Bu yazının hazırlanmasındaki yardımlarından dolayı Dr Michael Wooten teşekkür ederim. Bu çalışma NIH 2RO1NS033661 (MWW) tarafından desteklenmiştir.

1. Harvest Set-up önce <ol><li> Nöron hasat için prenatal yavrular üretmek için, 19 gün önce nöron izolasyon gün yetişkin farelerin arasında üreme planlayın. (C57BL / 6 farelerde yaşları 2-8 ay bu protokolü geliştirmek amacıyla çiftleşmelerin kullanılmıştır). Başarılı çiftleşme gebelik kadın, çarpıntı veya görsel onay vajinal fiş algılama tarafından teyit edilebilir. </li><li> Önce nöron izolasyon gün: <ol class="ualpha"><li> Için immünfloresan uygulamaları, 3:1 Kollajen 1, Rat Kuyruk hafif bir kaplama ile 24-iyi plakasını kat cam lamelleri: poli-D-Lizin çözüm. </li><li> Hücre kültürü uygulamaları için, 3:1 Kollajen 1, Rat Kuyruk hafif bir kaplama ile kaplamak uygun büyüklükte doku kültürü plastik eşya: poli-D-Lizin çözüm. </li></ol></li><li> Gecede bir UV ışık altında bir doku kültürü kaputu ortaya çıkarılan plakalar dinlendirin. </li><li> Öncesinde steril Hank Dengesi Tuz Çözeltisi (HBSS) ile plakaları yıkayınkullanımı. Kaplı plakalar HBSS dolu ve karanlıkta 4 ° C&#39;de bir haftaya kadar saklanabilir. </li></ol> 2. Doku Hasat <ol><li> Primer hücre kültürleri büyüyen ve gibi, büyük dikkat en steril ortamda mümkün sağlamak için olunmalıdır zaman Sterilite her zaman bir faktördür. Steril teknik dikkat ile, bu protokol için nöral dokunun ilk diseksiyonu ve hasat kontaminasyon riskini en aza ile bir laminer akış kaput dışında tamamlanabilir. İlk hasattan sonra, sonraki tüm adımları hücre kültürü için nominal bir kaput içinde maksimum steril koşullar altında yürütülmelidir. </li><li> Dekapitasyon yoluyla yaklaşık 19 gün sonrası fertilizasyon bir hamile fare Euthanize. Anestezi (Stratmann, ve ark., 2010) beyin hücre ölümüne neden olduğu bilinmektedir olarak hamile kadın euthanize anestezi kullanılması tavsiye edilmez. Steril diseksiyon makas ve forseps kullanarak, orta-ventral tarafta bir açılış oluşturmakFare tamamen vücut boşluğu ortaya çıkarmak için. Araçlar alkol ve açık alev kullanarak sterilize edilebilir. </li><li> Prenatal yavru farenin vücut boşluğunda gerisinde yer alacak ve rahim içinde kolayca görünür olmalıdır. Otoklavlanmış steril forseps ile rahim açın ve yavrular çıkarın. Bir mikroskop altında steril gazlı bez üzerinde taze steril makas ve yer kaldırıldı kafa ile yavrular başını kesmek. Steril, otoklavlanmış araçlar alev alkol ve önce bir açık alev kullanılarak temizlenmeli ve kullanım sırasında olabilir. </li><li> Steril makas veya burun boynun arkasından yavru bir neşter, açık kafatası kullanma. Bu işlem normal vertebra forameni makas bir ucu ekleme ve daha sonra öne doğru ilerleyerek tamamlanabilir. Dikkatle forseps ile tüm beyin kaldırın. Steril gazlı bez beyin yerleştirin. Steril bir bistüri kullanarak, beyincik kaldırmak ve iki hemisfer (Şekil 1) içine ayırmak için beynin orta hat aşağı kesilirken<html> . </li><li> Steril forseps ile hipokampus çevreleyen meninksler küçük bir bölümünü tutun ve yavaşça uzağa çekin. Bu hipokampus izole edilmeden önce meninksler kaldırmak için çok gerekli olmamasına rağmen, menenjlerin varlığında membran tokluk nedeniyle daha zor hipokampüsün Diseksiyon yapabilir. Her iki durumda da, hipokampus meninksler temizlendikten sonra daha açık bir şekilde görülecektir. Hipokampus yarımkürede ve ventral bükülür (Şekil 2) distal kısmında başlar kavisli bir yapıdır. Iç, içbükey, yan (kaudal) bir ventrikül karşı karşıya olduğu gibi, zaten ücretsizdir. Bu nedenle, hipokampus izole etmek için, tek bir dışbükey dış tarafı boyunca kesilmesi gerekmektedir. Diseksiyon sonra, yavaşça bir hücre kültürü başlık altında ısınmış (37 ° C) HBSS ile küçük bir doku kültürü çanak içine steril doku forseps ve transferi ile her hipokampi kaldırın. Beyin dokusu çok yavrular ile kombine edilebilir. </li></ol>&quot;&gt; 3. Doku Ayrılma <ol><li> 100 mm Doku Kültürü çanak steril HBSS 3 ml steril bir neşter, yavaşça kıyma beyin dokusu kullanma. </li><li> 15 ml konik tüp kıyılmış doku ve HBSS aktarın. HBSS 1.5 ml ve 5 mL total hacim% 0.25 tripsin çözeltisinin 0.5 ml ilave edilir. </li><li> Cap ve yavaşça tüp karıştırmak için 4-5 kez ters çevirin. Sindirilmiş dokusundan salınan DNA kabarcıklarına yapışmaz ve kıyılmış doku tüpün alt kısmında (Şekil 3) yerleşim yerine dalgalanmaya neden olacaktır kabarcıkları üreten kaçının. </li><li> Her 5 dakikada yukarıdaki gibi, 15 dakika 37 ° C&#39;de tersini tüp hipokampus doku inkübe edin. </li><li> Doku tüpün dibe izin verir. </li><li> Dikkatle tüpün dibinde bozulmamış dokusu bırakarak, steril bir pipet kullanarak fazla çözüm kaldırın. </li><li> 5 dakika 37 ° C&#39;de HBSS 5 ml doku pelet yıkayın. 3 kez toplam tekrarlanır. Doku tamamen yerleşmesine izinTüp sonraki yıkama adımı geçmeden önce her zaman alt. </li><li> Doku pelet gelen son yıkama çıkarın ve taze HBSS 2 ml ile değiştirin. </li></ol> 4. Nöron ufalama <ol><li> Triturasyonun adımları başlamadan önce, ısı ile cilalanmış Pasteur pipetler hazırlamanız gerekir. Bir Bunson brülör kullanarak, pipet açıklığın çapı (Şekil 4b) hafifçe yuvarlatılmış olan boyutu ve pipet açılış kenarları yaklaşık 0.5 mm kadar alev içinde steril 9 inç Pasteur pipet ucu (Şekil 4a) tutun. Öğütme işlemine başlamadan önce tamamen soğumasını pipet izin verin. </li><li> Normal bir steril 9 inç Pasteur pipeti kullanarak, hafifçe dokunun 7 kez toplam öğütmek. Daha büyük doku parçaları, bu noktada, normal olarak ve önceden sonraki aşamaya hareketli tüpün dibe izin verilmelidir. </li><li> Taze bir steril 50 ml konik tüp süpernatant aktarın. </li><li&gt; Kalan doku için, steril HBSS 2 ml ekleyin ve ısı ile cilalanmış Pasteur pipeti ile 5 kez toplam öğütmek. </li><li> Tüm kalan daha büyük bir doku parçaları tüpün dibe ve 4 ml ayrışmış nöronal hücrelerde toplam önceki süpernatanıyla süpernatan birleştirmek için olanak sağlar. </li></ol> 5.. Hücre Kaplama <ol><li> Bir hemasitometre kullanarak dissosiye hücreleri hesaplama. </li><li> Genel bir kural olarak, bir kez hücre sayıları tespit edilmiştir, Kaplama sonrası oluşabilecek herhangi bir hücre ölümünü açıklamak için bu son sayısını% 20 çıkarmak. </li><li> Hücreler aşağıdaki önerileri kullanarak kaplama yapılabilir: Bir 24 kuyulu plakanın in lamelleri için - 6 x 10 4 hücre / çukur 0.5 ml 4 x 10 5 hücre / 3 ml plaka - 60 mm Doku Kültürü plakalar için 6 x 10 6 hücre / 6 ml plaka - 100 mm Doku Kültürü plakalar için </li><li> Neurobasal Kaplama Medya belirtilen hacmi (Neurobasal uygun hücre sayıları karıştırınB27 Supplement içeren ortam [1 ml / 50 ml], 0.5 mM glutamin Çözelti, 25 uM Glutamat (Sn 147,13 g / mol), penisilin (10.000 ünite / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml), [250 ul / ml 50] , 1mM HEPES (Bay 238,3 g / mol),% 10 Isı İnaktive Donör At serum) ve plakaları hücreleri ekleyin. Swirl plakaları hafifçe eşit hücreleri dağıtmak için. HI-Donör At Serum büyüme ilk 24 saat içinde hücreler zenginleştirmek için Kaplama Medya eklenir. Daha sonra hücreler serumdan sütten vardır ve her bir medya değiştirilmesini serum seri redüksiyon bir serumsuz ortamda döndürülür. Daha yüksek konsantrasyonlarda glutamat buraya eklenen daha düşük konsantrasyonlarda, nöronal hücre kültürü için toksik iken, non-nöronal hücrelerde 11 arasında bağlanma inhibe olacağı da belirtmek gerekir. Ancak, sadece kültüründe ilk 24 saat için kaplama medya eklenmelidir ve daha sonra hücrelerin nörotoksisite önlemek için herhangi bir Besleme Medya dışında kaldı. </li><li> P% 5 CO2 inkübatör bir gecede 37 ° C nöronlar, dantel. </li><li> Hücrelerinden ortam yarı hacme kaldırmak ve Neurobasal Besleme Ortam aynı hacimde (Neurobasal Media B27 Supplement içeren ile değiştirmek [1 ml / 50 ml], 0.5 mM glutamin Çözelti, penisilin (10.000 ünite / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml) [250 ul / ml 50], 1 mM HEPES (Sn 238,3 g / mol.) </li><li> Nöronlar eski medya yarısı kaldırarak ve taze Neurobasal Besleme medya aynı hacmi ile değiştirerek her 4 günde bir beslenmelidir. Nöronal süreçleri Gün 1 (Şekil 5a) görünür olmasını ve 10. Gün (Şekil 5b) tarafından yaygın hale başlamalıdır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Primer nöronal hücrelerin büyümesine ve kültürüne yeteneği nörobilim vazgeçilmez bir parçası haline gelmiştir. Primer kültürler, araştırmacı spesifik hücresel yollar analiz kimyasal modifikasyonu ve tedavi, hedef loc izinkontrollü bir ortamda alization ve büyüme modelleri. Bu işlemlerin çoğu hücre yanıtlarının belirli değişiklikleri görmenizi sofistike yöntem kullanmaktadır. Bu durumda, hipokampal nöronlar sağlam beyinde analiz etmek zor, imkansız değilse kanıtlayacak spesifik nöronal incelemek için kullanılır. Beynin belirli bölgelerinden nöronların yakın homojen nüfus hazırlanması beyin fonksiyonlarını incelemek için önemlidir. Bireysel nöronlar moleküler etkileri, bellek ya da öğrenme gibi yüksek mertebeden yolları ortaya koymaya vesile olabilir. Bu protokol glial hücre besleyici tabaka gerek kalmadan hipokampal nöronların nispeten saf kültürlerin, verir gibi, bu nöronların kolayca immunofloresan çalışmalar için kullanılmaktadır. Ancak, birden fazla organ hücre türleri içeren tüm primer kültürü ile olduğu gibi, daha az arzu edilen hücreler tarafından bazı kirlenme oluşabilir. Nöronal hücrelerin izolasyonu, glial hücreler tarafından kontaminasyon ortak bir sorun olabilir. Glial hücreler cbunların morfolojisi hedef nöronların (Şekil 6) önemli ölçüde farklıdır olarak kolayca kültür, mikroskopik üzerine tespit edilebilir. Glial hücre bulaşma etkisi kültürlerin planlanan kullanımına bağlıdır. Hücreler immün floresan inceleme için kullanılıyorsa bireysel nöronlar fotoğraflamak için çalışırken, glial kontaminasyon bir rahatsızlıktan başka bir şey olabilir. Nöronal kültürler biyokimyasal analiz için kullanılacak olan, ancak, gliyal hücreleri tarafından herhangi bir önemli kirlenme sonuçlar büyük değişiklikler neden olabilir. Glial hücre kontaminasyonu çözüm yolları Tartışma daha da özetlenmiştir. Sonra nöronlar başarıyla izole ve kültür yetiştirilen edilmiş, tipik bir uygulama immüno-floresans teknikleri hücresel süreçleri incelemektir. Şekil 7 &#39;de gösterildiği gibi, örneğin mitokondri olarak organellerinin, düzeltmek için önceden kültür ortamına ilave vital boyalar kullanılarak lekelenmektedir edilebiliration. Endojen hücresel proteinlerin standart immün floresans teknikleri (Şekil 8) kullanarak sabit hücrelerden görüntülenebilmekte. Bir kez nöronal hücrelerde sabittir, ilgi proteinler için özel antikorlar hücreye sokulabilir ve bu proteinlerin bir floresans mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. Kültür nöronlar da nöronal işlevleri bireysel protein etkilerini incelemek için gerekli olan yolları araştırmacı sağlar. DNA Transfeksiyonlar, elektroporasyon veya viral transdüksiyon dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak, proteinler nöronal hücrelerde (Şekil 9) aşırı eksprese edilebilir. Fazla dile getirdikleri proteinlerin etkilere tepki nasıl sinir hücreleri beynin yanıt verebilir nasıl doğrudan çıkarımlar var ve ilaç tedavileri için hücresel hedefler belirleme olanağı sunuyor olabilir. Deneyler bu tür ayrıntıları bu yazının kapsamı dışındadır giderler ama bu teknikle hazırlanan kültürleri aşağı-s geniş bir dizi için uygun olduğunu göstermektedir yoktream uygulamaları. Bununla birlikte, bu protokolünün genel basitlik yanı sıra, bu nöronal kültürler hazırlamak için gerekli olan kısa bir zaman periyodu, bu bugünün nörobilim laboratuar kullanım için ideal bir yöntem yapmaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig1.jpg" /> Şekil 1. Prenatal fare beyin Diseksiyonu. İlk insizyon iki hemisfer ayrılarak beynin orta hat inmektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig2.jpg" /> Şekil 2. Prenatal fare beynindeki hippocampus yeri. Striatum, hipokampus görselleştirmek için kenara taşınır ve her yarımkürenin distal bölgede eğri &quot;barbunya&quot; tipi yapı tarafından not edilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig3.jpg" /> Şekil 3. Tripsin çözüm hipokampal doku Ayrılma. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig4.jpg" /> Şekil 4. Pasteur, iğne ucu hipokampal doku triturasyonun kullanılır. (A) Normal Pasteur, pipet. (B) Yangın cilalanmış Pasteur, pipet. Yuvarlatılmış kenarları not Pipet ve açılış boyutta yaklaşık% 50 azalma atın. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3634/3634fig5.jpg" /> Şekil 5. Hipokampus nöron Bu prosedür ile NB Medya kaplama kullanılarak izole. (A) Hücre büyümesi 1 gün sonrası kaplama. Nöronal süreçleri Gün 1 sırasında görünür olmaya başlar. (B) Hücre büyümesi 10 gün sonrası kaplama, neurites dallı ve örtüşen. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig6.jpg" /> Şekil 6. 7 gün boyunca yetiştirilen glial hücreleri ile kontamine ve organel işaretleyici MitoTracker Kırmızı CM-H2XRos (Invitrogen # M7515) ve transfe ile boyandı hipokampus nöronlipofektamin 2000 (Invitrogen # 11.668.019) kullanarak GFP-LC3 ile cted. Mitokondri bütün hücrelerdeki Bununla birlikte, sadece tek bir nöron başarılı bir flüoresan yapı ile transfekte edildi görülebilir. Glial hücreleri ile Kontaminasyon görselleştirmek zor nöronal süreçleri GFP-LC3 ifade analizini yapar. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig7.jpg" /> Şekil 7. Hipokampus nöron 7 gün büyüdü ve organel işaretleyici MitoTracker Kırmızı CM-H 2 XRos (Invitrogen # M7513) ile boyandı. Bu vital boyanın doku kültür hücre aktif mitokondri leke için kullanılır. Hücreler% 4 paraformaldehit / PBS içinde sabit ve floresan mikroskop görüntülendi. Mitokondride okside kadar boya kendisi olmayan floresan olduğunu. Aktif mitokondri nöronal süreci boyunca görülebilir. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig8.jpg" /> Şekil 8. </strong 7 gün boyunca yetiştirilen&gt; hipokampus nöron,% 4 paraformaldehit / PBS ve monoklonal anti-tubulin β antikor (Sigma # T0198) ile immün-boyandı ile sabitlenir. Primer antikor ardından, Oregon Green (Invitrogen # O11033) keçi-anti-fare sekonder antikoru etiketli eklendi ve floresan mikroskop ile görüntülendi. <img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/3634/3634fig9.jpg" /> Şekil 9. Hipokampus nöronal kültürler lipofektamin 2000 (Invitrogen # 11668019) kullanılarak inşa 5 gün süreyle yetiştirilir ve GFP-LC3β DNA ile transfekte edildi. Gün 7 anda, hücreler mikroskop kullanarak kendi dış membran dahil GFP tagged LC3β olarak görüntülenmiştir% 4 paraformaldehit / PBS ve aggresomes edildi kullanılarak tespit edildi. Aggresomes hücre gövdesi ve neurites çapında bulunmaktadır ve oklarla gösterilir.

<ol>
	<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126, 397-442 (1977).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+B27/neurobasal+medium+supports+differentiated+growth+of+neurons+from+the+striatum,+substantia+nigra,+septum,+cerebral+cortex,+cerebellum,+and+dentate+gyrus.">Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.</a> J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).</li><li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons.">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).</li><li>Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticohippocampal+contributions+to+spatial+and+contextual+learning.">Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning.</a> J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).</li><li>Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortico-hippocampal+interaction+and+adaptive+stimulus+representation:+a+neurocomputational+theory+of+associative+learning+and+memory.">Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory.</a> Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Mao, L., Wang, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gliogenesis+in+the+striatum+of+the+adult+rat:+alteration+in+neural+progenitor+population+after+psychostimulant+exposure.">Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).</li><li>Mao, L., Wang, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+preprodynorphin+and+preproenkephalin+mRNA+expression+by+selective+activation+of+group+I+metabotropic+glutamate+receptors+in+characterized+primary+cultures+of+rat+striatal+neurons.">Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).</li><li>Oorschot, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fluorodeoxyuridine+on+neurons+and+non-neuronal+cells+in+cerebral+explants.">Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants.</a> Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).</li><li>Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+-free+media+for+neural+cell+cultures.">Serum -free media for neural cell cultures.</a> Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).</li><li>Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+dissociation+with+papain+reduces+the+density+of+cGMP-activated+channels+of+the+retinal+rod.">Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod.</a> Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).</li><li>Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+anesthetic+properties:+The+effects+of+isoflurane+on+brain+cell+death,+neurogenesis+and+long-term+neurocognitive+function.">Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function.</a> Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).</li><li>Wallace, T. L., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosine+arabinoside+kills+postmitotic+neurons:+evidence+that+deoxycytidine+may+have+a+role+in+neuronal+survival+that+is+independent+of+DNA+synthesis.">Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis.</a> J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Hipokampal kültürleri 20 yıldan fazla için moleküler biyolojide kullanılan edilmiştir. Prensip olarak ise, nöronal kültürler beyin herhangi bir kısmı ile yapılabilir, hipokampal kültürler hipokampus 7&#39;de sinir hücre nüfusun nispeten basit bir mimariye bağlı en popüler olduğu kanıtlanmıştır. Hipokampal kültürler genellikle geç dönem embriyonik dokudan yapılmıştır. Bu doku ayırmak kolaydır ve olgun beyin dokusu 1 oranla daha az glial hücreler içerir. Embriyoni...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Satıcı </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Sıçan Kuyruk Kollajen 1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Poli-D-lizin Çözelti </td><td> Chemicon </td><td> A-003-E </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solüsyonu </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-095 </td></tr><tr><td> Tripsin Çözüm (1X)% 0.25, sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 15050-065 </td></tr><tr><td> NeuroBasal Orta (1X) sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 Supplement (50X) sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Sıvı L-Glutamin 200 mM (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-149 </td></tr><tr><td> Penisilin (10.000 ünite / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-148 </td></tr><tr><td> HI-Donör At Serum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S12150H </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice

Sıçan ve fare hipokampal nöronların primer kültürlerinde yaygın nörobiyoloji hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılır. Bireysel nöronlar yalıtma ve büyüyerek, araştırmacılar hücresel kaçakçılığı, hücresel yapı ve biyokimyasal çeşitli teknikler kullanarak bireysel protein lokalizasyonu ile ilgili özelliklerini analiz edebiliyoruz. Bu tür deneylerin sonuçları, hafıza ve öğrenme nöral temelini ele teorileri test etmek için önemlidir. Ancak, deney Bu formlardan kesin sonuçlar diğer beyin hücre türlerine göre asgari kirlenme ile nöronal kültürlerin büyümeye yeteneği esas alınır. Bu protokol, biz kirletici hücre tipleri (yani astrositler) en aza indirerek sağlıklı nöronların büyüme optimize etmek embriyonik hipokampus doku nöron büyüme ve dikkatli diseksiyon için özel olarak tasarlanmış ortamları kullanın. Embriyonik fare hipokampus doku di için örnek boyutu nedeniyle benzer bir kemirgen doku daha izole etmek daha zor olabilirssection. Biz embriyonik günde 19 (E19) fare yavrularının gelen hipokampus ayrıntılı diseksiyon teknikleri gösteriyor. Bireysel hücre en az zarar sağlarken bir kez hipokampal doku izole edilir, nöronal hücre nazik ayrışma tripsin ve birleştirici dokudan ayrı hücreleri için tasarlanmış mekanik bir bozulma seyreltik konsantrasyonu ile elde edilir. Kesinti kullanılmak üzere pipet nasıl hazırlanacağını ayrıntılı bir açıklaması dahildir. Optimal kaplama yoğunlukları başarılı hücre kültürü üst düzeye çıkarmak için immuno-floresans protokoller için verilmektedir. Protokol fare hipokampal dokudan nöronal hücre kültürü için hızlı bir (yaklaşık 2 saat) ve verimli bir yöntem sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice at JoVE.com

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Bu yüksek bir besleyici hücre glial tabakanın kullanımı olmaksızın prenatal fare beyinlerinden hipokampal nöronlar saflaştırılmış kültürü için bir protokolü sağlar.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

isolation-and-culture-of-hippocampal-neurons-from-prenatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

70.0K Görüntüleme.  Auburn University. Bu yüksek bir besleyici hücre glial tabakanın kullanımı olmaksızın prenatal fare beyinlerinden hipokampal nöronlar saflaştırılmış kültürü için bir protokolü sağlar.

Video: Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) when compared to spinal motor neurons (SMNs). The ability to isolate and culture primary mouse CN3s, CN4s, and SMNs would provide an approach to study mechanisms underlying this selective vulnerability. To date, most protocols use heterogeneous cell cultures, which can confound the interpretation of experimental outcomes. To minimize the problems associated with mixed-cell populations, pure cultures are indispensable. Here, the first protocol describes in detail how to efficiently purify and cultivate CN3s/CN4s alongside SMNs counterparts from the same embryos using embryonic day 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgenic mouse embryos. The protocol provides details on the tissue dissection and dissociation, FACS-based cell isolation, and in vitro cultivation of cells from CN3/CN4 and SMN nuclei. This protocol adds a novel in vitro CN3/CN4 culture system to existing protocols and simultaneously provides a pure species- and age-matched SMN culture for comparison. Analyses focusing on the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of motor neurons are feasible in this culture system. This protocol will enable research into the mechanisms that define motor neuron development, selective vulnerability, and disease.

Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice

This work presents a protocol to yield homogeneous cell cultures of primary oculomotor, trochlear, and spinal motor neurons. These cultures can be used for comparative analyses of the morphological, cellular, molecular, and electrophysiological characteristics of ocular and spinal motor neurons.

Prenatal Islmn'den Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyon ve Kültürü :GFP Transgenik Fareler

Oculomotor neurons (CN3s) and trochlear neurons (CN4s) exhibit remarkable resistance to degenerative motor neuron diseases such as amyotrophic lateral ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and peripheral neuroregulation. Although extensive research on the lower urinary tract nervous system has been conducted, most studies have focused on primary culture. This protocol introduces a method for the isolation and culture of bladder neurons and glia from Sprague&#8211;Dawley rats. In this method, the neurons and glia were incubated in a 37 &#176;C, 5% CO2 incubator for 5&#8211;7 days. As a result, they grew into mature shapes suitable for related subsequent immunofluorescence experiments. Cells were morphologically observed using an optical microscope. Neurons, synaptic vesicles, and glia were identified by &#946;-III-tubulin and MAP-2, Synapsin-1, and GFAP staining, respectively. Meanwhile, immunocytochemistry was performed on several neurotransmitter-related proteins, such as choline acetyltransferase, DYNLL2, and SLC17A9.

This protocol attempts to establish a repeatable protocol for primary neurons and glia isolation from rat bladder for further cellular experiments.

Yetişkin Sıçan İdrar Kesesinden Primer Nöronların ve Gliaların İzolasyonu ve Kültürü

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the eye. This ganglion is constituted by a homogenous population of ciliary and choroidal neurons that innervate striated and smooth muscle fibers, respectively. Each of these neuronal types regulate specific eye structures and functions. Over the years, neuronal cultures of the chick ciliary ganglia were shown to be effective cell models in the study of muscle-nervous system interactions, which communicate through cholinergic synapses. Ciliary ganglion neurons are, in its majority, cholinergic. This cell model has been shown to be useful comparatively to previously used heterogeneous cell models that comprise several neuronal types, besides cholinergic. Anatomically, the ciliary ganglion is localized between the optic nerve (ON) and the choroid fissure (CF). Here, we describe a detailed procedure for the dissection, dissociation and in vitro culture of ciliary ganglia neurons from chick embryos. We provide a step-by-step protocol in order to obtain highly pure and stable cellular cultures of CG neurons, highlighting key steps of the process. These cultures can be maintained in vitro for 15 days and, hereby, we show the normal development of CG cultures. The results also show that these neurons can interact with muscle fibers through neuro-muscular cholinergic synapses.

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system. Neuronal cultures of chick CG neurons were shown to be effective cell models in the study of nerve muscle interactions. We describe a detailed protocol for the dissection, dissociation and in vitro culture of CG neurons from chick embryos.

Chick Ciliary Ganglion Nöronların İzolasyon ve Kültür

Chick ciliary ganglia (CG) are part of the parasympathetic nervous system and are responsible for the innervation of the muscle tissues present in the ...