The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Econom&#236;a y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).

Bitki Materyali 1. Çapraz (1 saat) <ol><li> Arabidopsis deneyi kullanılan satırları büyütün (- WT - yabani tip mutantlar karşı, ve / veya etiket ifade çizgilerin karşı ilgi protein etiketli sürümünü ifade çizgileri herhangi proteine ​​erimiş değil) büyük Petri kapları üzerinde 12-18 gün (150 mm), MS-agar ortamı (1 L: 1x Murashige &amp; Skoog tuzlan, 10 g sakroz, 0.5 g MES, pH 5.7 (KOH),% 1 agar) ile. Toprak ve vermikülit 1 karışımı: Alternatif olarak, 3 içeren tencere üzerinde bitkiler büyümek. DİKKAT! Formaldehit, cilt ile temasında ve yutulduğunda, inhalasyon yoluyla toksik ve uygun kişisel koruyucu donanımları giyen bir kimyasal kaputu ele alınmalıdır. 1.2 Adımları - 1.6 davlumbaz altında yapılmalıdır. </li><li> Bir laboratuvar brülör ısıtmalı iğne ile 50 ml tüpler kapağındaki küçük delikler yapın. % 1 bir son konsantrasyona 1x PBS 40 mi tampon ekleme ve formaldehitin 1,08 mi (stok 37% szüm). Bu 50 ml tüpler içinde bitki maddesinin 1.5 g toplayın. Çapraz bağlama sırasında buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Kapaklı 50 ml tüpler kapatın. Bir kurutucuda tüpleri yerleştirin ve vakum uygulanır. Vakum daha sonra, 10 dakika boyunca doku infiltrasyonu solüsyonu çalkalama önlemek için dikkatli bir şekilde vakum bırakın. Örneği karıştırın. İki kez tekrarlayın. Infiltrasyon sonra, bitki materyali gözlemlemek ve biraz saydam hale teyit ve tüp (Şekil 2) dibine batmaya eğilimindedir. </li><li> 5 dakika boyunca vakum uygula 0.125 M bir son konsantrasyon elde etmek için 2 M Glisin 2,5 ml ilave edilir. Glisin formaldehid çapraz bağlanma yarışmalı bir inhibitörü olarak görev yapar. </li><li> Kapaktaki delikleri kapalı 50 ml tüp tersini PBS formaldehit-glisin çözüm atın. </li><li> Aşama 1.5&#39;de tarif edildiği gibi, su ile yıkama çözeltisi atılması ile iki kez 1 x PBS ile ve bir kez küçük bitkileri durulayın. Bir kağıt havlu üzerinde kurutun ve sıvı nitroge dondurman. Not: Dondurulmuş doku hafta içinde -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> Antikorların 2. Hazırlık (1 gün) NOT: İmmünopresipitasyon için, bir protein ya da protein G, antikor ağır zincirinin sabit alanı için yüksek afinitesi olan bir bağlayıcı ile antikorlar ile konjuge manyetik boncuk kullanılması tavsiye edilir. DNA-protein kompleksleri, boncuklar-antikor konjugatları yüzeyine spesifik olmayan eklenebilir. Bu nedenle, bu spesifik olmayan bağlanma arka ölçmek için spesifik antikorlar olmayan kontroller gerçekleştirmek için gereklidir. <ol><li> Her bir immüno-çökeltme için, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde manyetik boncuk 15 ul hazırlar. Boncuk tanelerin miktarının, immüno-çökeltme ve ayrıca antikorlar üzerinde kullanılır kromatin miktarına bağlıdır. </li><li> Tu kordonlara Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) seyreltme tamponu 1 ml ilave dönmesiyle karıştırın ve 1.5 mL bir mikrosantrfuj koyun yıkamakManyetik bir raf olması. Boncuklar mıknatıs eklemek izin yaklaşık 1 dakika bekleyin. Rafa hala 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler ile pipetleme süpernatant kaldırmak. İki kez tekrarlayın. Not: boncuk ve antikor (Ab) ve bir ikinci antikor, sadece herhangi bir manyetik boncuk (No-Ab) kontrolü ile bir: İki immüno setleri ihtiyaç vardır her bitki soyundan için. </li><li> ChIP seyreltme tamponu 200 ul boncuk tekrar. (Tam seyreltme her Ab için farklıdır ve deneysel olarak optimize edilmesi gereken ya da ticari antikorların durumunda, üretici talimatları takip) her bitki soyundan hazırlanan iki tüpün birine özgü Ab gerekli miktarını ekleyin. Immunoprecipitation için bu örneği kullanın. Negatif kontrol olarak kullanılacak diğer bir tüp için spesifik IgG miktarını kullanın. </li><li> Antikor boncuk eklemek izin 4 ° C&#39;de dönen bir tekerlek üzerinde O / N inkübe edin. </li></ol> 3. Kromatin Ekstraksiyon (4 saat) </p&gt; <ol><li> Toz homojen ve hafif yeşil bir hale gelene kadar havan ve tokmak kullanılarak iyice sıvı azot içinde dondurulmuş bitki materyali öğütün. Yeni 50 ml tüp toz aktarın. </li><li> Davlumbaz altında 3.6, iş - adımların 3.2. Ekstraksiyon tamponu 1 30 ml (EXB 1) ekleyin ve doku tozu emmek için iyice karıştırın. Bu adımından, sürekli 4 ° C&#39;de örnekleri tutmak. Dondurulmuş doku ve sıvı azot kalanlar tamponu donmasına neden olur. Tüpleri 4-5 kez, her 2 dk tersini tamamen donmuş doku çözülme emin olun. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de, yeni bir 50 ml tüp ve santrifüj içine 22-25 um gözenek boyutuna sahip olan bir filtre doku içinde geçirilerek bulamaç temizleyin. Not: Bu adımda, çekirdekler ve tüm organellerin pelet olacaktır. EXB 1 yüksek yoğunluklu sağlamak ve organel yapısı aksamaması için yeterli sakaroz içerir. </li><li> Yavaşça dekantasyon yoluyla süpernatant kaldırmak. Bu sta atge, yaklaşık 2 ml yeşil pelet gözlemlemek. </li><li> EXB 5 ml pelletini pellet 2. Tekrar süspansiyona, bu noktada zor olacaktır. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin. NOT: EXB 2% 1 Triton X-100, açık kloroplastları daldı ve klorofil kaldırmak yardımcı içerir. </li><li> Ekstraksiyon Tampon 3 (EXB 3) 300 ul pelletini. </li><li> Temiz mikrofuge&#39;de tüp içinde, EXB 3. 600 ul adım 3.6 den yeniden süspanse pelet alın ve dikkatli bir şekilde temiz EXB 3 üstüne onu katman ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de 16,000 x g&#39;de 1 saat boyunca spin. NOT: Bu adım örnek deterjan çıkarmadan yardımcı olur. </li><li> Bir pipet ile aspire süpernatantı. Yavaş yavaş Sonication verimliliğini etkileyebilecek olan kabarcık oluşumunu önlemek için yukarı ve aşağı pipetleme sonication tampon 300 ul nükleer pelletini. Dikkatle tüm süspansiyon dışarı pipet ve temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp transfer. NOT: BuTampon çekirdekleri parçalanması ve kromatin serbest bırakmak için, SDS içerir. </li><li> Çekirdekleri parçalanması ve rastgele küçük parçalara kromatin makaslama süspansiyon sonikasyon. (Malzemeleri / reaktiflerin Tablo l&#39;de tarif edilen uygun sonikasyon cihaz için 4 ° C sıcaklıkta 30 sn ayarlar AÇIK / KAPALI 30 saniye 20-30 döngü) 200-800 bp arasındaki parçalar halinde zenginleştirilmiş kromatin oluşturmak sonikasyon koşullarını kullanarak. Sonike kromatin 2 ul (Şekil 3) yüklenmesi, bir agaroz jeli 13 elde edilen DNA fragmanlarının elektroforetik ayrılmasıyla sonikasyon kontrol edilmesi. DİKKAT! Ultrason cihazı ses geçirmez bir kabin içinde yer almayan durumunda sonication adımı sırasında kulak koruyucu ekipman giymek emin olun. Önemli adım! Kromatin parçalanma ölçüde sonication donanımına bağlıdır. Sonikasyon koşulları uygun DNA boyutlarda zenginleştirme elde etmek için ayarlanmalıdır. GörmekKromatin parçalanma nasıl optimize bir örnek için Şekil 3. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 12.000 x g&#39;de çözeltinin bir kez dönerler. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp pipetleme süpernatant aktarın. Pelet atın. Yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant 1/10 atın -20 ° C&#39;de Giriş ve dondurularak olarak işaretleyin. </li><li> % 0.1 son konsantrasyona SDS seyreltilmesi için fiş seyreltme tampon çözeltisi ile kromatin 10x seyreltin. Not: Örnekler dondurulmuş ve birkaç hafta -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> İlgi Protein ve DNA Rescue 4. immünopresipitasyonu (1 gün, 3 saat) <ol><li> Aşama 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi, antikorun fazlasının ayrılması için fiş seyreltme tamponu 1 ml aşama 2,4 üç kez Ab ile kaplanmış boncuk yıkayın. ChIP seyreltme tamponu 200 ul içinde süspanse. İzole kromatin 50 ul ekleyin. 4 ° C&#39;de dönen bir tekerlek üzerinde O / N inkübe edin. NOT: dikkat yoğunluğu kontrolmicrovolume UV-Vis spektrofotometre içinde kromatin üzerinde. İzole kromatin 50 ul DNA fazla 10 ug içermelidir. </li><li> 4 ° C adımlar 4,2-4,5 işler için. Aşama 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi Düşük Tuz yıkama tamponu 1 ml iki kez boncuk yıkayın. </li><li> Yüksek tuz yıkama tamponu 1 ml kez boncuk yıkayın. </li><li> LiCİ Yıkama tamponu 1 ml kez boncuk yıkayın. </li><li> TE tamponu 1 ml iki kez boncuk yıkayın. Son yıkamadan sonra, tam bir pipet ile aspirasyon yoluyla tüp içinde sol TE tampon kaldırmak için emin olun. </li><li> GİRİŞ örnekleri (adım 3.9) çıkartın. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Transfer INPUT 5 ul ve ChIP örnekleri ile olduğu gibi devam ediyor. % 5 kenetleme iyon değişim reçinesi 200 ul ekleyerek çapraz bağlantıyı ters döndürecek ve her 2-3 dakikada çalkalama 95 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. 30 saniye için 16,000 xg&#39;de Spin ve dikkatli bir şekilde pipetle yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine süpernatant aktarın. NOT: tra ikenters çapraz bağlamak için ditional metod, bu sebepten, bir protokolü gün daha kısa hale etkin decrosslinking ve 10 dakika DNA&#39;nın elüsyonu sağlar NaCI, 95 ° C de bir kenetleme iyon reçinesi ile kuluçkalama ile O / N inkübasyon içerir. </li><li> Proteinaz K 2 ul (10 mg / ml) ilave edin ve 30 dakika proteinleri sindirimi ve DNA serbest bırakmak için 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> Hızla 30 saniye boyunca 16.000 xg&#39;de spin ve pipetleme yeni bir tüp süpernatantı aktarın. </li><li> DNA, standart DNA fragmanları saflaştırma kiti kullanılarak izole temizleyin. NOT: Üreticinin talimatlarına göre hareket edin. </li><li> Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp kiti DNA bağlanma sütun aktarın. Sütunun merkezine DNase içermeyen su 20 ul ilave edilmesi ve 60 saniye boyunca 16,000 x g&#39;de eğirme ile saflaştırılmıştır DNA Zehir. Nokta durdurma: Örnekler birkaç hafta -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol&gt; 5. qPCR immünopresipitasyona DNA&#39;daki Siteleri Bağlama Bolluk Ölçme (4 saat) Not: Çökelen kromatin izole edilmiş DNA birleşmesinden oluşan ilgilenilen proteine ​​bağlanması ile toplam kromatin yonga-ed edilmiş olan DNA fragmanları belirlemek için analiz edilmesi yer alır. <ol><li> 60 ° C&#39;lik bir erime sıcaklığı (Tm) ve% 30 -80% bir GC içeriğine sahip ilgili genomik bölgelere tasarım primerleri. Kromatin sonikasyon ile parçalanır olarak, amplifiye edilen dizideki uzunluğu 150-200 nükleotidleri (Tablo 1) daha uzun olmamalıdır. NOT: Primer tasarımı için yararlı bir araç Primer 3 program (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Primer tasarımı için ek kurallar 14,15, önceki raporlarda 8 mevcuttur. </li><li> Primerlerin özgü olduğundan emin olmak için bir patlama programı kullanın (özellikle destekleyiciler dizilerinin bağlama benzer TF paylaşabilirsiniz) ve astar verimliliği usin testig giriş DNA (adım 4.9) suda 01:10 dilüsyonları. Genomun belirli bölgeleri diğerlerinden daha iyi saflaştırılmıştır edilecektir. Bu PCR primerleri tasarlamak ve seyreltilmiş giriş DNA onları kontrol etmek önemlidir. </li><li> Her reaksiyon için bir PCR tüpü içinde su ve pipet ile seyreltilmiş DNA 5 ul saflaştırılmış DNA 1:10 seyreltin. NOT: DNA, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler duvarları ekleyebileceğiniz gibi yalnızca gerektiğinde miktarını seyreltin. Çoklu çözülme-donma döngüleri ekli DNA moleküllerinin sayısını artırmak. Giriş, her primer çifti, büyütme için, Ab-Chip ve Resim-Ab ChIP analiz edilmesi yer alır. </li><li> PCR karışımı tamamlamak için, 1x nihai bir konsantrasyona kadar SYBR Green PCR ana karışımı ekleyin ve her bir primerden 0.5 uM. DNaz içermeyen su ile 20 ul kadar doldurun. </li><li> SYBR Green PCR master mix üreticisinin talimatları takip ederek qPCR reaksiyonu gerçekleştirin. </li></ol> 6. Veri Analizi NOT: ex arasındaChIP-verileri analiz yollarını ğu iki en yaygın kullanılmaktadır. Bunlardan ilki, aynı zamanda &#39;no-antikor kontrole göre&#39; göreceli zenginleşme &#39;,&#39; arka plan üzerinde sinyal &#39;olarak adlandırılan veya kat zenginleştirme yöntemidir. İkinci yöntem &quot;girdi%&quot; olarak adlandırılır. <ol><li> Kat zenginleştirme yöntemiyle veri analizi. <ol><li> QPCR reaksiyonundan sonra elde edilmiştir örnekler isimleri ve ham Ct değerleri ile bir tablo oluşturun. </li><li> Her numune için, ham Ct değerine karşılık gelen hiçbir-Ab kontrolü için elde edilen ham Ct değeri çıkarılır. NOT: Bu matematiksel işlemden sonra, No-Ab numunesi için Ct değeri 0 eşit olur. </li><li> Tabanı 2 ve adım 6.1.2 (Tablo 2) &#39;de elde edilen negatif geri kalanına eşit üs (güç) ile üs işlemiyle kat zenginleşme hesaplayın. zenginleştirme kat = 2 - (Ct (örnek) - Ct (No-Ab)) NOT: Bu metho içinded ChIP-ed numunesinde belirli bir DNA fragmanı bolluğu Resim-Ab kontrol Bu fragmanın bolluk ile karşılaştırılır. Bu yöntemin varsayım plan sinyalinin seviyesinin farklı primer setleri, örnekler ve çoğaltma deneylerde tekrar olmasıdır. Ancak, bu&#39;noise&#39; sinyal seviyeleri primer setleri, örneklerin ve deneyler arasında değişir. </li></ol></li><li> Giriş yöntemi% oranında Veri analizi. <ol><li> Numuneler isimleri ve qPCR reaksiyonundan sonra kendileri için elde edilmiş ham Ct değerleri ile bir tablo oluşturun. </li><li> Bir girdi olarak alınmıştır toplam ekstre kromatin fraksiyonu logaritma tabanı 2 değeri çıkartılarak giriş örnekleri için ham Ct değerlerini ayarlayın. NOT: Toplam kromatin% 10, bu protokolde bir girdi olarak çekildiği gibi çıkarılır değer, 3.32 eşittir Bu protokolde. Log 2 (10) 3.32 eşittir. </li><li> 100 ile b üstel işlem değeri çarpılarak giriş% hesaplayınase 2 ve örnek (Tablo 3) ham Ct değerleri çıkarılır düzeltilmiş giriş değerleri geri kalanı eşit üs (gücü). Girişinin% = 100 * 2 (düzeltilmiş girişi - Ct (örnek)) NOT: Bu prosedür ile toplam izole kromatin (giriş örnek) için ChIP-ed örneğindeki spesifik DNA bolluk arasındaki ilişki hesaplanır. Çip veri analizi ile ilgili daha fazla detay Haring ve arkadaşları. 8 bulunabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Andres, F., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+of+flowering+responses+to+seasonal+cues.">The genetic basis of flowering responses to seasonal cues.</a> Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).</li><li>Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+flowering+by+ambient+temperature.">Control of flowering by ambient temperature.</a> J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).</li><li>Jarillo, J. A., Pi&#241;eiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+is+everything+in+plant+development.+The+central+role+of+floral+repressors.">Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors.</a> Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).</li><li>Pajoro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+(r)evolution+of+gene+regulatory+networks+controlling+Arabidopsis+plant+reproduction:+a+two-decade+history.">The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history.</a> J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).</li><li>He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+regulation+of+flowering.">Chromatin regulation of flowering.</a> Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).</li><li>Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+remodeling+in+plant+development.">Chromatin remodeling in plant development.</a> International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).</li><li>Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+protocol+for+studying+histone+modifications+in+Arabidopsis+plants.">An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).</li><li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11 (2007).</li><li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+(ChIP)+of+plant+transcription+factors+followed+by+sequencing+(ChIP-SEQ)+or+hybridization+to+whole+genome+arrays+(ChIP-CHIP).">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP).</a> Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).</li><li>Gomez-Mena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=early+bolting+in+short+days:+An+Arabidopsis+mutation+that+causes+early+flowering+and+partially+suppresses+the+floral+phenotype+of+leafy.">early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy.</a> Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).</li><li>Pi&#241;eiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EARLY+BOLTING+IN+SHORT+DAYS+is+related+to+chromatin+remodeling+factors+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis+by+repressing+FT.">EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT.</a> Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).</li><li>Lopez-Gonzalez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin-dependent+repression+of+the+Arabidopsis+floral+integrator+genes+involves+plant+specific+PHD-containing+proteins.">Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins.</a> Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+Chain+Reaction:+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies.">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. , e3998 (2012).</li><li>Wong, M. L., Medrano, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+for+mRNA+quantitation.">Real-time PCR for mRNA quantitation.</a> Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).</li><li>Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+formaldehyde+fixation+and+immunoprecipitation+technique+for+studying+protein-DNA+interactions.">A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions.</a> Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).</li><li>Yu, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISTONE+DEACETYLASE6+interacts+with+FLOWERING+LOCUS+D+and+regulates+flowering+in+Arabidopsis.">HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+histone+H3+lysine+9+acetylation+and+dimethylation+in+Arabidopsis+reveals+correlation+between+multiple+histone+marks+and+gene+expression.">Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression.</a> Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).</li><li>Lafos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+H3K27+trimethylation+during+Arabidopsis+differentiation.">Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation.</a> PLoS Genet. 7 (4), e1002040 (2011).</li><li>Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+cells+and+isolation+of+high-quality+RNA+after+cryosectioning.">Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning.</a> Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li><li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3:+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower.">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada açıklanan ChIP protokolü Arabidopsis bitkileri, in vivo proteinler ve özel DNA dizileri arasındaki etkileşimi analiz etmek için tekrarlanabilir ve güçlü bir tekniktir. Ilgi proteinlerin için bağlayıcı siteleri başarılı bir kimlik ilgili etkileşimler aslında yer alıyor bitki organları ya da gelişimsel aşamaları yeterli bir seçim gerektirir. Buna ek olarak, bitki malzemesinin, uygun bir tespit ve sonikasyon ile kromatin optimal kesme elde etmek için kritiktir. Seçilen protein / e...

Son yıllarda, moleküler genetik ve genomik geniş bir araç, model türleri, Arabidopsis thaliana geliştirilmiştir. Bu teknoloji bitki gelişim nasıl düzenlendiğinin anlaşılması muazzam ilerleme kolaylaştırmıştır. Bir model olarak Arabidopsis kullanılarak incelenmiştir gelişim süreçleri arasında, çiçeklenme zamanında genetik kontrolü yaygın analiz edilmiştir. Bu çalışmalar, bitkiler gibi hormonlar ve bitki yaşı gibi endojen uyaranlara yanıt olarak çiçeklenme çok hassas zaman modüle olduğunu göstermiştir ve ayrıca mevsim 1 doğal döngüsü ile vakit çiçekli senkronize gibi fotoperiyot ve sıcaklık gibi çevresel sinyallere, 2. Çiçeklenme zamanında değişiklikler ile Arabidopsis mutantlar ün izolasyonu ve tanımlanması, endojen ve çevresel faktörlere yanıt olarak çiçeklenme süresini düzenleyen genlerin karmaşık bir ağ meydana çıkararak belirleyici olmuştur. Bu genetik devrelerdirÇiçeklenme anahtarları olarak hareket birkaç usta genlerin seviyesinde entegre ve çiçek inisiyasyon tam zamanlama çiçekli teşvik ve çiçek entegratör genlerinin 1,3 yukarısında işe faaliyetlerini bastırmak dengesine bağlıdır. Genomik yaklaşımların son kullanımı ile destekli çiçekli başlama kontrolünde rolü için belirlenen genlerin fonksiyonel karakterizasyonu, çiçeklenme zamanında modülasyonu transkripsiyonel regülasyon merkezi rolünü ortaya koymuştur. Aslında, çiçekli kodlamak transkripsiyon usta genlerin çoğu 4 faktörleri. Buna ek olarak, kromatin remodeling protein komplekslerinin bir dizi çiçeklenme ana genlerin ekspresyonunu etkilemektedir. Gözlemlenmesi, değişen çiçeklenme defa izole Arabidopsis Bir dizi mutantlar kromatin değiştirici çeşitli kodlayan genlerinde mutasyon taşıyan ortaya çıktı. Histon olarak posttranslasyonel modifikasyonlar farklı kromatin remodelerse kuyrukları, DNA&#39;ya göre nükleozom konumlandırmak ya da Arabidopsis&#39;te 5,6 çiçeklenme uygun düzenlenmesi için histon varyantları gerekli kanonik histonları vardır alışverişi. Bu kromatin remodeling aktiviteleri arasında birikmesini veya örneğin belirli histon kalıntılarda asetilasyon veya metilasyon gibi kovalent modifikasyon çıkarılmasını katalizler. Bu histon işaretleri özellikle çiçekli genlerin transkripsiyonel aktivitesini düzenleyen diğer kromatin remodeling kompleksleri, transkripsiyon faktörlerini veya transkripsiyonel makine bileşenleri işe özel etkileyiciler tarafından tanınır. Kromatin immüno-çökeltmesi (chip) in vivo DNA-bağlanma ilgi duyulan proteinler için (Şekil 1) belirlenmesini sağlar. Bu prosedür, DNA çapraz bağlantı belirli kimyasalların yeteneği proteinleri yararlanır. Elde edilen DNA-protein kompleksleri daha sonra özel antikor aga kullanılarak immunopresipite edilebilirinst, transkripsiyon faktörleri, kromatin bağlayıcı proteinler ya da özel bir değişiklik ve heterolog epitopları tercih proteine ​​bağlanmış (genel olarak &quot;etiketi&quot; olarak adlandırılır). Bu İmmüno-saflaştırılmış DNA, ilgi konusu özel dizilerin zenginleşmesine değerlendirmek için kantitatif PCR (qPCR) reaksiyonlarında şablon olarak kullanılabilir. Bu şekilde, transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgeleri ya da belirli genlerdeki histon işaretleri dağılımı 7,8 kurulabilir. Buna ek olarak, masif paralel sıralama sağlayan Yeni Nesil Dizileme (NGS) ile birlikte, ChIP teknoloji transkripsiyon faktörlerinin bağlanma siteleri yanı sıra histon modifikasyonları meydana çıkarıyor Epigenomik manzara genom kimlik mümkün kıldı. Ayrıca, gen ekspresyonunun eşzamanlı analiz transkripsiyonel düzenleyici bağlanması ya da belirli histon bakışı depozisyon transkripsiyonel Activi orantılı olduğunu izlenmesine olanak verirgenlerin 9 ty. Arabidopsiste ChIP protokollerin kullanılması transkripsiyonel düzenleyiciler çeşitli kromatin çiçeklenme usta genlerinin organizasyonu ve nasıl bu yapısal değişiklikler gen ifadesini etkileyen 5,6 üzerindeki etkisini değerlendirmek izin verdi. Önceki sonuçlar KISA GÜN İÇİNDE Arabidopsis odağı ERKEN cIVATALAMA (EBS) bu gen gösterisinde çiçeklenme ve çiçeklenme FT ana geninin upregülasyonu bir ivme çiçeklenme ve mutantlar bir bastıncısı gibi hareket ettiğini gösterdi. Buna ek olarak, FT-kaybı fonksiyonu mutasyonları tamamen FT ebs mutantlar erken çiçeklenme ve EBS 10 çiçeklenme bu ana geninin bastırılması için gerekli olduğu gerekli olduğunu belirten ebs mutant bitkilerin erken çiçek açan fenotip bastırmak 11. EBS özellikle histon H3 di- bağlamak ve inci de trimethylated bir PHD içeren proteinini kodlayanFT 12 kromatin aracılı bastırılması olarak EBS için bir rolü olduğunu düşündürmektedir e lizin 4 Kalıntı (/ 3 H3K4me2). ChIP yaklaşımının kullanılması Arabidopsis PHD içeren protein EBS 10,11 ifadesini 12 bastırmak için çiçek entegratör gen FT düzenleyici bölgeleri bağlar olduğunu göstermiştir. ChIP teknolojisi kullanımı yoluyla elde edilen ek veriler bu proteinin Arabidopsis gelişmenin ilk aşamalarında çiçeklenme bu ana geninin kromatin histon asetilasyon, aktif transkripsiyon bir damgasını düşük seviyelerde, korumak için gerekli olduğunu göstermiştir. Birlikte genetik ve gen ifadesi verileri Bu gözlemler, bu Arabidopsis PHD içeren protein çiçek entegratör geninin FT 12 ifadesini modüle etmek suretiyle çiçeklenme zamanı ince ayar merkezi bir role sahip olduğunu göstermektedir. Burada sunulan çalışma histonlarının analizi için değil, aynı zamanda diğer için değil, sadece yararlı optimize edilmiş bir yöntem sağlarkromatin proteinleri ilişkili ve artan verimlilik ve deneysel süreyi azalttı. Ayrıca, bu rapor ChIP protokollerin kullanımı Arabidopsis çiçeklenme başlangıcı ile ilgili gen ifadesinin kontrolü etkisi bu kromatin aracılı mekanizmalar kromatin modifikasyonları değişiklikler ve bitki genlerinin transkripsiyonel devletler arasındaki ilişkiye yeni anlayışlar sağladı ve nasıl nasıl gösterir.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td>Use under the fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Standard sonication device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01010002 (UCD200TO)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#174; magnetic beads coupled with protein A or protein G</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10003D/10001D</td>
			<td>Check manufacturer&#8217;s manual for antibody affinity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 Surfact-Amps&#8482; Detergent Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mouse, rat, rabbit&#8230;)-IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15400001, C15420001, C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack - DynaMag&#8482;-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex&#174; 100 Resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#174; 480 SYBR Green I Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation assay for the identification of arabidopsis protein-dna interactions in vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Sekiz temel adım büyüyen ve bitki malzemesi, kromatin çapraz bağlanması, kromatin izolasyon, kromatin parçalanması, DNA arasındaki komplekslerin seçici izolasyonu hasat içeren in vivo protein-DNA etkileşim tanımlanması için bu yonga protokolde saydı edilebilir immüno-protein sindirimi, DNA saflaştırma ve qPCR analizi (Şekil 1), ilgi konusu bir protein. ChIP protokolünde çok önemli bir aşaması, bir çapraz bağlanma reaksiyonunda DNA-protein etkileşimlerinin fiksasyondu...

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-identification-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

20.3K Görüntüleme.  Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid.  Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder. 

Video: Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

İnsan Beyninin Doku Kromatin Testi

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Biyoloji

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler