AirID, protein-protein etkileşimi için değerli bir enzimdir ve diğer yakınlık etiketleme enzimlerine göre zaman alan işlemlerde daha az toksisite ve daha az hata yaratır. Model olarak bir APRR2-AirID proteini kullanılarak salatalık veya Cucumis sativus'ta yakınlık etiketleme deneyini gerçekleştirmek için adım adım AT4G18020 protokol sunulmaktadır. Prosedürü laboratuvarımdan Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng ve Min Zhang gösterecek.
Cucumis sativus veya salatalık tohumlarını suya aktararak, 50 santigrat derecede 20 dakika inkübe ederek ve ardından tohumları 12 ila 16 saat boyunca bir Petri plakası üzerindeki filtre kağıdına yerleştirerek başlayın. Daha sonra tohumları toprak içeren saksılara aktarın ve üç ila dört hafta boyunca 16 saat aydınlık ve 18 saat karanlık fotoğraf periyodunda 23 santigrat derecede bir iklim odasında büyütün. 2.5 mikrolitre plazmid EarleyGate 100'ü agrobacterium tumefaciens GV3101 suşunun yetkili hücrelerine aktarın.
Tüpü üç dakika boyunca sıvı nitrojene aktarmadan önce 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Isı şoku vermek için, tüpü beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre aktarın. Ardından tüpü iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
Isı şoklu agrobacterium hücrelerine 1.000 mikrolitre Luria Bertani veya LB ortamı ekleyin. Hücreleri 30 santigrat derecede ve 118 RPM'de bir saat inkübe ettikten sonra, 3000 G'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin. Ardından 800 mikrolitrelik süpernatanı atın ve kalan çözeltiyi karıştırın.
Her biri mililitre başına 50 mikrogram kanamisin ve gentamisin ve mililitre başına 25 mikrogram rifampisin ile takviye edilmiş LB ortamına yerleştirin. Plakaları 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Plakalardan bazı bakteri kolonileri alın.
Bunları uygun antibiyotiklerle desteklenmiş LB sıvı ortamına koyun ve sıvı LB'yi 30 santigrat derece ve 218 RPM'de 36 ila 48 saat inkübe edin. Dört santigrat derecede 3.000 G'de iki dakikalık santrifüjlemeden sonra, optik yoğunluğu 600 nanometre dalga boyunda bir olarak ayarlamak için peleti bir agroinfiltrasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Bir mililitrelik iğnesiz bir şırınga kullanarak, abaksiyal yüzeyin tüm epidermisine 1.5 mililitre resüspanse edilmiş agrobakteriyel inokülum ile sızın.
İklim odasındaki bitkileri 23 santigrat derecede tutun ve saniyede metrekare başına 75 mikromol ışık ile 16 saat boyunca karanlık koşullarda sekiz saat 36 saat sonra, bir mililitre beş mikrogram biyotini önceden filtrelenmiş yapraklara sızdırın. Dört ila 12 saatlik biyotin infiltrasyonundan sonra, yaprakları kesin ve protein bozulmasını önlemek için hızla sıvı nitrojene aktarın. Yaprakları bir havaneli ve havan kullanarak öğütün ve hızlı bir şekilde pH 7.4'te iki mililitre PBS BSA ekleyin, ardından yavaş öğütün.
Numune karışımını, üzerine yerleştirilmiş hızlı bir filtrasyon malzemesi filtresinden 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü buz üzerinde tutun. Numuneleri iki mililitrelik bir tüpe aktarın. % 1'lik bir protein inhibitörü kokteyli ekleyin ve santrifüjlemeden önce tüpü yedi ila sekiz kez yukarı ve aşağı çevirerek içeriği karıştırın.
Bittiğinde, süpernatanı iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve% 10 beta-D-maltosid ekleyin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjlemeden önce tüpü beş dakika boyunca buza yerleştirin. Tuz giderme kolonunu dengelemek için, kolonun bir tarafını işaretleyin ve işaretli tarafı dışa bakacak şekilde santrifüjleyin.
Kolonun üst ve alt kapağını çıkarın ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.000 G'de tekrar santrifüjleyin. Sıvı çözeltiyi kolonun toplama tüpünden atın ve tüpü daha önce gösterildiği gibi santrifüjleme ile en az beş kez beş mililitre PBS tamponu ile yıkayın. 1.5 mililitrelik bir tüpte 50 mikrolitre Streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklara bir mililitre PBS BSA ekleyin ve iyice karıştırın.
Boncukları tüpün bir tarafına doğru emmek için tüpü üç dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Süpernatanı diğer taraftan atın ve bu PBS BSA yıkamasını üç kez tekrarlayın. Biyotinillenmiş proteini zenginleştirmek için, kolona iki mililitre numune ekleyin.
Kolonun dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 1000 G'de santrifüjlenmesinden sonra, 50 mikrolitre Streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklara bir mililitre tuzdan arındırılmış protein özü ekleyin. Manyetik boncuklar içeren tüpü döndürücüye normal hızda ve oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirerek çözeltiyi iyice karıştırın. Ardından, boncukları oda sıcaklığında veya tüpün bir tarafında toplanana kadar üç dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin.
Süpernatanı yavaşça çıkarın ve bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Tüpü bir döndürücü üzerinde iki dakika döndürün ve süpernatanı çıkarmak için manyetik rafta gerçekleştirilen adımı tekrarlayın. Benzer şekilde, yıkamaları daha önce gösterildiği gibi bir mililitre yıkama tamponu iki ve üç ile gerçekleştirin.
Ardından, 1,7 mililitre 50 milimolar tris hidroklorür ekleyerek ve manyetik rafta gerçekleştirilen adımı tekrarlayarak yıkama tamponlarındaki deterjanı çıkarın. Bir mililitre 50 milimolar amonyum bikarbonat tamponu kullanarak her biri iki dakikalık altı yıkama yapın. Bittiğinde, boncuklara 50 milimolar tris hidroklorür,% 12 sakaroz,% 2 lityum lauril sülfat ve% 1.5 ditiyotreitol içeren 50 mikrolitre protein özü ekleyin ve tüpü inkübatöre 100 santigrat derecede yerleştirin ısı şoku vermek için beş dakika.
Adımı manyetik bir rafta tekrarladıktan sonra, LCMS/MS analizi için süpernatanı eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ekstrakte edilen proteinlerin western blot analizi, sızan salatalık yapraklarında başarılı protein ekspresyonu ve biyotinilasyon gösterdi. Kontrole kıyasla etiketli proteinlerin ve ekstra bantların daha yüksek ekspresyon seviyesi, ilgilenilen genin hedef proteinlerinin AirID tarafından başarılı bir şekilde etiketlendiğini doğruladı.
Sonuçlar, dönüştürülen tüm örneklerde Anti-Flag antikoru ile hedef bandı gösteren Anti-Flag ve Anti-Mass antikorları kullanılarak doğrulandı. Biyotinillenmiş proteinler Streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklarla zenginleştirildikten sonra, farklı boyutlarda çoklu proteinler gözlendi. Tüm sonuçlardan, AirID'nin bitkilerde protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için yeni ve ideal bir enzim olduğu sonucuna varıldı.
Yakınlık etiketleme deneyi sırasında, beş mikromolar biyotin ve HR süresinin ideal olduğunu hatırlamak önemlidir. Protokol, yaprak örneğinin hazırlanması, ön biyotinin çıkarılması, ekstrakt proteininin miktarının belirlenmesi ve biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesi dahil olmak üzere tesiste AirID tabanlı yakınlık etiketlemesinin adım adım kurulumunu özetlemektedir. AirID'nin kombinasyon halinde ÜFE'den bağımsız biyotinilasyon doğruluğunu iyileştirmesi bekleniyor.
AirID'nin tesislerde ÜFE analizi için ideal olduğu sonucuna varılmıştır.
