This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.

BOEC kuşak protokolünün şematik Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 1. Kan Toplama ve Yoğunluk Gradient Santrifüj <ol><li> Her bir donör, iki 50 ml konik santrifüj tüpleri her sodyum sitrat 3 ilave edin. Damar delme ile kan 60 ml toplamak ve her tüpe 30 ml ekleyin. Karıştırmak için hafifçe 2-3 kez ters çevirin. Buna göre ayarlanır sitrat hacimli, protokol kan az 40 kadar ml kullanın. NOT: Bu kan örnekleri alındıktan sonraki 2 saat içinde işlenir esastır. Outgrowth koloni verim belirgin bir azalma kan sonuçlarının işlenmesi Gecikmeli. </li><li> İlk şişeyi karıştırmak için birkaç kez ters çevirerek yoğunluk gradyan santrifüj ortamı içeren yeni konik tüpler hazırlayın. Steril bir başlık olarak, 50 ml konik bir tüp başı (kan, her 10 ml donör başına 6 tüp 1 tüp) yoğunluk gradyanlı santrifüj ortamının 15 ilave edin. </li><li> Dulbecco&#39;nun Fosfat ile 1: 1 seyreltin kan-buffered Salin (DPBS). Çalışma yüzeyi ile 20 ° &#39;lik bir açıya yoğunluk gradyanlı santrifüj ortamı içeren tüp yatırın. Bir pipet yardımı ve 25 mi serolojik pipet kullanarak, yavaş yavaş yavaş eğimli borunun duvar aşağı kan eklenerek ortam üzerine seyreltilmiş kan 21 ml katman. NOT: Aksi takdirde yoğunluk gradyan tabaka ile kan karışmasını en aza indirir ve daha sıkı buffy coat, hem de artan bir verimdeki üretecektir. </li><li> 35 hızlandırıcı ile oda sıcaklığında dakika ve fren kapalı 400 xg&#39;de Santrifüj örnekleri. </li><li> 2.4 - Bu santrifüj döneminde adımlar 2.1 detaylandırılan kollajen kaplama başlar. Bu adımlar 3.1 adıma geçmeden önce tamamlanmıştır olun. </li></ol> T-75 balonuna ve kültür besiyeri Preparasyon 2. Kolajen Kaplama NOT: Bir hücre kültürü kaputu aşağıdaki adımları uygulayın. <ol><li> Stok Ty seyrelterek bir 50 ug / ml kolajen çözeltisi hazırlayın. I 0.02M asetik asit Örnek 10 ml kolajen pe: kolajen stok için 4.05 mg / ml konsantrasyonda, 0.02 M asetik asit 10 ml kolajen 123.5 uL ekleyin. Steril filtre kollajen süspansiyonu, kullanımdan önce. </li><li> Serolojik bir pipet kullanarak, bir T 75 hücre kültürü şişesine kolajen çözeltisi 7,5 ml ekleyin. Bu hacim 5 ug kollajen / cm 2 (veya 375 ug / şişesi) verir. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile kaplayın şişe. </li><li> Üretici tarafından sağlanan büyüme faktörü takviyeleri ile endotel bazal ortamı ilave ile BOEC üretimi için kullanılan endotelyal büyüme ortamı hazırlayın. Tüm takviyeleri ekleyin, ancak serum ilave etmeyiniz. , BOEC üretim ortamının 15 ml hazırlamak büyüme faktörü eklemeleri içeren endotelyal büyüme ortamı, 12.5 ml tanımlanır fetal sığır serumu (FBS), 2.5 ml ekleyin. </li><li> , 1 saat kaplama süresinden sonra Bölüm 3&#39;te belirtilen adımlara devam kollajen çözüm aspirat ve pipetleme kalan asetik asit silsin10 ml DPBS. DPBS kapalı aspire ve bir kez daha bu yıkama adımı tekrarlayın. Aşama 3.3 sırasında elde edilen hücre süspansiyonu, şu anda kaplama hazır değilse, kurutma-out kolajen kaplama tutmak için şişeye BOEC üretim ortamının 5 mL ekleyin. </li></ol> 3. Toplama ve PBMNCs ve Kaplama <ol><li> Aşama 1.4&#39;te tarif yoğunluk gradyan santrifüjü takiben, dikkatli bir şekilde, steril plastik bir transfer pipeti kullanarak, ince beyaz tabaka faz toplanır. Buffy coat toplanması her tüpten hücre süspansiyonu ve plazma yaklaşık 20 ml vermelidir. Yoğunluk gradyan ortamı transfer kaçının. </li><li> Mononükleer hücre süspansiyonu 1 seyreltilir: DPBS&#39;de 1 ve karıştırmak için ters. Maksimum fren ile gaz pedalı 300 x g&#39;de 20 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj işleminin ardından, basılı art arda her bir topağa BOEC üretim ortamı, 1 ml ilave edilmesi ve yukarı ve aşağı pipetleme süpernatan ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire. Havuz hücresi bir süspansiyonlarıKalan ortamı ile 10 ml d kontör toplam hacim. </li><li> Toplam hücre sayısı, örnek hücre süspansiyonu 10 ul bir tahmin almak ve kırmızı kan hücreleri lyse olacak Türk&#39;ün solüsyonu 490 ul ile 50x sulandırmak için. Bir hemositometre kullanılarak seyreltilmiştir hücre süspansiyonu, 10 ul numune sayısı. NOT: Kan 60ml kaplama için yaklaşık 100-150 x 10 6 beyaz kan hücrelerini boyun eğmek zorundadır. </li><li> Tek bir kollajen kaplı T-75 balon içine Plaka tüm hücre süspansiyonu,% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C &#39;de 15 mL / şişe ve kültür üst kadar orta hacimli. Bu anda kaplama hücreler pasaj 0 temsil etmektedir. Not: Bu, daha sonraki bir zamanda veya BOECs oluşturulabilir farklı laboratuara PBMNCs taşımak amacıyla BOECs elde etmek amacıyla, önceki BOEC izolasyon izole PBMNCs dondurmak mümkündür. Bununla birlikte, bu dondurma PBMNCs BOEC izolasyonun etkinliğini azaltabilir dikkat etmek önemlidir. Syöntemi için aşağıdaki ee bölüm 8. </li></ol> 4. Uzun süreli Hücre Kültürü <ol><li> Taze BOEC üretim ortamının 15 ml ekleyerek ortam her 2 günde değiştirme (5: endotelial hücre büyüme ortamı 1 karışımına FBS tanımlanır). Hafta sonları için, orta değişiklikler her 3 gün gecikebilir. NOT: akıbet koloniler kültür 7 ve 14 gün arasında görünmelidir. </li><li> Akıbet kolonilerin görünümü için gün 7-14 BOEC kültür şişesi izleyin. Klasik endotel Arnavut kaldırımı morfolojisi sergileyen hücreler dairesel grupları gibi koloniler tanımlayın. </li><li> Koloni ya da çoklu koloniler bir şişe içinde tespit edildikten sonra, ortam değişiklikleri ile devam eder ve koloniler pasajlarının önce koloni başına yaklaşık 1000 2.000 hücrelere büyümeye olanak sağlar. Kaba bir görsel tahmin ile koloni başına hücre sayısını belirler. NOT: Bir rehber olarak, bir hafta birinci akıbet kolonisinin tanımlanmasından sonra geçit ilk akıbet kolonileri adettendir. </li> &lt;li&gt; DPBS 10 ml ile iki kez durulama ile şişeler Geçiş hücreleri. 1X Tripsin-EDTA 5 ml ilave edilir ve 5 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir. 5 dakika sonra, ortam (FBS ihtiva eden) 10 ml tripsin nötralize etmek ve tekrar pipetleme ile süspansiyon haline hücreleri getir. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de, taze BOEC üretim ortamının 15 ml tekrar süspansiyon ve yeni bir T-75 balonuna (temsil kanalı 1, P1) içine tüm bir hücre süspansiyonu plaka santrifüjleyin süspansiyon. Hiçbir kollajen kaplama gereklidir. </li><li> Hücreler birleştiklerinde, (kap başına yaklaşık 3-5 x 10 6 hücre) kadar yukarıda tarif edildiği gibi orta değişiklikler devam edin. Birleşmiş sonra, geçit hücreleri adım 4.3 de tarif edildiği gibi. Not: itibaren geçit 2, hücreler artık BOEC nesil orta gerektirir ve endotel hücre büyüme ortamı ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş, standart FBS içinde kültürlenebilir. Kollajen varlığı BOEC prolifer artırabilirsiniz olduğunu gösteren kanıtlar var gibi Kollajen kaplama, isteğe bağlı bir adım ileri gidiyor olarak kullanılabilirtirme oranları. </li><li> Devam Pasajlanması, plaka T-75 balonuna başına hiçbir az 750.000 den hücreleri için düşük hücre yoğunlukları BOECs çoğalan durmasına neden olabilir. </li></ol> 5. Donma ve Çözülme BOEC Kültürleri <ol><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de bölüm 4.3 ve santrifüj açıklandığı gibi hücreleri Trypsinize. Ortam, 10 ml supernatant ve tekrar süspansiyon aspire. Bu endotelial hücre büyüme ortamı gerektirmez; 10%, standart FBS bulunan DMEM yeterli olacaktır. Bir hemositometre kullanılarak el ile hücre sayımı gerçekleştirmek için hücre süspansiyonu, 10 ul numune toplayın. </li><li> Buz soğukluğunda kriyoprezervasyon ortamında (% 50 FBS ve% 10 DMSO ile% 40 DMEM) &#39;de 2x10 6 hücre / ml&#39;de tekrar santrifüj ve süspansiyon haline getirin. Bir buz soğuk izopropanol dondurulması gemi ve yerinde 0.5 ml (10 6 hücre) her şişeye, yer şişeleri ekle -80, en az 2 saat ° C derin dondurucuda sıvı nitrojen aktarmadan önce. Birden fazla 24 saat boyunca -80 ° C &#39;de hücreler bırakma. </li&gt; <li> Hücreler çözülme 15 ml konik santrifüj tüpüne önceden ısıtılmış ortam 10 ml ekleyin. NOT: pasajı 1 hücreleri çözdürme zaman çözdürme sonrası ilk 2 gün FBS tanımlanmış% 20 ile desteklenmiş endotel hücre büyüme ortamına çözülme. Bu daha kararlı bir hücre izolasyonu ileriye yol açar. </li><li> Sadece küçük bir buz kristali şişe içinde kalana kadar hafif bir çalkalama ile 37 ° C su banyosu içinde, sıvı azot ve çözülme hücreleri çıkarın. Konik santrifüj tüpüne flakon damla damla içeriğini ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> 10 ml EGM-2mV +% 10 FBS içinde Süpernatant aspire ve tekrar süspansiyon hücre pelet. 15 ml T-75 şişesi ve kontör orta ekleyin. </li></ol> Akış Sitometrisi ile BOECs 6. Karakterizasyonu <ol><li> Lekeleme tampon maddesi içinde ml başına 10 6 hücre konsantrasyonunda bölüm 4.4 ve tekrar süspansiyon tarif edildiği gibi, Bölüm 4&#39;te tarif BOEC koloniler trypsinize hücreleri genişletmek için izin verilmiş sonra (DPBS with% 2 FBS ve 2 mM EDTA). </li><li> CD45, CD14, CD34, CD31 (kullanım 01:20 seyreltme tüm) veya VEGFR2 (sulandırmak 01:10) yöneltilen florokrom-konjuge antikor (detaylar için bakınız Tablo 1) ile 10 5 hücreleri birleştir. Karanlıkta 4 ° C&#39;da 30 dakika kuluçkalayın. </li><li> 1 ml 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de tampon ve santrifüj boyama hücreleri yıkayın. Süpernatant aspire ve analiz için 400 ul tampon boyama tekrar süspansiyon. 4 ° C&#39;de tutun hücreleri ve ışıktan analizden önce korunmaktadır. </li><li> Deneyde kullanılan floresan konjuge antikorları tespit etmek için donatılmış bir sitometresindeki sitometrik analizi yapın. </li><li> İleri ayarlama ve yan dağılım gerilimleri yanı sıra FITC ve APC kanallar için gerilimler tarafından sitometresindeki hücre popülasyonunu belirlemek için bir lekesiz BOEC örneği kullanın. </li><li> Her florokrom için izotip lekeli hücreleri kullanarak eşik yolluk belirleyin. Presenc dayalı olarak her bir hücre yüzey markörü için pozitif değerlendirilmesiflorokrom için izotip kontrol grubuna kıyasla flüoresans yoğunluğunda bir pik kayması e analiz edilir. </li></ol> Immunofluorescent Mikroskopi BOECs 7. Karakterizasyonu <ol><li> Endotelial hücre büyüme ortamı 500 ul 5 x 10 4 hücre yoğunluğunda lamelleri olmadan 24 oyuklu düz dipli doku kültür plakasında Plaka BOECs +% 10 ısı ile inaktive edilmiş oyuk başına FBS ve bağlı ve 37 ° C&#39;de büyümeye bırakın ° C, hücreler kadar% 5 CO2, en az 70-80, her yüzey alanının% de (hafif microsope altında görsel inceleme ile tahmini konfluent) kapsamaktadır. </li><li> DPBS 1 ml 5 dakika boyunca her bir hücrelerin yıkayın. </li><li> DPBS içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi 500 ul 4 ° C &#39;de hücreler O / N sabitleyin. </li><li> Oyuk başına DPBS 1 ml 3 x 5 dakika boyunca hücreler yıkanır. Ekleyin ve sırasıyla bir pipet ve bir aspiratör kullanarak DPBS kaldırmak. </li><li> DPBS içinde% 0.2 polisorbat 20, 3 x 10 dakika boyunca hücreler geçirgenliği. </li&gt; <li> DPBS içinde% 10 FBS içeren bloke edici tampon içinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe hücreleri. </li><li> 4 ° CO de leke hücreleri antikor seyreltme tamponu CD34 (10 ug / ml), CD144 karşı birincil antikor ihtiva eden (DPBS içinde% 0.1 sığır serum albümini) içinde 300 ul / N (1: 300) ya da vWF (1: 250) . Tüm ayrıntılar için Tablo 1&#39;e bakınız. </li><li> DPBS ile 5 x 10 dakika boyunca, bağlanmamış birincil antikor yıkayın. </li><li> (: 200, 1 hiç) Tablo 1 &#39;de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, uygun bir floresan etiketli ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe hücreleri. </li><li> DPBS ile 5 x 10 dakika boyunca Bağlanmamış ikinci antikorları yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DPBS / ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol 1 ug (DAPI) ile hücrelerin inkübe edin. </li><li> Bir başka 3 x 5 dakika boyunca DPBS ile hücrelerin yıkayın. </li><li> Bir takmak kullanarak floresan uyarma için harici bir ışık kaynağı ile donatılmış ters bir mikroskop kullanılarak 100x büyütmede görüntü hücreleri ve yakalama görüntülerisonraki analiz çevrimdışı için ed dijital fotoğraf makinesi. </li></ol> 8. Donma ve Çözülme PBMNCs <ol><li> Santrifüj sonraki aşamada 3.2 sonunda, orta aspire ve manuel tekrarlanan pipetle kadar olan ve bir P1000 pipet kullanarak aşağı hücre pelet bozabilir. Bir hücre süspansiyonu üretmek için hafifçe karıştırın emin olarak, dondurma ortamı,% 90 serum ve% 10 DMSO 1 ml ilave edilir. Bir cryovial hücre süspansiyonu aktarın ve dondurma ve Bölüm 5&#39;te açıklandığı gibi çözülme. </li></ol>

<ol>
	<li>Yancopoulos, G. D., Klagsbrun, M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenesis,+angiogenesis,+and+growth+factors:+ephrins+enter+the+fray+at+the+border.">Vasculogenesis, angiogenesis, and growth factors: ephrins enter the fray at the border.</a> Cell. 93, 661-664 (1998).</li><li>Flamme, I., Fr&#246;lich, T., Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+vasculogenesis+and+embryonic+angiogenesis.">Molecular mechanisms of vasculogenesis and embryonic angiogenesis.</a> J Cell Physiol. 173, 206-210 (1997).</li><li>Asahara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis.">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+circulating+bone+marrow-derived+endothelial+cells.">Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells.</a> Blood. 92, 362-367 (1998).</li><li>Ormiston, M. L., Deng, Y., Stewart, D. J., Courtman, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+the+therapeutic+actions+of+endothelial+progenitor+cells+in+pulmonary+hypertension.">Innate immunity in the therapeutic actions of endothelial progenitor cells in pulmonary hypertension.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 546-554 (2010).</li><li>Hur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+two+types+of+endothelial+progenitor+cells+and+their+different+contributions+to+neovasculogenesis.">Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 288-293 (2004).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Yoder, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+analysis+reveals+a+specific+HOX+signature+associated+with+positional+identity+of+human+endothelial+cells.">Transcript analysis reveals a specific HOX signature associated with positional identity of human endothelial cells.</a> PLOS ONE. 9, e91334 (2014).</li><li>Toshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+dysfunction+of+endothelial+progenitors+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Evidence of dysfunction of endothelial progenitors in pulmonary arterial hypertension.</a> Am J Respir Crit Care Med. 180, 780-787 (2009).</li><li>Wang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+storage+and+secretion+of+von+Willebrand+factor+in+blood+outgrowth+endothelial+cells+derived+from+patients+with+von+Willebrand+disease.">Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease.</a> Blood. 121, 2762-2772 (2013).</li><li>O'Neill, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+revascularisation+of+ischaemic+tissue:+the+opportunities+and+challenges+for+therapy+using+vascular+stem/progenitor+cells.">Therapeutic revascularisation of ischaemic tissue: the opportunities and challenges for therapy using vascular stem/progenitor cells.</a> Stem Cell Res &amp; Ther. 3, 31 (2012).</li><li>Geti, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Practical+and+Efficient+Cellular+Substrate+for+the+Generation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adults:+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells.">A Practical and Efficient Cellular Substrate for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Adults: Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells.</a> Stem Cells TM. 1, 855-865 (2012).</li><li>Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+characterization+of+endothelial+colony+forming+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood.">Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2012).</li><li>Martin-Ramirez, J., Hofman, M., van den Biggelaar, M., Hebbel, R. P., Voorberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+outgrowth+endothelial+cells+from+peripheral+blood.">Establishment of outgrowth endothelial cells from peripheral blood.</a> Nat Prot. 7, 1709-1715 (2012).</li><li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+large+scale+expansion+of+adult+human+endothelial+colony+forming+progenitor+cells.">Isolation and large scale expansion of adult human endothelial colony forming progenitor cells.</a> Journal of Vis Exp: JoVE. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.

Yakın zamana kadar, yeni kan damarlarının doğum sonrası kuşak önceden var olan damarların endotel hücreleri yeni damarların filizlenmesi olarak tanımlanan anjiyogenez olarak bilinen bir süreç yoluyla sadece meydana inanılırdı. 1. Bu süreç vaskülojenezde gelen tezat veya embriyojenez esnasında özel olarak meydana geldiği düşünülmektedir endotelyal progenitör kan damarlarının de novo oluşumu. 2 Bununla birlikte, daha yeni çalışmalar, tanımlanmış ve yetişkin periferal kan endotelyal progenitör hücre (EPC) dolaşımdaki izole var. Bu hücreler, kültürde olgun endotel hücrelerine dönüştürmek kapasitesine sahiptir ve doğum sonrası vaskülojenez katılma inanılmaktadır. 3,4 Izolasyon ve bu EPC genişlemesi için protokoller, tipik olarak vascul de dahil olmak üzere endotel büyüme faktörlerini ihtiva eden ortam içinde periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMNCs) kültürünü içerirar endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve fibroblast büyüme faktörü-2. 5-8 EPC kültürleri önemli ölçüde farklı hücre tipleri, çeşitli üretir. İlk kültürler (&lt;7 gün) &quot;erken&quot; EPC olarak literatürde bilinen bir monositik hücre tipi, hakim. Kendilerine ait olmasına rağmen, bu hücreler, monosit işaretleme maddesi CD14 ifade progenitör işaretleyici CD34 için negatiftir ve klasik endotel belirteçler CD31 ve VEGF reseptör 2 (VEGFR2) sadece minimal seviyeleri ifade etmedi. 5 devam kültür hücreleri, ikinci popülasyonuna yolaçar endotel benzeri hücreler gibi gizli koloniler görünür Geç sonucudur EPC veya kan sonucudur endotel hücreleri (BOECs) olarak da bilinir. Monositik erken EPC aksine, aynı zamanda endotel koloni oluşturan hücreler (ECFCs), akıbet endotel hücrelerini ya da geç akıbet endotel hücrelerini adı olmuştur BOECs, endotel hücre mono tabakaları tipik arnavut morfolojisi gösteren ve yüzey işaretleyici son derece benzerdir5 ve gen ifadesi 9 endotel hücrelerini olgun. Periferik kandan endotel benzeri hücrelerin üretimi özellikle de pulmoner arteriyel Hipertoni (PAH), 10 ya da von Willebrand hastalığı. 11. Önceki BOECs mevcudiyeti, endotel gibi vasküler bozukluklarla ilgili endotel hücre fonksiyon bozukluğunun çalışma için, pek çok avantaj sunar hücreler sadece doğumda umbilikal ven ölüm ya da organ nakli, veya izole edilmiş anda nakledilmiş organ elde edilebilir. Bu azaltılmış durumu kardiyovasküler bozuklukların yanı sıra, endotel hücreleri ve ya kan hücreleri veya duvar hücreleri arasındaki etkileşim hastalardan endotel hücrelerinin biyolojisi anlamak için ciddi bir sınırlama temsil etmektedir. Ayrıca, izole ve bu kaynaklardan endotel hücrelerinin saf nüfusu kültüre teknik açıdan zor ve bu yöntemlerle elde edilen hücreler sadece bir limite sergileyend proliferatif kapasitesi. BOECs nedenle hasta kaynaklı primer endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için değerli bir vekil sunuyoruz. In vitro uygulamalara ilave olarak, aynı zamanda BOECs otolog hücre nakli tedavileri de muhtemelen yararlıdır. Bu uygulamalar, 13 BOEC türetilmiş iPSCs hastalığı modelleme için kullanılabilir neovaskülarizasyonu (burada 12 ve referanslara bakın) teşvik etmek için her iki endotel hücre nakli, hem de uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin üretilmesini (iPSCs). Içerir ve başlangıç ​​olarak büyük potansiyel sunmaktadır otolog hücre tedavileri için malzeme. BOECs hızlı ve deri fibroblastlar daha yüksek verimlilik ile yeniden programlayın. Bundan başka, aynı zamanda BOECs translasyonel uygulamalar için uygun olacak herhangi bir teknoloji önemli bir özelliğidir karyotipik anormallikleri, serbest olan iPSCs üretimi için izin verir. Bir hasta bir kan örneği A iPSCs oluşturma yeteneğiLSO böylece yara iyileşmesi bozuklukları, ya çok genç olan hastalardan hücrelerinin üretilmesini kolaylaştıran bir cilt biyopsisi gereksinimini ve cilt fibroblast üretimini ortadan kaldırır. Aşağıda ayrıntılı protokol tarafından onaylanan ve Ulusal Araştırma Etik Servis Komitesi (Doğu İngiltere) yönergelerine uygun olarak yapılan, nispeten küçük bir birimden% 90&#39;dan fazla verimlilik BOECs üretimi için basit ve güvenilir bir yöntem (60 sağlar mi), periferal kan. Bu hücreler yüksek proliferatif ve tek bir kan örneğinden hücre yüz milyonlarca üretimi için izin defalarca geçişli olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">For blood collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mL syringe with luer-lok tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19G Surflo Winged Infusion Set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SV-19BL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>StarLab</td>
			<td>E1450</td>
			<td>2 per donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Martindale Pharmaceuticals</td>
			<td>270541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For buffy coat isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile wrapped plastic transfer pipettes</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>KC231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turk&#8217;s Solution</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.093E+09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For cell culture, passaging and freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 1 Collagen (derived from rat tail)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35-4236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02M Acetic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td>prepared in reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Medium-2MV 
			(containing Bullet Kit, but not serum)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>Note: It is essential that the medium does not contain heparin.&#160;&#160; 
			Do not use EGM-2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Trypsin EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>T4174</td>
			<td>Dilute to 1x in PBS prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For flow cytometric characterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD14</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555397</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555445</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: WM59 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti-human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555824</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse anti-human CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560976</td>
			<td>Mouse IgG1k, Clone: HI30 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB357A</td>
			<td>Mouse IgG1, Clone: 89106 
			Dilution: 1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555748</td>
			<td>Clone: MOPC-21 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone: MOPC-21 
			Dilution: 1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1k isotype control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>IC002A 
			Dilution: 1:10</td>
			<td>Clone: 11711</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">For immunofluorescent microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 24-well tissue culture plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB72271</td>
			<td>Clone 756510, IgG1, use at 10 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF938</td>
			<td>Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154193</td>
			<td>Clone EPSISR15, use at 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10042</td>
			<td>Polyclonal,&#160; 2 mg/ml, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>use at 1 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of blood outgrowth endothelial cells from human peripheral blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

Kan 60 ml ince beyaz tabaka mononükleer hücrelerin izolasyonu, tipik olarak 100-150x10 6 toplam beyaz kan hücreleri elde edilir. Tek bir T-75 balonuna kaplanmıştır zaman, çözünen hücre süspansiyonu içinde hücrelerin çok sayıda zor aydınlık mikroskobu kullanılarak tek tek yapışmayan hücreler çözmek için yapar. Tekrarlanan orta değişiklikler yapışmayan hücrelerin temizlenmesi neden olur ve &quot;erken&quot; EPC monositik adherent nüfusun görselleştirme için izin verir. Gün 7 &#39;de, T-75, yaklaşık 7x10 6, bu uzunlamasına yapışan hücrelerin içerecektir. 7 ila 14 günlük itibaren BOECs kolonileri şişesi (Şekil 2A) içinde görünmelidir. Koloniler, ilk olarak 3-5 bitişik hücreleri görünür. Dışsal gelişimi koloni sayısı kan 60 ml başına 1 ila 10 kolonileri arasında değişebilir. Genellikle genç donör (yani 20-25 yaş) aynı zamanda daha önceki kültür görünen akıbet kolonilerinin, daha fazla sayıda üretme eğilimindedir.BOECs birkaç yüz hücrelerden oluşan, dairesel koloniler oluşturmak için hücre, bu merkezi gruptan çoğalır. Bu kolonilerin içinde hücreler klasik endotel Arnavut kaldırımı morfolojisi sergilerler. Onlar koloni başına yaklaşık 1000 hücreler içeren zaman geçit ilk kolonileri tercih edilir. Akıbet koloniler tipik 7 gün kültürde orijinal görünümünü sonra bu büyüklüğe ulaşmak. Kolonisi yeni bir T-75 balon içine geçişli sonra, 5 gün ya da daha az (Şekil 2B) olan bir konfluent tek tabaka (kap başına 3-5x10 6 hücre) oluşturacak şekilde prolifere gerekir. Izolasyonların küçük bir yüzdesi olarak (&lt;% 10), akıbet koloniler görünmesini başarısız ya da bu ilk Pasajlanması adımı takip yeterince prolifere yok. Ilk Pasajlanması sonra düşük çoğalmasını sergileyen BOECs nadiren kararlı BOEC izolasyonlar olmak ve sık sık iki ya da üç pasajlar içinde çoğalan durdurmak için gidin. MonositikBOEC kültürleri içinde bulunan ilk EPC proliferatif olmayan ve tipik olarak 1-2 kanallarda kültürlerden temizlenir. Bu erken hücrelerin Gümrükleme hücre ölümüne nedeniyle erken hücrelerin yetersizliği Pasajlanması ve tekrarlanan Pasajlanması olmayan proliferatif erken EPC seyreltme sonra tekrar yapışma. Geçiş 1 hücreler ya kültür içinde pasajlanmağa veya daha sonraki kullanım için aşağı dondurulabilir. Stabil bir yalıtım oluşturulur sonra hücreler kadar latent olmadan önce geçit 8 veya 9&#39;a kadar 3-5 yeni T-75 şişelerinde 1 konfluent bir şişeye bir oranda geçişli olabilir. Yine, hücre yoğunluğu, kültür boyunca önemlidir. Deneyimlerimize göre, herhangi bir daha az 750,000 daha hücre büyümesi durmalarına neden olabilir daha düşük hücre yoğunlukları gibi, T-75 balonuna kaplanmıştır edilmelidir. BOECs yüksek proliferatif potansiyele rağmen, hücreler de overconfluent haline gelmesine izin verilmemelidir (örn.,&gt; Şişeye başına 5x10 6 hücre) Bu oturumlar neden olabilir<html> Bir non-proliferatif fenotipe BOECs iyon. Biz BOEC endotel belirteçler için uygun hücre yüzeyi ve hücre içi boyama görüntüler gerektiği gibi herhangi bir hücre etiketli olmak öneriyoruz. BOECs karakterizasyonu tipik endotelial hücre markörleri için işaretlemeden sonra, akış sitometrisi (Şekil 3) ya da floresan mikroskobu (Şekil 4) ile elde edilebilir. BOECs endotel yüzey belirteçleri CD31 ve VEGFR2 için pozitif ve monosit işaretleyici CD14 ve pan-lökosit işaretleyici CD45 için negatiftir. BOECs ayrıca Weibel-Palade organları posess ve dolayısıyla ayrık, noktasal sitoplazmik boyanma olarak Von Willebrand Faktör (vWF) ifade eder. Pulmoner arter veya aort endotel hücreleri gibi diğer olgun endotel hücre tipleri, aksine BOECs da yüzeylerinde progenitör ve aktivasyon markeri CD34 ifade eder. ftp_upload / 53384 / 53384fig1.jpg &quot;/&gt; Endotelyal büyüme ortamı içinde, kolajen kaplı plakalar üzerinde Şekil 1. BOEC nesil protokol şematik diyagramıdır. Periferal kan tek-çekirdekli hücreleri, yoğunluk gradyan santrifüjü ile damar kanından izole edilir ve kültürlenmiş FBS tanımlandığı içeren. BOEC koloniler kültür 7-14 gün içinde ortaya çıkar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53384/53384fig2.jpg" /> Şekil temsilcisi BOEC kültürlerin 2. aydınlık görüntüler. (A) akıbet koloniler Arnavut kaldırımı tek tabaka halinde düzenlenmiş ve merkezi bir noktadan radyal dışarı çoğalırlar endotel benzeri hücrelerin, koleksiyonları olarak mevcut günlerde 7 ve 14. Kolonileri arasındaki kültürler görünür. Etraftaki akıbet kolonileri yapışık monoErken kültürlerde hücrelerin büyük çoğunluğunu oluşturan cytic hücreleri. Daha önce açıklanan bu hücreler, &quot;erken&quot; endotel progenitör hücreler, bir iğ şeklinde bir yapıya sahip ve monositik işaretleyici CD14 ifade eder. Non-proliferatif monositik hücreler ölür veya Pasajlanması sonra yeniden takmak için başarısız ya da (B) pasajlayarak ardından, yüksek proliferatif BOECs, kültürler devralacak. Ölçek çubuğu 250μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53384/53384fig3.jpg" /> Şekil akış sitometrisi ile BOECs 3. karakterizasyonu. BOECs tripsinize edilmiş ve spesifik yüzey belirteçleri (kırmızı çizgi) karşı floresan-konjuge izotip kontrol antikorları (dolu zirve gri) ya da antikorları ile boyanmıştır. Sitometrik karakterizasyonu için yüzey belirteçlerihematopoetik belirteçler CD45 ve CD14, endotel belirteçler CD31 ve VEGFR2 ve progentior ve endotel aktivasyon belirteci CD34. dahil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53384/53384fig4.jpg" /> Endotel hücre işaretleyicileri için BOECs Şekil 4. immünofloresan boyama. BOECs bölgesinin Örnek immünofloresan görüntüleri endotel hücre yüzey işaretleyici CD144 karşı antikor (-kaderin, -ve sağ üst panel) ve kan glikoproteini von Willebrand faktörü (vWF, sağ alt panel) immunohistokimyasal . Nükleer DAPI boyama gösteren tekabül eden panelleri solda gösterilir. Ölçek çubuğu 50um. CD144 için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53384/53384fig4large.jpg" target="_blank">bir büyük görmek için tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü.

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood at JoVE.com

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

İnsan çevresel kanından üretilmesi ve kültür Blood üremesi Endotel Hücreleri

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

generation-culture-blood-outgrowth-endothelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Biology

18.8K Görüntüleme.  University of Cambridge. This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

Video: Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

İnsan Kanı StemCell Teknolojileri RosetteSep Kit ile gelen NK Hücreleri zenginleştirilmesi

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

Kan ve Kültür Medya türetilen Exosomes saflaştırılması ve microRNA Profil

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Periferik kan Microvesicles izolasyonu ve özelliklerinin belirlenmesi

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...