Name: post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns
Uploaded: 2016-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns at JoVE.com

This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Dikkat: (metanol, yani MSDS) kullanmadan önce tüm malzeme ve reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) bakınız. çözücüler ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) yıkayıcı işlerken tüm uygun güvenlik uygulamalarının kullanımını sağlamak. HPLC, analitik terazi ve dedektör enstrümantasyon mühendislik kontrollerinin uygun kullanımını sağlamak ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı parmak ayakkabı) kullanımını sağlamak. Not: Bu protokol, ilgi konusu bir kimyasal bileşiğin doğası özgü, farklı bir reaktif ile reaksiyonu akış kolon sonrası türevlendirme 3 yöntem (RF-PCD) teknikleri açıklanmaktadır. ROS analizi için &quot;floreskamin kullanarak birincil aminler 2. Tespiti&quot; bölümüne bakın birincil aminler analizi için, &quot;ROS 1. Tespit DPPH • kullanarak&quot; bölümüne gidin ve fenolik bileşiklerin analizi için bölüm &quot;3 gidin . fenollerin algılama4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürünü &quot;seçeneğini kullanarak. boyunca ultra saf su (örneğin, Milli-Q su) kullanınız. Not: RF sütunun bağlantısı önemli bir fark, bir RF kolonu üzerinde son parçaları sayısı olmak geleneksel bir HPLC kolonu ile hemen hemen aynı şekilde elde edilir. HPLC sistemi standart bir HPLC kolonu bağlamak için kullanılan Bağlantı HPLC sistemine RF sütun bağlamak için kullanılabilir edebiliyoruz. 1. ROS Algılama DPPH • Kullanımı <ol><li> HPLC aletinin kurmak <ol><li> A hattı% 100 su ve mobil faz olarak, B hattı üzerindeki% 100 metanol ile HPLC aleti hazırlayın. üreticinin ihtiyaçlarına göre pompaları temizleyin. </li><li> HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, ek bir türetme pompa ayarlayın. </li><li> 520 nm&#39;lik bir dalga uzunluğunda analiz edilmesi, UV-Vis detektörü ayarlayın. </li></ol></li><li> Kadar ayarlayınRF sütunu <ol><li> HPLC aleti RF sütununun girişine bağlayın. </li><li> RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın. </li><li> 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak UV-Vis detektörü bir çıkış çevre portunu. </li><li> RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına DPPH • Pompa hattı bağlayın. </li><li> Bir sütun tıpa kullanarak RF sütunun çıkışında kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin. </li><li> 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı B -% 100 metanol. </li><li> Bir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 metanol hareketli faz ile sütun dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklenebilir olmalıdır. </li></ol></li><li> DPPH • ayıracın hazırlanması <ol><li> Metanol DPPH • bir 0.1 mg / ml çözelti hazırlayın. </li&gt; <li> 10 dakika boyunca DPPH • reaktifı ihtiva eden şişenin sonikasyon. </li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo balon örtün. </li><li> Üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanan DPPH • reaktif ile DPPH • Pompayı temizleyin. </li></ol></li><li> RF kolon çıkışı Tuning <ol><li> Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin. </li><li> 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak. </li><li> merkez liman gemi yeniden tartmak ve aşağıdaki gibi merkezi bağlantı noktasından akışının ağırlığı hesaplamak: Merkez Liman Gemi başlangıç ​​Ağırlık (g) - Merkez Port (g) Ağırlık Orta Liman Gemi (g) Nihai Ağırlık = </li><li> Tekrarlayın UV-Vis RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve periferik liman gemisi olarak ağırlığını hesaplamak olduğunu çıkan atığın için 1.4.2 ve 1.4.3 adımlarıaşağıdaki gibidir: Periferik Liman Gemi başlangıç ​​Ağırlık (g) - Çevresel Port (g) Ağırlık Periferik Liman Gemi (g) Nihai Ağırlık = </li><li> aşağıdaki şekilde, merkezi ve periferik bağlantı noktaları gelen akış yüzdesini hesaplayın: % Merkezi Port Central Port (g) = Ağırlık / (Merkez Limanı (g) + Çevresel Port (g) Ağırlık Ağırlık) x 100 % Periferik Liman Periferik Port (g) = Ağırlık / (Merkez Limanı (g) + Çevresel Port (g) Ağırlık Ağırlık) x 100 </li><li> merkezi akış ve çevresel akış arasındaki segmentasyon oranını sağlamak 30:70 (: periferik santral) &#39;dir. orta akış% 30 üzerinde ise, merkezi bağlantı çıkışına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarını azaltır. merkezi akış% 30 altında ise merkez limanından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır. </li><li> (: Periferik santral) elde edilir 30:70 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 1.4.1 1.4.6 için. </li><li> D akış hızını ayarlama0.5 ml dk -1 PPK • reaktif pompası. Not: DPPH • reaktif ile kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir. </li></ol></li><li> Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları <ol><li> Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten enjekte edildikten sonra, türetme reaktif pompa akışını durdurun. </li><li> Periferik bağlantı noktasından DPPH • reaktif pompa satırını kaldırın ve bağlantı noktası tıpalayın. </li><li> Mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika için izin depolanacak olan mobil faz ile sütun dengelenmesi. </li><li> HPLC cihazı üzerinde mobil faz pompanın akışını durdurun. </li><li> Metanol ile DPPH • reaktifi değiştirin ve ilave pompa temizlemek. Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir. </li></ol></li></ol> Fluoresc kullanılarak primer aminlerin 2. Tespitamin <ol><li> Mobil faz hazırlanması <ol><li> hacme seyreltme öncesi 5 M amonyum hidroksit ile 9.0&#39;a çözeltinin pH&#39;ının ayarlanmasını, 10 mM amonyum asetat çözeltisi bir 1 L hazırlayın. </li><li> 95:05 (: ACN tamponu) bir önceden karıştırılmış mobil faz elde etmek için amonyum asetat tampon asetonitril (ACN) ve 52.6 ml ilave edilir. </li></ol></li><li> HPLC aletinin kurmak <ol><li> mobil faz olarak A hattı üzerindeki önceden karıştırılmış hazırlanan tampon ile HPLC cihazı hazırlayın. üreticinin ihtiyaçlarına göre pompayı temizleyin. </li><li> HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, ek bir türetme pompa ayarlayın. </li><li> türetme pompasına bir darbe dampener bobin takın. </li><li> Ayar floresans dedektörü (FLD) 475 nm 390 nm ve emisyon dalga bir eksitasyon dalga boyu ile. </li></ol></li><li> RF sütunun kurmak <ol><li> th bağlayınHPLC aleti RF sütunun e girişi. </li><li> RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın. </li><li> 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak FLD detektöre RF sütunu bir çıkış çevre portunu. </li><li> RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına türetme pompa hattı bağlayın. </li><li> Bir sütun tıpa kullanarak RF sütunun çıkışında kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin. </li><li> 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı A -% 5 ACN ile önceden karıştırılmış, 10 mM amonyum asetat tampon pH 9. </li><li> Bir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 A hattı hareketli faz ile sütun dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklendirilebilir. </li></ol></li><li> Floreskamin ayıracın hazırlanması <ol><li> Bir 0.1 mg mi -1 floreskamin reaktif 100 ml olun. </li> &lt;1 dakika boyunca li&gt; sonikasyon. </li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. </li><li> üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış floreskamin reaktif ile reaktif pompasını temizleyin. </li></ol></li><li> RF kolon çıkışı Tuning <ol><li> Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin. </li><li> 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak. </li><li> Merkezi damar yeniden tartın ve aşama 1.4.3 şu şekilde merkez limanından akış ağırlığı hesaplamak. </li><li> Tekrarlayın RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve adım 1.4.4 şu şekilde periferik için ağırlığı hesaplamak olduğunu FLD çıkan atığın için 2.5.3 için 2.5.2 adımları. </li><li> Adım 1.4.5 şu şekilde santral ve periferik limanlarından gelen akış yüzdesini hesaplayın. </li><li> merkezi akış ve periferik arasındaki segmentasyon oranını sağlamakAkış 43:57 (: periferik santral) &#39;dir. orta akış% 43 üzerinde ise, merkezi bağlantı çıkışına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarını azaltır. orta akış% 43 altında ise, merkezi bağlantı noktasından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır. </li><li> (: Periferik santral) elde edilir 43:57 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 2.5.1 2.5.6 için. </li><li> 0.7 mi dakika mobil faz pompa akış hızını ayarlama -1. </li><li> 0.1 ml dk akış türetme pompa ayarlama -1. Not: floreskamin reaktif ile kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir. </li></ol></li><li> Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları <ol><li> Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten enjekte edildikten sonra, türetme pompayı durdurun. </li><li> Periferik liman ve stoper gelen türetme pompa hattını sökün. </li><li> mobil fazda ile kolon dengeyebu da mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika boyunca izin vererek saklanacaksa. </li><li> mobil faz pompanın akışını durdurun. </li><li> asetonitril ile floreskamin reaktifi değiştirin ve türetme pompasını temizlemek. Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir. </li></ol></li></ol> 4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanür kullanılması Fenollerin 3. Algılama <ol><li> Mobil faz hazırlanması <ol><li> hacme seyreltme öncesi 5 M amonyum hidroksit ile 9.0&#39;a çözeltinin pH&#39;ının ayarlanmasını, 100 mM bir amonyum asetat çözeltisi bir 1 L hazırlayın. </li><li> (: Metanol tamponu) 5: 95 bir önceden karıştırılmış mobil faz elde etmek için amonyum asetat tampon metanol 52.6 ml ekleyin. </li></ol></li><li> HPLC aletinin kurmak <ol><li> mobil faz olarak A hattı üzerindeki önceden karıştırılmış hazırlanan tampon ile HPLC cihazı hazırlayın. üretici başına kadar pompayı Temizle &#39;; S gereksinimleri. </li><li> HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi iki ilave belirteci pompaları ayarlayın. </li><li> reaktif pompalarının her birine bir darbe dampener bobin takın. </li><li> 500 nm&#39;lik bir dalga uzunluğunda analiz edilmesi, UV-Vis detektörü ayarlayın. </li></ol></li><li> RF sütunun kurmak <ol><li> HPLC aleti RF sütununun girişine bağlayın. </li><li> RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın. </li><li> 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak UV-Vis detektörü RF sütunu bir çıkış çevre portunu. </li><li> Her reaktifi (yani, 4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürle) RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına pompa hattı bağlayın. </li><li> 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı A -% 5 metanol ile önceden 100 mM amonyum asetat tampon pH 9. </li><li> w sütunu dengeyeBir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 A hattı mobil faz i. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklendirilebilir. </li></ol></li><li> 4-aminoantipiren ayıracın hazırlanması <ol><li> adım 3.1.1 izleyerek 9 bir pH değerine sahip bir amonyum asetat tamponu hazırlayın. </li><li> 150 mg kadar 4-aminoantipiren tartılır ve hazırlanan amonyum asetat tamponu (pH 9), 100 ml içinde çözülür. </li><li> 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. </li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. </li><li> üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış 4-aminoantipiren reaktif ile ilk reaktif pompasını temizleyin. </li></ol></li><li> Potasyum ferrisiyanür ayıracın hazırlanması <ol><li> potasyum ferrisiyanür 150 mg ağırlığında ve adım 3.1.1 göre hazırlanan amonyum asetat tamponu, 100 ml (pH 9) içinde çözülür. </li><li> 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. </li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo örtün. </li><li> Purgüreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış potasyum ferrisiyanür reaktif ile e ikinci reaktif pompası. </li></ol></li><li> RF sütunun Tuning <ol><li> Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin. </li><li> 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak. </li><li> Merkezi damar yeniden tartın ve aşama 1.4.3 şu şekilde merkez limanından akış ağırlığı hesaplamak. </li><li> Tekrarlayın UV-Vis RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve adım 1.4.4 şu şekilde periferik için ağırlığı hesaplamak olduğunu çıkan atığın için 3.6.3 için 3.6.2 adımları. </li><li> Adım 1.4.5 şu şekilde santral ve periferik limanlarından gelen akış yüzdesini hesaplayın. </li><li> merkezi akış ve çevresel akış arasındaki segmentasyon oranını sağlamak 50:50 (: periferik santral) &#39;dir. orta akış% 50 üzerinde ise, azaltmakçıkış, merkezi noktasına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarı. orta akış% 50 altında ise, merkezi bağlantı noktasından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır. </li><li> (: Periferik santral) elde edilir 50:50 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 3.6.1 3.6.6 için. </li><li> 0.5 mi dakika 4-aminoantipiren pompa akış hızını ayarlama -1. </li><li> 0.25 mi dk potasyum ferrisiyanür pompa akış hızını ayarlama -1. Not: İki bileşenli reaktif kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir. </li></ol></li><li> Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları <ol><li> Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten bittikten çalışma enjekte edildikten sonra, reaktif pompaları hem dur. </li><li> Periferik limanlarından reaktif pompa satırları kaldırın ve 0,13 mm boru 15 cm parça ile değiştirin. </li><li> WHI mobil faz ile sütun dengeyeCH mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika boyunca izin vererek saklanacaksa. </li><li> HPLC cihazı üzerinde mobil faz pompanın akışını durdurun. </li><li> Değiştir hem ayıraç reaktifler metanol ile pompa ve üretici şartının gibi ek pompaları temizlemek. Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Srijaranai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+1-(2-pyridylazo)-2-naphthol+as+the+post+column+reagent+for+ion+exchange+chromatography+of+heavy+metals+in+environmental+samples.">Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples.</a> Microchem. J. 99, 152-158 (2011).</li><li>Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-VIS+detection+of+amino+acids+in+liquid+chromatography:+online+post-column+solid-state+derivatization+with+Cu(II)+ions.">UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions.</a> J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).</li><li>Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+aflatoxins+in+cereal+flours+by+solid-phase+microextraction+coupled+with+liquid+chromatography+and+post-column+photochemical+derivatization-fluorescence+detection.">Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection.</a> J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).</li><li>Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+N-nitrosamines+and+other+nitro(so)+compounds+in+water+by+high-performance+liquid+chromatography+with+post-column+UV+photolysis/Griess+reaction.">Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction.</a> Water Res. 47, 4893-4903 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+isoflavonoids+in+Radix+Puerariae+for+quality+control+using+on-line+high+performance+liquid+chromatography-diode+array+detector-electrospray+ionization-mass+spectrometry+coupled+with+post-column+derivatization.">Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization.</a> Food Res Int. 48, 528-537 (2012).</li><li>Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+coupled+to+on-line+post+column+derivatization+for+the+determination+of+organic+compounds:+a+review+on+instrumentation+and+chemistries.">Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries.</a> Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).</li><li>Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrophilic+interaction+chromatography+determination+of+lysine+in+pharmaceutical+preparations+with+fluorescence+detection+after+postcolumn+derivatization+with+o-phtaldialdehyde.">Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde.</a> J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).</li><li>Iijima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Online+Post-Column+Derivatization+System+for+Ultra+High-Performance+Liquid+Chromatography+(UHPLC)+and+Its+Applications+to+Analysis+of+Biogenic+Amines.">Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines.</a> Anal Sci. 29, 539-545 (2013).</li><li>Cunico, R. L., Schlabach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Ninhydrin+and+o-Phthalaldehyde+Postcolumn+Detection+Techniques+for+High+Performance+Liquid+Chromatography+of+Free+Amino.">Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino.</a> J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).</li><li>Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Measurement+of+Leucine-specific+Activity+in+Biological+Fluids+by+Ion-exchange+Chromatography+and+Post-column+Ninhydrin+Detection.">Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection.</a> J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).</li><li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescamine:+A+Reagent+for+Assay+of+Amino+Acids,+Peptides,+Proteins+and+Primary+Amines+in+the+Picomole+Range.">Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range.</a> Science. 1972, 871-872 (1972).</li><li>Samejima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Fluorescamine+Derivitices+of+Aliphatic+Diamines+and+Polyamines+by+High+Speed+Liquid+Chromatography.">Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+antioxidant+activity+of+ten+compounds+in+different+tea+samples+by+means+of+an+on-line+HPLC-DPPH+assay.">Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay.</a> Food Res Int. 53, 847-856 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+anti-oxidants+in+Flos+Chrysanthemi+by+HPLC-DAD-ESI/MS(n)+and+HPLC+coupled+with+a+post-column+derivatisation+system.">Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system.</a> Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).</li><li>Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+validation+of+post-column+assay+for+screening+of+radical+scavengers+in+herbal+raw+materials+and+herbal+preparations.">Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).</li><li>Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+post-column+free+radical+scavenging+and+ferric+reducing+antioxidant+power+assays+for+screening+of+antioxidants+in+strawberries.">Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries.</a> J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Methimazole+in+Pharmaceutical+Preparations+using+an+HPLC+Method+Coupled+with+an+Iodine-Azide+Post-Column+Reaction.">Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction.</a> J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+with+post-column+iodine-azide+reaction+for+the+determination+of+thioguanine.">Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine.</a> J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).</li><li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+measurements+of+the+true+column+efficiency+and+of+the+instrument+band+broadening+contributions+in+the+presence+of+a+chromatographic+column.">Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column.</a> J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).</li><li>Stewart, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post+cotumn+derivatization+methodology+in+high+performance+liquid+chromatography+(HPLC).">Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC).</a> Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).</li><li>Rigas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography.">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li><li>Frei, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography.">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li><li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid:+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent.">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (2015).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD bant genişletilmesi etkilerinin en aza indirilmesi ve ayırma performansını artırmak, reaksiyon bobinler kullanılmadan HPLC atık sonrası sütun ile türetme reaktif verimli karıştırma sağlar. RF-PCD yöntemler de tespit yöntemi ile ilgili olarak, sinyal yanıt olarak iyileşme göstermiştir. Camenzuli ve ark., 28 espresso kahve numunesinde ROS tespiti için DPPH • reaksiyon akış sütun kullandığını rapor için ilk oldu. Yaptıkları çalışmada çeşitli DPPH <...

Kolon sonrası türevlendirme (PCD) ile birleştirilen yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analiz laboratuarda bir dizi konu çözümünde yararlı olan güçlü bir araçtır. Bu, 1,2 uygun dedektörler paketi ile başka bir tespit edilemeyen bileşikler tespit seçici saptanması ve nicelenmesi 3-5 alt sınırları sağlar veya hedef analitin sinyal geliştirmek için kullanılabilir önlemek için bir hedef analitin türetmek matriks etkileri 6. Yaygın olarak kullanılan PCD reaksiyonları 9,10 veya floreskamin 11,12, 2,2-difenil-ile reaktif oksijen türlerinin türetme (ROS) ninhidrin orto-phthaladehyde 7-9 olan amino asitler gibi aminlerin reaksiyonu içerir 1-picrylhydrazil kökü (DPPH) • 13,14 veya 2,2&#39;-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit (ABTS) 15,16 ve sülfür c türetmek için iyodid-azit belirteci kullanılmasıiçeren gruptur bileşikler 17,18. HPLC sistemleri 6 PCD reaksiyonlarının kullanılması ile pek çok dezavantajları, ancak vardır. Prensip olarak, bu arasında karıştırılması ve reaksiyon, 8 oluşması için zaman tanımak türetme reajan (lar) ve dedektör, ilave alanına arasındaki reaksiyon, rulo kullanılmasıdır. Bu reaksiyon genellikle HPLC sistemi 19 geri kalan hacmi ile karşılaştırıldığında önemli 500 ul ya da daha fazla, hacimleri var döngüler. Bu yüksek hacim, reaksiyon bölgesinin kullanımı Reaksiyon bağın varlığı olmaksızın gözlenebilir etkilere kıyasla artırılmış tepe genişletilmesi sonuçları döngüler. Bu kantitatif ve algılama yüksek sınırları var kısa, daha geniş zirveleri ile sonuçlanır ve olumsuz kromatografik çözünürlüğü etkiler. 1 Rakamlar ve 2 farklı sonrası kolon reaksiyon döngü hacimlerinin yanı sıra kaynaklanan pik şeklinin bozulmasını vurgulayın. Bu analiz,bir cep 94% metanol faz bileşimi ve% 6 Milli-Q su ile yapıldı. Hareketli fazın akış oranı 1 ml / dak, enjeksiyon hacmi 20 ul ve analiz dalga boyu 265 nm idi. 20 ul 1.000 ul ölü hacimleri değişen Rulo sütun ve PCD yöntemleri reaksiyon döngü ölü hacim etkilerini simüle etmek için dedektör arasına yerleştirildi. Bu ilmekler, 0.5 mm iç çapa sahip, paslanmaz çelik boru hazırlandı. Deney, denetleyici (SCL-10AVP) &#39;den oluşan bir HPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir, bir düşük basınç Gradyan Vana (FCL-10ALVP), bir pompa (LC-20AD), bir enjektör (SIL-10ADVP) ve PDA dedektör ( SPD-M10ADVP). Mobil faz önce HPLC sistemine sokulmadan bir faz giderme yoluyla pompalanmıştır. Ayırma 250 mm x 4.6 mm İD 5 um kolonu kullanılarak gerçekleştirildi. Deney koşulları en son literatürde yayınlanmıştır PCD reaksiyonlar tipik olarak seçilmiştir. En basit, en yaygın sonrası kolon reaktör kurulum etkili bir sıvı akabilir ve reaksiyon gerçekleşebilir hangi aracılığıyla uzun, ince bir tüp olmayan bir parçalı boru şeklinde reaktör denir. Bu sistem, zirve genişleme sadece sisteme eklenen ölü hacim değil, aynı zamanda lijima ve arkadaşları. 8 tarafından belirtildiği gibi borunun iç çapına bağlıdır. Ayrıca, bobin geometrisi gözlenen marka genişlemesi bir rol oynar. Reaktörün sarma ölü hacim minimize edilebilir, yani daha iyi bir karıştırma sonucu, ikincil akış profilleri değiştirir Stewart 20 belirtti. 21 bobin örme açık boru şeklinde kullanırken pik genişlemesi önemli olmadığı ifade edilmiştir. Pik genişletilmesi aşırı büyük olduğunda, başka reaktör tipleri de 20,22 düşünülebilir. Bunlar yatak reaktörleri veya parçalı akış reaktörleri içerebilir. Bu reaktörler, ki bunlar aksi takdirde requir olur yavaş reaksiyonlar için özellikle yararlı olane&#39;nin büyük tepki döngüler. olmayan parçalı boru şeklinde reaktörler PCD uygulamalarında kullanılan reaktörlerin en yaygın türleri, reaktör kurulum bu tür ile bu makalede fırsatlar geri kalanı gibi. Reaksiyon akışı (RF) sütunun tasarımı mobil faz dış bulunan radyal merkez kolonun bölge veya üç limanlarında bulunan tek bir bağlantı noktası aracılığıyla ya sütunu çıkmak (veya girmek) için izin veren bir çok portlu sonu uydurma içermektedir sütunun duvar kısmı (bakınız Şekil 3). Bu iki akım deliklerden dışarı uzanan bir dış gözenekli cam malzeme ile çevrili da bir su geçirmez halka tarafından çevrelenen bir merkezi gözenekli cam malzeme ihtiva eden bir uç teçhizatı kullanılarak ayrılır. Santral geçirmeyen bir halka çapraz akışına iki gözenekli bölgeler arasında mümkün değildir. Reaksiyon akış kromatografisi sırasında, türetme reaktif (ler) bir veya TW olarak mobil faz akış yönüne karşı pompalanırReaksiyon akış sütunun dış limanlarından o. Elüsyon maddesi serbest bir dış port üzerinden dış frit türetme reajan (lar) ile karıştırılmış ve dedektör geçirilir. Reaksiyon akımı ya tek reaktif türetme için kullanılabilir ya da ikili bir madde sistemi (türevlendirme reaktifleri 2 portu ve 1 bağlantı noktası (türetme reaktifin 1 bağlantı noktasına 1 bağlantı dedektörü ve 1 bağlantı bloke kolon eluent geçmek için) ) dedektöre sütun eluent geçmektedir. Merkezi akıştan akış ya da türetilmemiş Elüsyon maddesi etkin çoklayıcı algılama 23 ya da atık geçer tespit etmek için kullanılabilir. RF-PCD kromatografisi çalışan santral ve periferik akımlarının oranı olduğunda kullanılabilir bir büyük ayar tekniği. Her bir türetme için en uygun oranı, merkezi akış tespit edilmesi veya atık geçilecek olmadığı gibi bir dizi faktöre bağlıdır. Bu nedenle, optimum oranı tespit edildikten sonra, Doğru akım oranı her çalışma gerçekleştirildiğini önce elde edilir sağlanmalıdır. Bir cam hamuru kullanımı Elüsyon maddesi akışı ve tipik olarak sıfır ölü hacim T parçasını ya da düşük bir ölü hacmi kullanılması, geleneksel karıştırma teknikleri ile karşılaştırıldığında, daha etkili karıştırma RF-PCD sonuçlarında türetme reaktif karışımı olduğu bulunmuştur W- parça iki akışları karıştırmak için. Bu nispeten küçük Reaksiyon döngüleri kullanımı için izin verilen ya da tamamen reaksiyon, döngünün bile ortadan kaldırılması yer alır. Geleneksel sonrası sütun türevlendirme yöntemlerine göre daha keskin zirveleri reaksiyon döngü boyutu sonuçlarının azaltılması. Bu, tüm sütun elüsyon türetilmiş olmasına rağmen, gürültü oranı daha büyük bir sinyal gözlenir ve saptanması ve nicelenmesi dolayısıyla alt sınırları elde edilebilir olduğu anlamına gelir. Reaksiyon akış kromatografisi PCD reaksiyon adaptasyonu ile zorlukların üstesinden gelmek için geliştirilmiştirnedeniyle büyük hacimli reaksiyon döngüler istihdam ihtiyacı nedeniyle büyük yazılan sütun ölü hacimleri modern HPLC kolon ve sistemleri, genişletilmesi bant kaynaklanan verimlilik özellikle kaybına s. Geleneksel PCD göre RF-PCD daha verimli karıştırma işlemleri daha az, reaksiyon döngüsü hacimleri gözlenen ayırma veriminde bir artışa yol kullanılabilir anlamına gelir. Ayrıca, RF-PCD kromatografisi her iki sinyal artan geleneksel PCD yöntemlerine göre saptanması ve nicelenmesi alt sınırları ile sonuçlanan klasik PCD tekniklere kıyasla gürültü azalması gösterir. Geleneksel PCD yöntemlerine göre RF PCD ilave bir avantajı, RF sütun merkez noktası olarak kolonun çevre bölgesinde elute olur türevlendirilmiş akımından ayrılır be türetilmemiş akışı izleme yeteneği. RF-PSD geleneksel PCD yöntemlerine göre birçok avantaj görüntüler nispeten yeni ama gelecek vaat eden bir tekniktir. <p class="jove_content"&gt; RF sütunun bağlantısı önemli bir fark, bir RF kolonu üzerinde son parçaları sayısı olmak geleneksel bir HPLC kolonu ile hemen hemen aynı şekilde elde edilir. HPLC sistemi standart bir HPLC kolonu bağlamak için kullanılan Bağlantı HPLC sistemine RF sütun bağlamak için kullanılabilir edebiliyoruz.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td>Agilent</td><td>1290 Series HPLC</td><td></td></tr><tr><td>Additional Pump(s) for derivatization system</td><td>Shimadzu</td><td>LC-20A</td><td></td></tr><tr><td>RF colum</td><td></td><td></td><td>Non-commercial</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z227307</td><td></td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td></td><td></td><td>Provided with column</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z290882</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td></td><td></td><td>4-point analytical balance</td></tr><tr><td>Stop watch</td><td></td><td></td><td>Non-Scientific equiptment</td></tr><tr><td>Eluent collection vials</td><td></td><td></td><td>Any Small vial with a flat bottom will do, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, HPLC vials</td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td></td><td></td><td>Will depend on instrument used</td></tr><tr><td>Vessels for mobile phase and derivatization solution(s)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z232211</td><td></td></tr><tr><td>General Laboratory glassware</td><td></td><td></td><td>Volumetric Flasks, pippettes, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; Quantity and volumes will depend on sample preparation method.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>DPPH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9132</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17836</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9015</td><td></td></tr><tr><td>4-aminoantipyrene&amp;nbsp;</td><td>Acros Organics BVBA</td><td>AC103151000</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide&amp;nbsp;</td><td>AnalaR</td><td>B10204-30</td><td></td></tr></tbody></table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

RF-PSD tarafından kullanılmak üzere uyarlanmıştır ilk PCD yöntemi 2,2-difenil-1-picrylhydrazil kökü (DPPH) • 24 ile antioksidanların türetilmesi olmuştur. Bu reaksiyon. Koleva ve ark 25 tanıtıldı ve yaygın beri kullanılmaktadır. Algılama, reaktif oksijen türlerinin varlığında, radikal DPPH • renksizleşme, gözlenen absorbans bir damla antioksidanlar sonuçlar dolayısıyla varlığına dayanır. DPPH • Reaksiyon genell...

Watch this Scientific Journal Video about Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns at JoVE.com

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Mesaj Sütun Türevlendirme Reaksiyon Akış Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sütunlar kullanma

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

post-column-derivatization-using-reaction-flow-high-performance

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Chromatography

SCIENTISTS IN ACTION

15.0K Görüntüleme.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Video: Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Paralel Segment Akış Sütun Tuning ve Multipleks Algılama etkinleştirme

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Kimya

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Akış Sütun Perde: Verimliliği ve Duyarlılık Optimizasyonu

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

A Robust Method for Packing High Resolution C18 RP-nano-HPLC Columns

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. Here we introduce a robust, reproducible and inexpensive protocol for preparation of a nano-flow reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) columns for on-line separation of analytical peptides before introduction into and detection by a mass-spectrometer in traditional bottom-up proteomics workflows. Depending on the goal of the experiment and the chemical properties of the analytes being separated, optimal column parameters may differ in their internal or outer diameters, length, particle size, pore size, chemistry of stationary phase particles, and the presence or absence of an integrated electrospray emitter at the tip. An in-house column packing system not only enables the rapid fabrication of columns with the desired properties but also dramatically reduces the cost of the process. The optimized protocol for packing a C18 AQ (aqueous) fused silica column discussed here is compatible with a wide range of liquid chromatographic instruments for achieving effective separation of analytes.

Here, we present and evaluate a protocol for making low cost reversed phase nano-flow liquid chromatography columns for peptide characterization using LC-MS/MS proteomic workflows.

The high complexity prevalent in biological samples requires chromatographic separations with high sensitivity and resolution to be effectively analyzed. ...

Biyokimya

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. However, capillary columns are much less robust in comparison to their higher flow countertypes. Because of easy contamination and blocking, they often need replacement. That makes them a markedly expensive part of the total LC-MS analysis cost. In-house packing of UHPLC capillary columns saves a lot of money and allows customization. However, the standard packing procedure in the 100-bar pressure bomb works well only for HPLC columns but is too slow for UHPLC sorbents. Here we provide a description of an optimized FlashPack protocol applied to the same 100-bar pressure bomb setup. The method is based on packing from ultra-high sorbent concentration slurry and is developed for in-house manufacturing of UHPLC capillary columns of unlimited length in reasonable time.

Here we present a protocol for the optimized FlashPack capillary column packing procedure. Application of an optimized protocol to a common 100-bar pressure bomb setup allows 10-times faster packing and manufacturing of long ultra-high performance capillary columns.

FlashPack Yaklaşımı ile Basit Şirket İçi Ultra Yüksek Performanslı Kılcal Sütun Üretimi

Capillary ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) is currently a method of choice for the sample separation step in LC-MS-based proteomics. ...

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and quantify components of liquid samples. In this technique, a solution (first phase) is pumped through a column that contains a packing of small porous particles with a second phase bound to the surface. The different solubilities of the sample components in the two phases cause the components to move through the column with different average velocities, thus creating a separation of these components. The pumped solution is called the mobile phase, while the phase in the column is called the stationary phase.
There are several modes of liquid chromatography, depending upon the type of stationary and/or mobile phase employed. This experiment uses reversed-phase chromatography, where the stationary phase is non-polar, and the mobile phase is polar. The stationary phase to be employed is C18 hydrocarbon groups bonded to 3-&#181;m silica particles, while the mobile phase is an aqueous buffer with a polar organic modifier (acetonitrile) added to vary its eluting strength. In this form, the silica can be used for samples that are water-soluble, providing a broad range of applications. In this experiment, the mixtures of three components frequently found in diet soft drinks (namely caffeine, benzoate, and aspartame) are separated. Seven prepared solutions containing known amounts of the three species are used, and their chromatograms are then recorded.

Operation of High-Performance Liquid Chromatography HPLC

Source: Dr. Paul Bower - Purdue University
High-performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical method commonly used to separate and ...

JoVE Science Education

Analitik Kimya

Column Chromatography

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This technique utilizes a stationary phase, which is packed in a column, and a mobile phase that passes through the column. This technique exploits the differences in polarity between compounds, allowing the molecules to be facilely separated.1 The two most common stationary phases for column chromatography are silica gel (SiO2) and alumina (Al2O3), with the most commonly used mobile phases being organic solvents.2 The solvent(s) chosen for the mobile phase are dependent on the polarity of the molecules being purified. Typically more polar compounds require more polar solvents in order to facilitate the passage of the molecules through the stationary phase. Once the purification process has been completed&#160;the solvent can be removed from the collected fractions using a rotary evaporator to yield the isolated material.

Column Chromatography: Principle, Separation of Compounds from a Mixture

Source: Laboratory of Dr. Jimmy Franco - Merrimack College
Column chromatography is one of the most useful techniques for purifying compounds. This ...

Organik Kimya

Principles Of Column Chromatography

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. Further, in 1941, Archer John Porter Martin and R. L. M. Synge modified the technique by packing silica gel into a column. A mixture of amino acids was then separated on the packed column using chloroform and water mixture as the mobile phase. This was the first report on column chromatography. At present, column chromatography is a widely used technique for separating various types of compounds from a sample mixture.
Factors Influencing Efficient Separation of Proteins 
Various parameters like column material, packing, and operational conditions such as flow rates and temperature determine the efficiency of separation by column chromatography.
The choice of column material or matrix determines the extent of interaction with the sample. The matrix material must be tightly and uniformly packed in the column. Air bubbles, debris, large particles, and precipitates interfere with the uniform flow of the solvent through the column, affecting its separation efficiency. The column should also be free from particulate matter.
The sample injected into the column should be clear and free from aggregates that might clog the column, hindering solvent flow. The flow rate of solvent also affects the separation. Very high or very low flow rates of solvents result in inefficient separation of compounds and impure preparations. Very high rates may also disturb the column packing, affecting process efficiency. In addition, the composition of elution buffer is also an important factor. It should be non-corrosive and compatible with the sample and also the column material to prevent in situ precipitation or dissolution.
Another operational parameter, temperature, also plays an important role in the process. It decides the stability of the sample, column material, and solvent buffer. Also, a constant temperature throughout the column efficiently resolves compounds. After completing the separation process, the columns must be washed thoroughly by repeatedly passing a suitable solvent to avoid sample contamination in further runs. Occasionally, the solvent is passed in a column in the reverse direction to remove any clogged material.
Limitations
Though a very widely used technique, the method still has some limitations. It is a very time-consuming method as the flow rates need to be slower for better resolution of the compounds. Also, large quantities of highly pure solvents required in the mobile phase make the process expensive. This also raises the scaling-up cost when higher yields of pure compounds are needed.

Kolon Kromatografisinin Prensipleri

The chromatography technique was first invented in 1901 by Michael S. Tswett, a Russian botanist, to separate plant pigments using organic solvents. ...

Hücre Biyolojisi

Hücrelerin ve Proteinlerin Analizi

KEY TERMS AND CONCEPTS

Types Of Column Chromatography

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating parameters such as pH, temperature, or solvent affect the packing of the column material, thereby determining the purification efficiency. The choice of column material also plays an essential role in deciding the operating parameters and can be modified based on the proteins that need to be purified.
Gel Filtration Chromatography 
When the protein&#39;s chemical nature is unknown, gel filtration chromatography is used for purification based on size. Matrices such as agarose, polyacrylamide, dextran derivatives, or silica beads are used for low-pressure systems, whereas polymeric resins are used for higher flow rates. The varying degree of cross-linking of these polymeric materials determines the pore size of the matrix, which decides the size range of proteins that can be separated.
Ion Exchange Chromatography
Ion-exchange chromatography can purify proteins based on their net charge at a particular pH determined by their isoelectric point or pI. The net charge on matrix resin is used to purify oppositely charged proteins by replacing the cations or anions from the matrix resin with the charged proteins. The resins are categorized based on the type of ion that is exchanged &#8212; positively charged proteins replace cations from cation-exchange resins, and vice versa. Strong ion exchangers with stability over a wide range of buffer pH include quaternary ammonium, sulfonate, and sulfopropyl resins. In contrast, weak ion exchangers that are effective only in a narrow pH range include diethyl aminoethyl (DEAE) or carboxymethyl (CM) resins.
Affinity Chromatography
Affinity chromatography involves immobilizing protein-specific antibodies or enzyme-specific substrates to the column material, usually agarose beads. For example, a column with the immobilized antibody of choice is prepared to separate specific antigens. When the mixed antigen sample is passed through the&#160; column, the target antigens bind to the immobilized antibodies and separate from the mixture. To separate recombinant proteins tagged with enzymes such as beta-galactosidase, the corresponding substrate Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG) is immobilized on the column to purify the enzyme.
High-pressure liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) are the most commonly used column chromatography techniques. In HPLC, the solvent flows at high pressure through a tightly packed column that improves efficiency. Gas chromatography analyzes volatile compounds by converting them to their gaseous forms upon heating. The volatilized sample is pushed through the column by inert gasses such as nitrogen and helium.

Kolon Kromatografisi Çeşitleri

The stability and compatibility of column material with samples are crucial for efficient purification in chromatographic techniques. Various operating ...

High-Performance Liquid Chromatography: Introduction

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, identify, and quantify components in complex mixtures. The term &#34;high pressure&#34; refers to using high pressure to push the liquid mobile phase through the tightly packed columns.
In HPLC, two phases play a critical role in the separation process:
<ol>
	<li>Mobile Phase: This is a liquid solvent that flows through the system, carrying the sample with it. The solvent is chosen based on its polarity to optimize the interaction with the analytes and the stationary phase. The &#34;polarity index&#34; serves as a guide to selecting the suitable solvent for separation.</li>
	<li>Stationary Phase: The stationary phase is a solid material, often silica-based, packed within the column. In reverse-phase HPLC, the stationary phase is typically derivatized silica, such as octadecyl (C18) silica. The small particle size of the packed material creates a high surface area, enhancing interactions with the analytes. To reduce undesirable interactions, such as those with unreacted silanol groups, the stationary phase is often end-capped with reagents like trimethylchlorosilane</li>
</ol>
Separation occurs as the analytes interact differently with both the mobile and stationary phases, depending on their chemical properties, which leads to differential migration through the column.
Sometimes, solute molecules bind irreversibly to the stationary phase, clogging the analytical column and decreasing its performance. To prevent this, a guard column is placed before the analytical column. A precolumn called a scavenger column may also be placed between the mobile phase reservoir and the injector. This ensures that the solvent enters the analytical column, which is already saturated with silica from the scavenger column, preventing unwanted reactions and extending the lifetime of the analytical column.
After the separation, analytes are detected by various detectors, depending on the characteristics of the compounds. The results are visualized as chromatograms, with peaks corresponding to the different components of the mixture. This provides both qualitative and quantitative data about the sample.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi: Giriş

High-performance liquid chromatography(HPLC), formerly referred to as High-pressure liquid chromatography, is a powerful technique used to separate, ...

Mesaj Sütun Türevlendirme Reaksiyon Akış Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sütunlar kullanma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Paralel Segment Akış Sütun Tuning ve Multipleks Algılama etkinleştirme

Akış Sütun Perde: Verimliliği ve Duyarlılık Optimizasyonu

A Robust Method for Packing High Resolution C18 RP-nano-HPLC Columns

FlashPack Yaklaşımı ile Basit Şirket İçi Ultra Yüksek Performanslı Kılcal Sütun Üretimi

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Column Chromatography

Kolon Kromatografisinin Prensipleri

Kolon Kromatografisi Çeşitleri

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi: Giriş

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi: Giriş