmalardan biri olduğu ve Alzheimer hastalığı 1 gibi nörodejeneratif hastalıklarda. Nörotoksisite Bu tip ağırlıklı Ca glutamat oyunculuk aracılık 2+ -geçirgen, İyonotropik NMDA reseptörleri (NMDAR) 2. Glutamata kültürlenmiş nöronların nöronal apoptoz 4 neden eksitotoksisite 3, yol açabilir. Biz ve diğerleri daha önce NMDA kaynaklı apoptosise nöronal açığı in vitro gelişimi ve 5-8 yaşlanma değişebilir bildirmişlerdir. Bu yaygın sitosolik içermeyen Ca2 + konsantrasyonu ([Ca2 +] cyt) &#39;de bir artış hücrelerin aktivasyonuna yol açtığı kabul edilmektedir. Bu artış çok yüksek ve / veya yeterince sürekli olduğu, ancak hücre ölümünü 9 tetikleyebilir. Ayrıca, önerilmiştirbu eksitotoksisite mitokondriyal Ca2 + alımı 10, glutamat ile indüklenen hücre ölümü 11 karşı mitokondriyal uncoupler korunan nöronlarla nöronları tedavi yana gerektirir. Mitokondri Ca 2 + çok fazla alırsan, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözenek açılması sitokrom c ve diğer pro-apoptotik faktörlerin ve uyaran apoptoz serbest lider oluşabilir. Son zamanlarda bu mitokondriyal Ca 2 + alımı doğrudan doğruya tek bir hipokampal nöronlar 5 NMDA ile indüklenen Ca2 + mitokondriyal alımını bu makalede rapor bir yöntemi ölçülerek, nörotoksitisi yaşa bağlı duyarlılık ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Böyle öğrenme, hafıza ve diğer bilişsel süreçler 12 gibi fizyolojik süreçlerde yer hipokampus, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkların 13 derece hassastır. Bu, in vitro olarak birkaç hafta sonra, ileri sürülmektedir, kültürlenmişhipokampal nöronlar yaşlı nöronlar 14 tipik özelliklerinden bir sayısını göstermektedir. Buna göre, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlar yaşlanma gelişmiş eksitotoksisitenin Ca 2 + aracılı mekanizmalar araştırmak için kapsamlı bir model sağlayabilir. Sunulan yöntemin genel amacı, bu nedenle, uzun vadeli kültürlü hipokampal nöronlarda NMDA reseptör agonistleri tarafından ortaya çıkarılan diferansiyel Ca 2+ yanıtları da dahil olmak üzere yaşlanan beyinde hücre içi Ca 2 + homeostazı veya Ca 2+ yeniden önemli değişiklikleri araştırmak amacıyla, bir . Yöntem sırasıyla, sıçan hipokampal nöronların kültürü ayrıntılı bir açıklamasını ve bireysel nöronlar floresan ve biyolüminesans görüntüleme Sitozolik ve mitokondrial Ca 2 + konsantrasyonları izleme içerir. Kültürlü nöronlar sitozolik Ca 2 + floresan görüntüleme standart bir prosedürdür. Bununla birlikte, bu yöntem, alt için daha az güvenilirdirHücresel Ca mitokondriyal Ca 2 + 2 + olmak üzere ölçümleri. Bu nedenleri bile mM düzeyinde düşük mcM seviyesinden mitokondri değişebilir Ca 2 + konsantrasyonları için sentetik probların uygun hedefleme ve uygunsuz afinite eksikliği sayılabilir. Örneğin aequorin gibi proteinlere göre Ca 2 + prob kullanımı, hücre içi organellere hedef ve spesifik Ca 2+ bağlama siteleri 15 eksik farklı coelenterazines veya mutasyona uğramış problar kullanılarak farklı türevleri Ca 2 + eğilimleri kullanımına izin verdi. Bu şekilde, mitokondri hedefli Aequorini eksprese eden hücrelerin biyoışıldama görüntüleme bireysel nöronlar mitokondriyal Ca 2 + konsantrasyonlarının izlenmesini izin verebilir. Ancak, bu işlem biyoparlaklık görüntüleme 16-18 için foton sayma kameraları ya da ultrasensitif CCD kamera kullanımını gerektirebilir. Daha fazla establ teyit edilmelidir yeni sonuçlar doğurabilir Bu yöntemÖrneğin olarak ished beyin yaşlanması modelleri, eski hayvanlardan beyin dilimleri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips</td>
			<td>Labolan</td>
			<td>0111520/20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish plaques</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petry dishes</td>
			<td>JD Catalan s.l.</td>
			<td>2120044T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura2-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine n</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>BT-10115-2250 uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite ilumination system</td>
			<td>EXFO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA ER fluorescence camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM photon counting CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC-8 valve controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-27B heating system&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquacosmos Software</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

Nörodejenerasyon ve iskemi ilişkili nöron hücre ölümüne Duyarlılık fazlasıyla yaşlı beyinde artmış, ancak sorumlu mekanizmalar kötü bilinmektedir. Eksitotoksisite, her iki saldırılar ile uyarılan nöron hasarına katkıda bulunduğuna inanılan bir yöntem, Ca2 + akışını ve mitokondriyal Ca 2 + aşırı teşvik glutamat reseptörlerinin aktivasyonu aracılık eder. Hücre içi Ca 2 + homeostazı hücre içi Ca 2 + homeostasis veya yeniden yapılanmasında önemli bir değişiklik eski nöronlar nöron hasarı lehine olabilir. Yaşlanma Ca 2 + yeniden modellemenin araştınlması için in vivo nöronlar arası bazı yönleri benzer sıçan hipokampal nöronlarının uzun dönemli kültürlerde canlı hücre görüntüleme kullandık. Bu amaç için, hipokampal hücreleri ilk etapta, taze yeni doğmuş sıçan Hipokampuslardan gelen dağınık ve poli-D-lizin kaplı cam lamelleri kaplama vardır. Sonra kültürler birkaç gün boyunca kontrollü bir ortam içinde muhafaza veya W birçok edilirsırasıyla, genç ve yaşlı nöronların araştırılması için eeks. İkinci olarak, kültürlenmiş nöronlar fura2 ile yüklenir ve dijital fluoresan oranı görüntüleme kullanarak sitosolik Ca2 + konsantrasyonu ölçümlerine tabi tutulur. Üçüncü olarak, kültürlenmiş nöronlar mitokondri hedeflenen düşük meyil aequorin ve GFP bir tandem ifade eden plasmidler ile transfekte edilir. 24 saat sonra, hücre içinde aequorin koelenterazin ile yeniden ve nöronlar mitokondriyal Ca2 + konsantrasyonunun izlenmesi için biyolüminesans görüntüleme tabi tutulur. Bu üç adım prosedür, örneğin glutamat reseptör agonisti NMDA ve bu ve diğer cevaplar yaşlanma etkilenir olmadığı karşılaştırma gibi ilgili uyaranlara sitosolik ve mitokondriyal Ca 2 + tepkilerinin izlenmesine olanak sağlar. Bu prosedür nasıl etki sitozolik ve mitokondriyal Ca 2+ seçilen uyaranlara yanıtları yanı sıra nöron hücresi önlemeyi amaçlayan seçilen ilaçların test yaşlanma gibi yeni anlayışlar verebiliryaşla ilişkili hastalıklarda ölüme.

Burada Ca 2 + biçimlenme ve sitozolik ve mitokondriyal üzerindeki NMDA etkilerini değerlendirmek için basit bir yöntem tarif [Ca 2 +] yaşlı nöronlarda. Şekil 1 izole ve neonatal sıçanların hipokampal nöronlar kültürü için prosedürün şemasını göstermektedir. Başlamadan önce, steril, poli-D-lizin kaplı cam lamelleri hazırlamak ve 4-iyi bir çanak onları bulmak gerekir. Ardından, yenidoğan sıçanlar öldürüldü ve beyin kaldırılır. Hipokampus izole ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons at JoVE.com

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

fluorescence-bioluminescence-imaging-subcellular-ca2-aged-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K Görüntüleme.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

Video: Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Nörobilim

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Comet Assay kullanma Hipokampal Nöronlar DNA Hasarı assaying

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

Enterik Sinir Sistemi Yerinde Ca 2+ Görüntüleme

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Yaşlı Bir Farede Hipokampal Dendritik Karmaşıklığın Golgi-Cox Yöntemi ile Değerlendirilmesi

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described here identifies the basic building blocks of this circuitry. The in-depth studies of cortical regions will ultimately provide other scientists with the circuit components needed for an understanding of how the brain acquires, processes and stores information and what goes wrong in disease, while the electrophysiological and morphological data are widely used by computational neuroscientists in the construction of model networks that explore information processing. The protocol outlined here describes how biocytin-filled cells recorded in the CA2 region of the hippocampus are recovered and then reconstructed in&#160;3D. Additionally, the protocol describes the demonstration of calcium binding protein or peptide content in recorded interneurons.

The protocol outlined here describes the immunofluorescence analysis, biocytin recovery and high-quality reconstructions of hippocampal CA2 interneurons following the intracellular electrophysiological recordings in vitro, allowing neuronal characterization and ultimately fine neuronal anatomy to be studied.

Biocytin kurtarma ve dolgulu hipokampal CA2 Interneurons 3D rekonstrüksiyonu

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...