Dr Yoder EndGenitor Technologies, Inc için danışman ve Rimedion Technologies, Inc yönetim kurulu üyesidir

Reaktifler ve Çözümleri EMG-2 medya (Lonza, Kat. Cc-3162 EBM-2 bazal, orta ve EGM-2 SingleQuot kiti Takviyeler, ve büyüme faktörleri içeren) EBM-2 (Lonza, Cat No. Cc-3156), tüm SingleQuot kiti takviyesi ve büyüme faktörleri ile desteklenmiş (Lonza, Cat No. Cc-4176), 10% (v / v) sığır cenin serumu (FBS) ve 1% (v / v) penisilin (10.000 U / ml) / streptomisin (10,000 ug / ml) / amfoterisin (25 ug / ml). 4 ° C de 1 ay kadar saklayabilirsiniz Sürece ECFC kültür için kullanılması önerilir EGM-2 cilt, 500 ul / kuyu 24-iyi plakalar, 2 ml / 6-iyi plakaları, 5ml/25-cm 2 matara, ve 10 ml/75-cm 2 matara içindir Aksi protokolü belirtilen. Kollajen Ben çözüm Steril damıtık su 495 ml (0.02 N son konsantrasyon) buzlu asetik asit (17.4N) ile 0,575 ml seyreltilir. 0.22-mikron süpürge ile Steril filtre seyreltik asetik asitUUM filtreleme sistemi. 50 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona seyreltik asetik asit, 25 mg, fare kuyruk kolajeni I ekleyin. Kollajen miktarı kollajen stoku konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir eklendi. 4 ° C de bir ay kadar saklayın Kollajen I-kaplı doku kültür yüzey hazırlanması 6-sıra doku kültürü plakası (/ de 24-iyi plakaları, 3ml/25-cm 2 matara, ve 8 ml/75-cm 2 şişeler için 300 ul kullanın) her iyi kollajen I çözeltisi yerine 1 ml. 37 &#39;de bir gece için 1 saat inkübe ° C. Kollajen Ben çözümü çıkartın ve PBS (6-iyi plakaları, 5ml/25-cm 2 matara, ve 10 ml/75 için ul / kuyu 24-iyi plakalar, 2 ml / 500 kullanan yüzey iki kez, her zaman yıkayın -cm 2 şişe). Hücre kültürleri için hemen tabak kullanın. FACS boyama tamponu Salin (PBS) 2% (v / v) sığır cenin serumu (FBS) eklenmiş fosfat tamponlu. Mağaza u4 az 2 hafta p ° C A. ECFC akıbet, Klonlama ve Genişletme <ol><li> Oda sıcaklığında laboratuvara bir antikoagülan ve ulaşım gibi heparin (10 U heparin / ml kan) veya EDTA ile CB toplayın ve mononükleer hücre (MNC) izolasyonu için hemen (bebeğin teslim 2 saat içinde) sürecini örnek. </li><li> Tablet 15 Her 50 ml konik santrifüj tüpüne CB ml ve karıştırmak için CB ve pipeti birkaç kez her tüp için PBS 20 ml ekleyin. 20 ml bir şırınganın içine 15 ml Ficoll-Paque hazırlayın ve 20G iğne veya karıştırma kanül takın. Seyreltilmiş kan tüpün altında karıştırma kanülün ucu yerleştirin ve dikkatli bir şekilde 15 ml Ficoll-Pague altlık. Yavaşlama fren ayar olmadan, oda sıcaklığında, 740 x g&#39;de tüpler 30 dakika santrifüj edilir. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, Ficoll-Paque ve nispi plazma arasındaki kesişme noktasında bulunan düşük yoğunluklu ÇUŞ&#39;ların puslu katmanı kaldırın. 50 ml konik tüp devam içine ÇUŞ Dağıtma10 ml EGM-2 orta aining. Yüksek bir yavaşlama fren ayarı ile, oda sıcaklığında, 515 x g&#39;de 10 dakika santrifüje ÇUŞ&#39;lar. </li><li> Dikkatlice aspire ve supernatant atın. Iki kez EGM-2 (515 xg&#39;de 10 dk) ile pelet hücreleri yıkayın ve 1.25 x 10 7 hücre / ml EGM-2&#39;de çok uluslu şirketler yeniden askıya. Kollajen hazırlayın 1 ml sıçan kuyruğu kollajen tip I (50 mg / ml) eklenerek başına iyi ve geceleme plaka kuluçkaya I kaplı 6-sıra doku kültürü tabak. Pipetle 4 her oyuğuna Bu MNC süspansiyon 37 ml ve hücreler yerleştirmek ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş. A.1.5) 24 saat sonra (1. gün), yavaş bir pipet yardımıyla kuyudan harcanan orta (gevşek yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin) çıkarın, yavaş yavaş iyi 4 ml EGM-2 ekleyin ve inkübatör için plaka dönüş . Gün 2, yenileme yavaş bir pipet yardımıyla kuyudan orta (gevşek yapışmış olan hücrelerin rahatsız etmeyin) kaldırılması ve 4 ml EGM-2, her kuyuya ekleyerek orta. Orta değişiklik günlük un tekrarlayınGün 7 ve her geçen gün til ECFC koloniler klonlama için görünür sonra kadar. Tipik olarak koloniler günde 5 ve gündüz 14 gün 7 (Şekil 1) arasında görünür. </li><li> Inverted mikroskop kullanarak arnavut morfolojisi ile tipik ECFC koloniler gözünüzde canlandırın (10x büyütme) ve her koloninin konumunu belirtmek için de alt tarafında bir işaretleyici ile koloni sınırları işaretleyin. </li><li> 14. günde, PBS ve klonlama silindir kullanılarak hasat bireysel koloniler ile bu birincil koloniler 2 kez yıkayın ve yeterli silindir içindeki hücreleri kapsayacak şekilde ifade TrypLE. PBS son yıkama aspire sonra, her koloni çevresinde steril jel kaplı klonlama silindir yerleştirin ve steril forseps kullanarak plaka karşı sıkıca bastırın. Silindir içindeki hücrelerin ayırmak alıncaya kadar 3-5 dakika, her klonlama silindir ve inkübe içine sıcak TrypLE ekspres 2-3 damla ekleyin. Silindirin merkezine yaklaşık 250 ul EGM-2 orta ekleyin ve g yukarı ve aşağı pipetlemetek bir hücre süspansiyonu enerate. Tek bir mikro-santrifüj tüpüne ayrı ayrı klonlama tüpten tek hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Kalan tüm hücreleri toplamak ve ilgili mikro-santrifüj tüpüne her silindir gelen yıkama aktarmak için yaklaşık 250 ul EGM-2 orta silindirin içinde 2-3 kez yıkayın. 5 dakika santrifüj masa üzerinde yüksek hızda (≤ 300 xg) olarak hücreleri santrifüjleyin. </li><li> 1.5 ml taze EGM-2 orta süpernatantı ve yeniden askıya hücre pelletini. 500 uL sıçan-kuyruk kolajeni I (50 ug / ml) ile önceden kaplanmış bir 24-kuyucuklu doku kültürü plakası ve her birinin içine tüpten hücre süspansiyonu (bireysel koloniler bütün hücre içeren) aktarılır. </li><li> Medya ile genişleme için inkübatör içindeki yeri her geçen gün yapılan değişir. </li><li> Hücrelerin% 80-90 konfluense yaklaştığınızda, PBS ile hücreleri yıkayın daha sonra 2 kez harcanan aracı kaldırmak ve her kuyuya 500 mikrolitre TrypLE ekspres orta ekleyin24-kuyucuklu doku kültürü plakası. Hücreler kadar yuvarlak ve ayırmak alıncaya kadar 3-5 dakika süreyle inkübatör içinde plakası yerleştirin. Yıkama ile hücreleri toplamak ve 15 ml tüp aktarmak için her kuyuya EGM-2 1 ml (% 10 FBS tanımlanmış olarak) ekleyin. Kalan tüm hücreleri toplamak ve ilgili 15 ml tüp içine her kuyudan yıkama aktarmak için 1 ml EGM-2 orta ile iyi yıkayın. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. </li><li> 1 ml taze EGM-2 orta (% 10 tanımlanan FBS ile) orta çıkarın ve yeniden askıya hücre pelletini. Bir hemasitometre ve tripan mavi dışlama kullanarak Tümbölenin canlı hücre sayısını edinin. </li><li> Hücrelerin tekrar alt-kültüre önce konfluense% 80-90 yaklaşmak kadar medyada her gün değiştirmek ile EGM-2 medya Ben önceden kaplanmış doku kültürü yüzeyler kollajen üzerine yaklaşık 5000 hücre / cm 2 tohumlayarak hücreleri genişletin. </li></ol> ECFCs in vitro Fenotipik Karakterizasyonu B.: Endotel Hücre Yüzey Antijen İfade birklonal Proliferatif Potansiyel d Tek Hücre Testi <ol><li> Endotel hücre yüzey antijeni ifadesi için, ECFC klonlama ve genişleme için açıklanan yöntemleri kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile hücreleri ayırmak. </li><li> FACS boyama tamponu yeniden askıya hücreler (10 X 10 6 hücre / tampon boyama 1ml FACS) sonra FCR engelleme reaktifi (20 ul / 10 X 10 6 hücre) ekleyin, 10 dakika süreyle buz üzerinde nazikçe ve yerde karıştırın. </li><li> Her bir endotel yüzey antijeni ve izotip kontrolleri için mikro-santrifüj tüpündeki bu hücre süspansiyonu kısım 100 ul. . 1 X 10 6 hücre: endotel antijenleri (CD31, CD144, CD146 ve CD105) veya hematopoetik antijenleri (CD45, ve CD14) tanımak ve ışıktan koruyarak 30 dakika boyunca buz üzerinde terk florokrom etiketli insan monoklonal antikorlar uygun miktarda Dikkat ekle her bir test için gerekli değildir. Yazarlar genellikle 10 4 analiz 2 X elde etmek için 0.5 ile 1 X 10 5 hücre / tüp hazırlamakd olaylar. Ayrıca, her bir test için kullanılacak antikor miktarını için Üreticiler tavsiyesini izleyin. Bazı antikorlar uygun antikorun konsantrasyonunu belirlemek için titre gerektirebilir. Yazarlar gerçekleştirdiğinizi Tüm boyama tek renkli boyama vardır. </li><li> Buz üzerinde 30 dakika inkübasyondan sonra, 5 dakika süre ile, bir tezgah üstü santrifüj üzerinde yüksek hızda santrifüj tüpünün her biri daha sonra süpernatan kaldırmak ve FACS tampon içinde tekrar askıya hücre peleti. </li><li> Her bir antijen için olumlu veya olumsuz leke hücrelerin yüzdesi belirlemek için bir akış sitometresinde örnekleri analiz edin. ECFCs CD31, CD144 ve CD146 için eşit pozitif leke, ancak CD45 ve CD14 negatif ilgili izotip kontrollere göre. </li><li> Klonal bir proliferatif potansiyelini incelemek için tek bir hücre deneyi için, ECFC klonlama ve genişlemesi için tanımlanmış benzer yöntemler kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile erken geçişi (2-3) hücreleri ayırır. </li><li> Bu hücreleri enfektegelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) Lentivirüs 16 ifade ve floresan sitometri ile EGFP ifade hücreleri toplamak Dikkat:. lentivirüs çalışma ise çeker ve tüm biyo-güvenlik önlemlerine uyulmalıdır kabul edilir. </li><li> Kültür onları ECFC genişleme bölümünde kültür ECFC için nitelendirdi. </li><li> 50 ul sıçan kuyruğu kollajen tip I (50 mcg / ml) başına da ekleyerek Kolajen I kaplı 96-tabak hazırlayın ve geceleme plaka inkübe. TrypLE ifade kullanarak EGFP + ECFCs toplayın ve son konsantrasyonu ~ 10 6 hücre / ml ile EGM-2 orta onları tekrar süspansiyon. </li><li> Tek EGFP + ECFC başına iyi bir 96-plaka sıralamak ve EGM-2 ile başına iyi 200 ul nihai ses seviyesini ayarlamak için 20 hücre / saniyenin düşük debi ile FACS Vantage (Becton Dickson) veya diğer benzer sıralayıcı kullanın. Her iyi yalnızca bir hücre aldığınızdan emin olmak için ters bir floresan mikroskop kullanın. Alternatively, tek hücre FSC ve SSC ve koloniler hücre puanlama ve miktar tayini için kullanılan boyama Sytox nükleer boya göre sıralanabilir. </li><li> 5. gün ve 10. günde yapılan iki ortam değişiklikleri (200 ul EGM-2 ile çok kanallı pipetter) ile iki haftalık bir süre içinde plaka inkübe edin. Kültür 14. günde, 30 dakika için% 4 paraformaldehit 100 ul sahip hücrelerin sabitleme önce 100 ul PBS ile birlikte, her sıra yıkanır. EGFP ifade değildir ECFCs için, 4 ° C&#39;da paraformaldehit fiksasyon ve inkübe ardından Sytox reaktifi, yeşil floresan nükleer boya ekleyin. </li><li> 14 gün kültüre tek bir hücreden genişletilmiş endotel hücrelerinin sayısı ölçmek için, her sıra incelemek için flöresanlı bir mikroskop kullanabilir. Kantitatif analiz için, skoru pozitif olarak 2 veya daha fazla endotel hücreleri (silahlanma) ile kuyu ve floresan mikroskop ile görsel sayım toplam endotel hücre sayımı için onları biraz daha inceleyin. </li><li> T görüntülemek için2, 50, 51-2000, ve 2001 veya daha fazla olarak kabul edilir: O bir endotel hücre sayısı ile veri, kuyular elde edilen endotel hücre kümeleri, düşük proliferatif potansiyel (LPP)-ECFCs ve yüksek proliferatif potansiyel (HES) - sırasıyla ECFCs. ECFCs 14 gün boyunca tek bir hücre düzeyinde kültüre zaman endotel kümeleri, LPPS ve hidroelektrik santrallerde yol vererek klonal bir proliferatif potansiyeli tam hiyerarşisi sergilerler. 7 </li></ol> In vivo Gemi Oluşumu deneyi vaskülojenez için ECFC Potansiyeli inceleyin: ECFCs in vivo Fonksiyonel Karakterizasyonu C. <ol><li> FBS (10: 1 ml jel (ki daha sonra 2 implantlar oluşturmak üzere ikiye edilecektir) döküm için gerekli Aşağıdaki jel malzeme her birinin toplam hacmi (ml) (parantez içinde nihai konsantrasyon) ile hesaplayarak cellularized jel implantlar hazırlamak %), 2-EBM 10:01 (1 ml nihai hacme ayarlamak), sodyum bikarbonat (1.5 mg / ml), NaOH (7.4 pH ayarlama), HEPES (25 mM), fibronectin (100 ug / ml) ve kollajen I (1.5 mg / ml). </li><li> Jel malzeme hesaplama sonra, ECFC klonlama ve genişlemesi için tanımlanmış benzer yöntemler kullanarak hücreleri toplamak için TrypLE ifade ile hücreleri ayırmak. Bir hemasitometre ve tripan mavi kullanarak bir kısım bir canlı hücre sayısını edinin. Bir 50 ml-konik bir tüp ve pellet 515 x g, oda sıcaklığında, santrifüj yoluyla hücre içine 2.400.000 yaşayabilir hücrelerin transfer edin. Aynı zamanda, bir buz 50 ml konik tüp (listelendikleri aynı sırayla) hesaplanan HEPES hacimleri, sodyum bikarbonat, EBM-2 10:1, FBS, fibronektin ve kollajen ekleyerek jel matris solüsyon hazırlanır. İyice karıştırın ve buz üzerinde çözüm tutarken NaOH ile 7.4 &#39;e pH ayarlayın. </li><li> Santrifüjlemeden sonra hücreler arası Süpernatant atılır ve 360 ​​ul sıcak EGM-2 içinde tekrar askıya pelet ve buna pH jel implant 1 ml nihai hacme verme, jel matris solüsyon 840 ul ayarlanabilir eklemek. Kadar yavaş yavaş jel matris çözüm içine hücreleri karıştırınhücreleri iyice jeli çözeltisi içinde süspanse edilmektedir. </li><li> 12 iyi doku kültürü plakası ve 20-30 dakika süreyle inkübe jel polimerize kadar iyi biri bu 1 ml cellularized jel süspansiyon aktarın. Yavaşça 2 ml ılık EGM-2 ile jel kapağı ve bir gece inkübe edin. </li><li> Hemen implantasyon öncesi, iris makası kullanarak iki eşit parçaya gecede İnkübe jel ikiye ayırmak ve iyi EGM-2 içeren ortamda aynı kültüre jel adet döner. </li><li> Izoflurandan idare tarafından (5-6 haftalık NOD / SCID farelerinde) oturaklı hayvana hayvan cerrahi tesisi kullanın. Karnın alt kısmı Tıraş ve iyice alkol pedleri ve betadin veya diğer antiseptik ile cerrahi alan temizleyin. Sonra IACUC ve kurumsal düzenlemeler uyarınca perdeler alanı izole. </li><li> Deri ve karın kas arasındaki subkutan boşluk açığa karın alt kadranda yaklaşık 5 mm kesi yapmak için steril keskin iris makası kullanarak. Üst kadranda içine üstün giden 15-20 mm genişliğinde cep oluşturmak için karın kas deri katmanı sayesinde küt diseksiyon gerçekleştirin. Aynı fare karnın başka bir tarafı da benzer açık cep oluşturmak için benzer işlemi tekrarlayın. </li><li> Insizyon sadece kaudal dermal tabaka kaldırarak karın cebinden başka bir tarafı içine bir yarısı karın cebinden bir tarafı haline jel parçası ve jel bir yarım parça takın. </li><li> Jellerin yerleştirildikten sonra, bir kesim iğne 5-0 polipropilen sütür ile 2-3 dikiş ile her kesi kapatın. Uygun kafes kartları etiketlemek ve kurumsal ve protokol ihtiyaçlarına göre ameliyat sonrası izleme ve analjezi gerçekleştirmek ve bu implante jel hücreleri için 14 gün de novo damar oluşturmasını sağlar. </li><li> Son olarak, jel implantları hasadı genellikle fare euthanizing 14 gün sonra implantasyon sonra gerçekleştirilir. </li><li> Swab karın alkol ped ile alanı veorijinal kesi hattı kaudal karın cildi kesilir. Dikkatle, jel olası konum cilt kaudal bir flep eksize tarafından implantı incelemek. Sonra jel çevresinde çevresel çinko sabitleştirici yer (BD Biosciences, en iyi sonuçlar için üretici firmanın tavsiye izleyin) kesme ve oda sıcaklığında 1-2 saat düzeltmek için izin ile Özel Tüketim implant. </li><li> Histokimyasal standart protokolleri kullanarak parafine gömülü jeller hazırlayın ve hematoksilen ve eosin, jel içinde damarlarda görselleştirmek için anti-insan CD31 ya da anti-fare CD31 ile boyama gerçekleştirmek için cam slaytlar üzerinde 5 mm kesitler hazırlamak. ECFCs humanize gemileri üretmek için de novo vaskülojenez tabi cellularized jel implantlar 14 gün 4,8,11 için immün farelere içine yerleştirilir. </li></ol> D. Örnek Sonuçlar Birincil koloni formun bu ECFC türetme tekniği kullanarak Gözlemlediğimiz dışı büyüme5. gün (Şekil 1) gibi erken ation. Dışarı-büyüme ECFC koloniler tipik arnavut görünüm sergilendi ve klonlama tarafından koloni alma sonrası uzun dönemde genişlemesi üzerine,&gt; 40 nüfus çiftlenmeler doğurdu. Genişletilmiş koloniler endotelyal antijenleri ifade, ama (Şekil 2) hematopoetik antijenleri ifade vermedi. Önemlisi, bir tek hücre düzeyinde (Şekil 3) klonal bir proliferatif potansiyeli tam bir hiyerarşisi görüntülenir. Dahası, ECFCs immün fareler 4, 6, 8, 11 (Şekil 4) içine yerleştirildi zaman ana eritrositler ile perfüze edilmiştir hümanize kan damarlarının oluşmuştur. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3872/3872fig1.jpg" /> Şekil 1.. Endotel koloninin kordon kanı ve akıbet gelen mononükleer hücrelerinin izolasyonu (ÇUŞ) kordon kanı hücrelerinin Ficoll-Pague yoğunluk gradiyenti ayrılması sırasında kültürlü ÇUŞ. ÇUŞ formu buffy tabaka tabaka hücreleri (ECFCs) oluşturan. Sıçan kuyruğu kollajen kültür üzerindeki çok uluslu şirketler için buffy coat tabakasının Yalnızlık 5 ila 14 gün içinde ECFC koloninin akıbet kaplamalı plakalar sonuçları. Outgrowth ECFC koloni (ok başları ile gösterilir) arnavut morfolojisi 7 görüntülenir. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3872/3872fig2.jpg" /> Şekil 2. Endotelyal ve hematopoetik hücre yüzey antijeni ifade vitro Temsilcisi fenotipik değerlendirmesi. Immünofeotipleme kordon kanından alınan ECFCs arasında ECFCs endotelyal antijenleri CD31, CD34, CD144, CD146, Flt-1, FLK-1, Flt-4 ve NRP2 ifade ama ortaya hematopoetik antijenler CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 veya AC133 7, 8 ifade vermedi. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3872/3872fig3.jpg" /> Şekil 3. Clonogenic ve CB elde ECFCs proliferatif potansiyel in vitro ölçümde Temsilcisi. (A) kordon kanıKaynaklı ECFCs&gt; 2001 koloniler kadar 2-50 hücre kümeleri arasında değişen koloniler bir hiyerarşi ile klonal bir proliferatif potansiyeli gösterilecek. (B) koloniler (koloniler Sytox, daha kaliteli fotoğraf çekmek için yeşil floresan nükleer boya ile boyandı) hiyerarşisi Mikrografikleridir sonra elde edilen kordon kanı kaynaklı ECFCs 14 gün boyunca bir tek hücre düzeyinde kültüre edildi. Ölçek çubuğu 100μm 7, 8 temsil eder. <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3872/3872fig4.jpg" /> Şekil 4. Kordon kanından alınan ECFCs in vivo fonksiyonel karakterizasyonu Temsilcisi. Kord A) H &amp; E boyama kan kaynaklı cellularized jel implantları içeren ECFC mikrodamar (ana eritrositler ile dolu) implantasyonu 14 gün sonra kolajen-fibronektin jel oluşumu göstermiştir. B) Anti-insan CD31 boyama (kahverengi leke) daha bu gemilerin insan kaynaklı onaylar.

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473, 298-307 (2011).</li><li>Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+putative+progenitor+endothelial+cells+for+angiogenesis.">Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.</a> Science. 275, 964-967 (1997).</li><li>Urbich, C., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells:+characterization+and+role+in+vascular+biology.">Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology.</a> Circ. Res. 95, 343-353 (2004).</li><li>Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+and+defining+cells+to+engineer+human+blood+vessels.">Isolating and defining cells to engineer human blood vessels.</a> Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).</li><li>Matthias, M., David, N., Josef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+bench+to+bedside:+what+physicians+need+to+know+about+endothelial+progenitor+cells.">From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells.</a> Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).</li><li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel+wall-derived+endothelial+cells+rapidly+proliferate+because+they+contain+a+complete+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells.">Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells.</a> Blood. 105, 2783-276 (2005).</li><li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li><li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Animal+Serum+Free+Expansion+of+Human+Umbilical+Cord+Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+(MSCs)+and+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells+(ECFCs.">Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs.</a> J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).</li><li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels.">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-135 (2008).</li><li>Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+matrix+physical+properties+modulate+endothelial+colony+forming+cell-derived+vessels+in+vivo.">Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo.</a> Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ. Res. 103, 194-202 (2008).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li><li>Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Large+Scale+Expansion+of+Adult+Human+Endothelial+Colony+Forming+Progenitor+Cells.">Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells.</a> J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Witting, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Large+Volume+Lentiviral+Vector+Production+Using+Flow+Electroporation.">Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation.</a> Hum. Gene. Ther. , (2011).</li><li>Yoon, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+neovascularization+by+mixed+transplantation+of+early+endothelial+progenitor+cells+and+late+outgrowth+endothelial+cells:+the+role+of+angiogenic+cytokines+and+matrix+metalloproteinases.">Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases.</a> Circulation. , 112-1618 (2005).</li><li>Dubois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+progenitor+cell+populations+on+left+ventricular+remodeling+and+myocardial+neovascularization+after+myocardial+infarction.">Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).</li><li>Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outgrowth+endothelial+cells:+characterization+and+their+potential+for+reversing+ischemic+retinopathy.">Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Endotelyal progenitör hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu klonal ve seri olarak yeniden kaplama kültüründe yeteneğine sahip iyi niyetli ECFCs belirlemek ve in vivo olarak dayanıklı ve fonksiyonel implante kan damarlarının neden önemlidir. İnsan göbek kordon kanı ECFCs ve yaşlanma veya hastalık 10 ile bu dolaşımdaki hücrelerin düşüşler konsantrasyonu ile zenginleştirilmiştir. Son çalışmalar ECFC damar yaralanması, miyokard enfarktüsü veya retino...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Heparin Sodyum Enjeksiyon, USP </td><td> APP İlaç </td><td> 504031 </td></tr><tr><td> Ficoll-Pague </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> Karıştırma kanül </td><td> Maersk Tıp </td><td> 500.11.012 </td></tr><tr><td> EGM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td></tr><tr><td> Tanımlı FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> TrypLE ekspres </td><td> Gibco </td><td> 12605 </td></tr><tr><td> Sıçan tip I kollajen </td><td> BD Biosciences </td><td> 354236 </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 356234 </td></tr><tr><td> FCR Blok </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-059-901 </td></tr><tr><td> hCD31, FITC conjugated </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555445 </td></tr><tr><td> hCD45, FITC konjuge </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555482 </td></tr><tr><td> konjuge hCD14, FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555397 </td></tr><tr><td> hCD144, PE konjuge </td><td> eBioscience </td><td> 12-1449-80 </td></tr><tr><td> hCD146, PE konjuge </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td></tr><tr><td> hCD105, PE konjuge </td><td> Invitrogen </td><td> MHCD10504 </td></tr><tr><td> Ms IgG 1, k antikor, konjuge FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555748 </td></tr><tr><td> Ms IgG 1, k antikor, konjuge PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559320 </td></tr><tr><td> Ms IgG 2a, k antikor, konjuge FITC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555573 </td></tr><tr><td> Anti-insan CD31 </td><td> Dako </td><td> clone JC70 / A </td></tr><tr><td> Anti-mouse CD31 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553370 </td></tr><tr><td> 0.22-mikron vakum filtrasyon sistemi </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Glasiyal asetik asit, 17.4N </td><td> Balıkçı </td><td> A38-500 </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Fetal bovin serumu (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td></tr><tr><td> IHC Çinko Sabitleme </td><td> BD Biosciences </td><td> 550523 </td></tr><tr><td> Sytox yeşil reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> S33025 </td></tr><tr><td> Steril Klonlama silindir, </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-907-10 </td></tr></tbody></table>

phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood

Anjiogenez, vaskülojenez ve arteriogenesis ile yeni kan damarları oluşumu uzun süredir kez son 1 gözden geçirilmiştir. Endotel progenitör hücreler (EPC) dolaşımdaki varlığı ilk Asahara ve arkadaşları tarafından yetişkin insan periferik kan tespit edilmiştir. 1997 2 vasküler yenilenme ve onarım için yeni hipotezler ve stratejilerin bir infüzyon getirmekte. EPC dolaşan kan nadir fakat normal bileşeni olduğu kan damarları oluşumu ya da vasküler yeniden şekillenme sitelerine ev ve hücreler 3 elde mevcut damar duvarının parakrin stimülasyon ile büyük ölçüde ya da doğum sonrası vaskülojenez, anjiyogenez veya arteriogenesis kolaylaştırmak. EPC tanımlamak için spesifik bir belirteç tespit ve alanın şu anda devlet proanjiyogenik hematopoetik kök ve progenitör hücreler dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri anlamak, anjiogenik hücreleri, Tie2 + monosit, miyeloid progenitör cel dolaşan edilmiştirLs, tümör ilişkili makrofajlar, M2 ve aktive makrofajlar klinik öncesi hayvan modeli sistemlerinin çeşitli hastalık durumları ve çok sayıda 4, 5 in insan denekler içinde anjiyojenik işlemi uyararak katılabilir. Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli, replating üzerine yeteneğini oluşturan ikincil ve üçüncül koloni ve bağışık yetmezliği olan farelere 6-8 içine nakli üzerine in vivo damarlarda intrinsik kurma yeteneği ile karakterize nadir dolaşan canlı endotel hücreleri vardır. ECFCs başarıyla sağlıklı erişkin birey, sağlıklı doğan bebeklerin göbek kordon kanı (CB), ve çok sayıda insan arteriyel ve venöz damarların 6-9 damar duvarının periferik kandan izole olmuş, CB ECFCs 7 en yüksek frekans sahip olduğu ekran en sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli ve in vivo 8, 10-13 form dayanıklı ve fonksiyonel kan damarları. Iken derivasyonErişkin periferik kandan ECFC burada derivasyon için yöntemler tarif, 14, 15 sunulmuştur, klonlama, genişleme, ve in vitro hem de insan umbilikal CB ECFCs in vivo karakterizasyonu gibi.

Watch this Scientific Journal Video about Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood at JoVE.com

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) intrensek göstermeyen sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli olan endotel hücreleri dolaşıyor<em&gt; In vivo</em&gt; Gemi yeteneği oluşturulması. CB türetilen outgrowth endotelyal hücreler fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu tanımlamak ve izole etmek için önemlidir<emNiyetli&gt; bona</em&gt; Hasarlı dokuların tamiri ve potansiyel klinik uygulama için ECFCs.

Endotel Colony Forming Hücrelerinin Fenotipik ve Fonksiyonel Karakterizasyonu İnsan Göbek Kordonu Kanı türetilen

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

phenotypic-functional-characterization-endothelial-colony-forming

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K Görüntüleme.  Indiana University School of Medicine. Endotel koloni oluşturan hücreleri (ECFCs) intrensek göstermeyen sağlam klonal bir proliferatif potansiyeli olan endotel hücreleri dolaşıyor In vivo Gemi yeteneği oluşturulması. CB türetilen outgrowth endotelyal hücreler fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu tanımlamak ve izole etmek için önemlidir bona Hasarlı dokuların tamiri ve potansiyel klinik uygulama için ECFCs.

Video: Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biyoloji

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

İnsan Göbek kordonu İzolasyon ve Hayvan Serum Genişleme Mezenkimal stromal hücreler (MKH) ve endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler (ECFCs) Türetilmiş

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...