This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Dikkat: (metanol, yani MSDS) kullanmadan önce tüm malzeme ve reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) bakınız. çözücüler ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) yıkayıcı işlerken tüm uygun güvenlik uygulamalarının kullanımını sağlamak. HPLC, analitik terazi ve dedektör enstrümantasyon mühendislik kontrollerinin uygun kullanımını sağlamak ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı parmak ayakkabı) kullanımını sağlamak. Not: Bu protokol, ilgi konusu bir kimyasal bileşiğin doğası özgü, farklı bir reaktif ile reaksiyonu akış kolon sonrası türevlendirme 3 yöntem (RF-PCD) teknikleri açıklanmaktadır. ROS analizi için &quot;floreskamin kullanarak birincil aminler 2. Tespiti&quot; bölümüne bakın birincil aminler analizi için, &quot;ROS 1. Tespit DPPH • kullanarak&quot; bölümüne gidin ve fenolik bileşiklerin analizi için bölüm &quot;3 gidin . fenollerin algılama4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürünü &quot;seçeneğini kullanarak. boyunca ultra saf su (örneğin, Milli-Q su) kullanınız. Not: RF sütunun bağlantısı önemli bir fark, bir RF kolonu üzerinde son parçaları sayısı olmak geleneksel bir HPLC kolonu ile hemen hemen aynı şekilde elde edilir. HPLC sistemi standart bir HPLC kolonu bağlamak için kullanılan Bağlantı HPLC sistemine RF sütun bağlamak için kullanılabilir edebiliyoruz. 1. ROS Algılama DPPH • Kullanımı <ol><li> HPLC aletinin kurmak <ol><li> A hattı% 100 su ve mobil faz olarak, B hattı üzerindeki% 100 metanol ile HPLC aleti hazırlayın. üreticinin ihtiyaçlarına göre pompaları temizleyin. </li><li> HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, ek bir türetme pompa ayarlayın. </li><li> 520 nm&#39;lik bir dalga uzunluğunda analiz edilmesi, UV-Vis detektörü ayarlayın. </li></ol></li><li> Kadar ayarlayınRF sütunu <ol><li> HPLC aleti RF sütununun girişine bağlayın. </li><li> RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın. </li><li> 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak UV-Vis detektörü bir çıkış çevre portunu. </li><li> RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına DPPH • Pompa hattı bağlayın. </li><li> Bir sütun tıpa kullanarak RF sütunun çıkışında kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin. </li><li> 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı B -% 100 metanol. </li><li> Bir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 metanol hareketli faz ile sütun dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklenebilir olmalıdır. </li></ol></li><li> DPPH • ayıracın hazırlanması <ol><li> Metanol DPPH • bir 0.1 mg / ml çözelti hazırlayın. </li&gt; <li> 10 dakika boyunca DPPH • reaktifı ihtiva eden şişenin sonikasyon. </li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo balon örtün. </li><li> Üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanan DPPH • reaktif ile DPPH • Pompayı temizleyin. </li></ol></li><li> RF kolon çıkışı Tuning <ol><li> Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin. </li><li> 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak. </li><li> merkez liman gemi yeniden tartmak ve aşağıdaki gibi merkezi bağlantı noktasından akışının ağırlığı hesaplamak: Merkez Liman Gemi başlangıç ​​Ağırlık (g) - Merkez Port (g) Ağırlık Orta Liman Gemi (g) Nihai Ağırlık = </li><li> Tekrarlayın UV-Vis RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve periferik liman gemisi olarak ağırlığını hesaplamak olduğunu çıkan atığın için 1.4.2 ve 1.4.3 adımlarıaşağıdaki gibidir: Periferik Liman Gemi başlangıç ​​Ağırlık (g) - Çevresel Port (g) Ağırlık Periferik Liman Gemi (g) Nihai Ağırlık = </li><li> aşağıdaki şekilde, merkezi ve periferik bağlantı noktaları gelen akış yüzdesini hesaplayın: % Merkezi Port Central Port (g) = Ağırlık / (Merkez Limanı (g) + Çevresel Port (g) Ağırlık Ağırlık) x 100 % Periferik Liman Periferik Port (g) = Ağırlık / (Merkez Limanı (g) + Çevresel Port (g) Ağırlık Ağırlık) x 100 </li><li> merkezi akış ve çevresel akış arasındaki segmentasyon oranını sağlamak 30:70 (: periferik santral) &#39;dir. orta akış% 30 üzerinde ise, merkezi bağlantı çıkışına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarını azaltır. merkezi akış% 30 altında ise merkez limanından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır. </li><li> (: Periferik santral) elde edilir 30:70 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 1.4.1 1.4.6 için. </li><li> D akış hızını ayarlama0.5 ml dk -1 PPK • reaktif pompası. Not: DPPH • reaktif ile kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir. </li></ol></li><li> Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları <ol><li> Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten enjekte edildikten sonra, türetme reaktif pompa akışını durdurun. </li><li> Periferik bağlantı noktasından DPPH • reaktif pompa satırını kaldırın ve bağlantı noktası tıpalayın. </li><li> Mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika için izin depolanacak olan mobil faz ile sütun dengelenmesi. </li><li> HPLC cihazı üzerinde mobil faz pompanın akışını durdurun. </li><li> Metanol ile DPPH • reaktifi değiştirin ve ilave pompa temizlemek. Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir. </li></ol></li></ol> Fluoresc kullanılarak primer aminlerin 2. Tespitamin <ol><li> Mobil faz hazırlanması <ol><li> hacme seyreltme öncesi 5 M amonyum hidroksit ile 9.0&#39;a çözeltinin pH&#39;ının ayarlanmasını, 10 mM amonyum asetat çözeltisi bir 1 L hazırlayın. </li><li> 95:05 (: ACN tamponu) bir önceden karıştırılmış mobil faz elde etmek için amonyum asetat tampon asetonitril (ACN) ve 52.6 ml ilave edilir. </li></ol></li><li> HPLC aletinin kurmak <ol><li> mobil faz olarak A hattı üzerindeki önceden karıştırılmış hazırlanan tampon ile HPLC cihazı hazırlayın. üreticinin ihtiyaçlarına göre pompayı temizleyin. </li><li> HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, ek bir türetme pompa ayarlayın. </li><li> türetme pompasına bir darbe dampener bobin takın. </li><li> Ayar floresans dedektörü (FLD) 475 nm 390 nm ve emisyon dalga bir eksitasyon dalga boyu ile. </li></ol></li><li> RF sütunun kurmak <ol><li> th bağlayınHPLC aleti RF sütunun e girişi. </li><li> RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın. </li><li> 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak FLD detektöre RF sütunu bir çıkış çevre portunu. </li><li> RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına türetme pompa hattı bağlayın. </li><li> Bir sütun tıpa kullanarak RF sütunun çıkışında kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin. </li><li> 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı A -% 5 ACN ile önceden karıştırılmış, 10 mM amonyum asetat tampon pH 9. </li><li> Bir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 A hattı hareketli faz ile sütun dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklendirilebilir. </li></ol></li><li> Floreskamin ayıracın hazırlanması <ol><li> Bir 0.1 mg mi -1 floreskamin reaktif 100 ml olun. </li> &lt;1 dakika boyunca li&gt; sonikasyon. </li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. </li><li> üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış floreskamin reaktif ile reaktif pompasını temizleyin. </li></ol></li><li> RF kolon çıkışı Tuning <ol><li> Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin. </li><li> 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak. </li><li> Merkezi damar yeniden tartın ve aşama 1.4.3 şu şekilde merkez limanından akış ağırlığı hesaplamak. </li><li> Tekrarlayın RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve adım 1.4.4 şu şekilde periferik için ağırlığı hesaplamak olduğunu FLD çıkan atığın için 2.5.3 için 2.5.2 adımları. </li><li> Adım 1.4.5 şu şekilde santral ve periferik limanlarından gelen akış yüzdesini hesaplayın. </li><li> merkezi akış ve periferik arasındaki segmentasyon oranını sağlamakAkış 43:57 (: periferik santral) &#39;dir. orta akış% 43 üzerinde ise, merkezi bağlantı çıkışına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarını azaltır. orta akış% 43 altında ise, merkezi bağlantı noktasından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır. </li><li> (: Periferik santral) elde edilir 43:57 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 2.5.1 2.5.6 için. </li><li> 0.7 mi dakika mobil faz pompa akış hızını ayarlama -1. </li><li> 0.1 ml dk akış türetme pompa ayarlama -1. Not: floreskamin reaktif ile kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir. </li></ol></li><li> Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları <ol><li> Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten enjekte edildikten sonra, türetme pompayı durdurun. </li><li> Periferik liman ve stoper gelen türetme pompa hattını sökün. </li><li> mobil fazda ile kolon dengeyebu da mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika boyunca izin vererek saklanacaksa. </li><li> mobil faz pompanın akışını durdurun. </li><li> asetonitril ile floreskamin reaktifi değiştirin ve türetme pompasını temizlemek. Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir. </li></ol></li></ol> 4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanür kullanılması Fenollerin 3. Algılama <ol><li> Mobil faz hazırlanması <ol><li> hacme seyreltme öncesi 5 M amonyum hidroksit ile 9.0&#39;a çözeltinin pH&#39;ının ayarlanmasını, 100 mM bir amonyum asetat çözeltisi bir 1 L hazırlayın. </li><li> (: Metanol tamponu) 5: 95 bir önceden karıştırılmış mobil faz elde etmek için amonyum asetat tampon metanol 52.6 ml ekleyin. </li></ol></li><li> HPLC aletinin kurmak <ol><li> mobil faz olarak A hattı üzerindeki önceden karıştırılmış hazırlanan tampon ile HPLC cihazı hazırlayın. üretici başına kadar pompayı Temizle &#39;; S gereksinimleri. </li><li> HPLC aracı bileşenleri ve Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi iki ilave belirteci pompaları ayarlayın. </li><li> reaktif pompalarının her birine bir darbe dampener bobin takın. </li><li> 500 nm&#39;lik bir dalga uzunluğunda analiz edilmesi, UV-Vis detektörü ayarlayın. </li></ol></li><li> RF sütunun kurmak <ol><li> HPLC aleti RF sütununun girişine bağlayın. </li><li> RF sütunu merkezi çıkış limanına 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda bağlayın. </li><li> 0.13 mm ID tüp içinde 15 cm uzunluğunda kullanılarak UV-Vis detektörü RF sütunu bir çıkış çevre portunu. </li><li> Her reaktifi (yani, 4-aminoantipiren ve potasyum ferrisiyanürle) RF sütunun çıkışına bir çevresel bağlantı noktasına pompa hattı bağlayın. </li><li> 1 mi dak HPLC pompası akış oranı getirmek -1% 100 hattı A -% 5 metanol ile önceden 100 mM amonyum asetat tampon pH 9. </li><li> w sütunu dengeyeBir 4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk sütun için 10 dakika boyunca% 100 A hattı mobil faz i. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre ölçeklendirilebilir. </li></ol></li><li> 4-aminoantipiren ayıracın hazırlanması <ol><li> adım 3.1.1 izleyerek 9 bir pH değerine sahip bir amonyum asetat tamponu hazırlayın. </li><li> 150 mg kadar 4-aminoantipiren tartılır ve hazırlanan amonyum asetat tamponu (pH 9), 100 ml içinde çözülür. </li><li> 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. </li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo ile örtün. </li><li> üreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış 4-aminoantipiren reaktif ile ilk reaktif pompasını temizleyin. </li></ol></li><li> Potasyum ferrisiyanür ayıracın hazırlanması <ol><li> potasyum ferrisiyanür 150 mg ağırlığında ve adım 3.1.1 göre hazırlanan amonyum asetat tamponu, 100 ml (pH 9) içinde çözülür. </li><li> 1 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır. </li><li> Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo örtün. </li><li> Purgüreticinin ihtiyaçlarına göre hazırlanmış potasyum ferrisiyanür reaktif ile e ikinci reaktif pompası. </li></ol></li><li> RF sütunun Tuning <ol><li> Doğru iki temiz ve kuru damarları tartın. bir merkezi olarak gemi ve periferik gibi diğer etiketleyin. </li><li> 1.0 dakika boyunca orta etiketli kabın içine orta noktasını çıkan atık toplamak. </li><li> Merkezi damar yeniden tartın ve aşama 1.4.3 şu şekilde merkez limanından akış ağırlığı hesaplamak. </li><li> Tekrarlayın UV-Vis RF sütunun çevresel bağlantı noktasına bağlı ve adım 1.4.4 şu şekilde periferik için ağırlığı hesaplamak olduğunu çıkan atığın için 3.6.3 için 3.6.2 adımları. </li><li> Adım 1.4.5 şu şekilde santral ve periferik limanlarından gelen akış yüzdesini hesaplayın. </li><li> merkezi akış ve çevresel akış arasındaki segmentasyon oranını sağlamak 50:50 (: periferik santral) &#39;dir. orta akış% 50 üzerinde ise, azaltmakçıkış, merkezi noktasına 0.13 mm ID tüp uzunluğu eklenerek çıkan akış miktarı. orta akış% 50 altında ise, merkezi bağlantı noktasından 0,13 mm boru uzunluğunu azaltır. </li><li> (: Periferik santral) elde edilir 50:50 bir segmentasyon oranı kadar adımı yineleyin 3.6.1 3.6.6 için. </li><li> 0.5 mi dakika 4-aminoantipiren pompa akış hızını ayarlama -1. </li><li> 0.25 mi dk potasyum ferrisiyanür pompa akış hızını ayarlama -1. Not: İki bileşenli reaktif kurmak RF sütun artık analiz için hazırdır. Örnekler hemen enjekte edilebilir. </li></ol></li><li> Mesaj çalıştırmak kapatma koşulları <ol><li> Numunelerin tüm çalışma bittikten belirten bittikten çalışma enjekte edildikten sonra, reaktif pompaları hem dur. </li><li> Periferik limanlarından reaktif pompa satırları kaldırın ve 0,13 mm boru 15 cm parça ile değiştirin. </li><li> WHI mobil faz ile sütun dengeyeCH mobil faz 1 ml dk sütun üzerinden geçirmek için -1, 10 dakika boyunca izin vererek saklanacaksa. </li><li> HPLC cihazı üzerinde mobil faz pompanın akışını durdurun. </li><li> Değiştir hem ayıraç reaktifler metanol ile pompa ve üretici şartının gibi ek pompaları temizlemek. Not: HPLC sistemi şimdi kapanma olabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Srijaranai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+1-(2-pyridylazo)-2-naphthol+as+the+post+column+reagent+for+ion+exchange+chromatography+of+heavy+metals+in+environmental+samples.">Use of 1-(2-pyridylazo)-2-naphthol as the post column reagent for ion exchange chromatography of heavy metals in environmental samples.</a> Microchem. J. 99, 152-158 (2011).</li><li>Kubickova, A., Kubicek, V., Coufal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV-VIS+detection+of+amino+acids+in+liquid+chromatography:+online+post-column+solid-state+derivatization+with+Cu(II)+ions.">UV-VIS detection of amino acids in liquid chromatography: online post-column solid-state derivatization with Cu(II) ions.</a> J Sep Sci. 34, 3131-3135 (2011).</li><li>Quinto, M., Spadaccino, G., Palermo, C., Centonze, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+aflatoxins+in+cereal+flours+by+solid-phase+microextraction+coupled+with+liquid+chromatography+and+post-column+photochemical+derivatization-fluorescence+detection.">Determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection.</a> J. Chromatogr. A. 1216, 8636-8641 (2009).</li><li>Lee, M., Lee, Y., Soltermann, F., von Gunten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+N-nitrosamines+and+other+nitro(so)+compounds+in+water+by+high-performance+liquid+chromatography+with+post-column+UV+photolysis/Griess+reaction.">Analysis of N-nitrosamines and other nitro(so) compounds in water by high-performance liquid chromatography with post-column UV photolysis/Griess reaction.</a> Water Res. 47, 4893-4903 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+isoflavonoids+in+Radix+Puerariae+for+quality+control+using+on-line+high+performance+liquid+chromatography-diode+array+detector-electrospray+ionization-mass+spectrometry+coupled+with+post-column+derivatization.">Identification of isoflavonoids in Radix Puerariae for quality control using on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionization-mass spectrometry coupled with post-column derivatization.</a> Food Res Int. 48, 528-537 (2012).</li><li>Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography+coupled+to+on-line+post+column+derivatization+for+the+determination+of+organic+compounds:+a+review+on+instrumentation+and+chemistries.">Liquid chromatography coupled to on-line post column derivatization for the determination of organic compounds: a review on instrumentation and chemistries.</a> Anal. Chim. Acta. 798, 1-24 (2013).</li><li>Dousa, M., Brichac, J., Gibala, P., Lehnert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hydrophilic+interaction+chromatography+determination+of+lysine+in+pharmaceutical+preparations+with+fluorescence+detection+after+postcolumn+derivatization+with+o-phtaldialdehyde.">Rapid hydrophilic interaction chromatography determination of lysine in pharmaceutical preparations with fluorescence detection after postcolumn derivatization with o-phtaldialdehyde.</a> J Pharm Biomed Anal. 54, 972-978 (2011).</li><li>Iijima, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Online+Post-Column+Derivatization+System+for+Ultra+High-Performance+Liquid+Chromatography+(UHPLC)+and+Its+Applications+to+Analysis+of+Biogenic+Amines.">Optimization of an Online Post-Column Derivatization System for Ultra High-Performance Liquid Chromatography (UHPLC) and Its Applications to Analysis of Biogenic Amines.</a> Anal Sci. 29, 539-545 (2013).</li><li>Cunico, R. L., Schlabach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Ninhydrin+and+o-Phthalaldehyde+Postcolumn+Detection+Techniques+for+High+Performance+Liquid+Chromatography+of+Free+Amino.">Comparison of Ninhydrin and o-Phthalaldehyde Postcolumn Detection Techniques for High Performance Liquid Chromatography of Free Amino.</a> J. Chromatogr. A. 1983, 461-470 (1983).</li><li>Donahue, E. P., Brown, L. L., Flakoll, P. J., Abumrad, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Measurement+of+Leucine-specific+Activity+in+Biological+Fluids+by+Ion-exchange+Chromatography+and+Post-column+Ninhydrin+Detection.">Rapid Measurement of Leucine-specific Activity in Biological Fluids by Ion-exchange Chromatography and Post-column Ninhydrin Detection.</a> J. Chromatogr. A. 571, 29-36 (1998).</li><li>Udenfriend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescamine:+A+Reagent+for+Assay+of+Amino+Acids,+Peptides,+Proteins+and+Primary+Amines+in+the+Picomole+Range.">Fluorescamine: A Reagent for Assay of Amino Acids, Peptides, Proteins and Primary Amines in the Picomole Range.</a> Science. 1972, 871-872 (1972).</li><li>Samejima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+Fluorescamine+Derivitices+of+Aliphatic+Diamines+and+Polyamines+by+High+Speed+Liquid+Chromatography.">Separation of Fluorescamine Derivitices of Aliphatic Diamines and Polyamines by High Speed Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 96, 250-254 (1974).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+antioxidant+activity+of+ten+compounds+in+different+tea+samples+by+means+of+an+on-line+HPLC-DPPH+assay.">Evaluation of antioxidant activity of ten compounds in different tea samples by means of an on-line HPLC-DPPH assay.</a> Food Res Int. 53, 847-856 (2013).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+anti-oxidants+in+Flos+Chrysanthemi+by+HPLC-DAD-ESI/MS(n)+and+HPLC+coupled+with+a+post-column+derivatisation+system.">Identification of the anti-oxidants in Flos Chrysanthemi by HPLC-DAD-ESI/MS(n) and HPLC coupled with a post-column derivatisation system.</a> Phytochem Anal. 24, 59-68 (2013).</li><li>Raudonis, R., Bumblauskiene, L., Jakstas, V., Pukalskas, A., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+validation+of+post-column+assay+for+screening+of+radical+scavengers+in+herbal+raw+materials+and+herbal+preparations.">Optimization and validation of post-column assay for screening of radical scavengers in herbal raw materials and herbal preparations.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 7690-7698 (2010).</li><li>Raudonis, R., Raudone, L., Jakstas, V., Janulis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+post-column+free+radical+scavenging+and+ferric+reducing+antioxidant+power+assays+for+screening+of+antioxidants+in+strawberries.">Comparative evaluation of post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant power assays for screening of antioxidants in strawberries.</a> J. Chromatogr. A. 1233, 8-15 (2012).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Methimazole+in+Pharmaceutical+Preparations+using+an+HPLC+Method+Coupled+with+an+Iodine-Azide+Post-Column+Reaction.">Determination of Methimazole in Pharmaceutical Preparations using an HPLC Method Coupled with an Iodine-Azide Post-Column Reaction.</a> J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 32, 383-398 (2008).</li><li>Zakrzewski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+reversed-phase+HPLC+method+with+post-column+iodine-azide+reaction+for+the+determination+of+thioguanine.">Development and validation of a reversed-phase HPLC method with post-column iodine-azide reaction for the determination of thioguanine.</a> J. Anal. Chem. 64, 1235-1241 (2009).</li><li>Gritti, F., Guiochon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+measurements+of+the+true+column+efficiency+and+of+the+instrument+band+broadening+contributions+in+the+presence+of+a+chromatographic+column.">Accurate measurements of the true column efficiency and of the instrument band broadening contributions in the presence of a chromatographic column.</a> J. Chromatogr. A. 1327, 49-56 (2014).</li><li>Stewart, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post+cotumn+derivatization+methodology+in+high+performance+liquid+chromatography+(HPLC).">Post cotumn derivatization methodology in high performance liquid chromatography (HPLC).</a> Trends Anal. Chem. 1, 170-174 (1982).</li><li>Rigas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-column+labeling+techniques+in+amino+acid+analysis+by+liquid+chromatography.">Post-column labeling techniques in amino acid analysis by liquid chromatography.</a> Anal. Bioanal. Chem. 405, 7957-7992 (2013).</li><li>Frei, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+Detectors+in+Modern+Liquid+Chromatography.">Reaction Detectors in Modern Liquid Chromatography.</a> Chromatographia. 15, 161-166 (1982).</li><li>Pravadil-Cekic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Reaction+Flow+Chromatography+for+the+Analysis+of+Amino+Acid:+Derivatisation+With+Fluorescamine+Reagent.">Using Reaction Flow Chromatography for the Analysis of Amino Acid: Derivatisation With Fluorescamine Reagent.</a> Microchem. J. , (2015).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li><li>Koleva, I. I., Niederlander, H. A. G., van Beek, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+On-Line+HPLC+Method+for+Detection+of+Radical+Scavenging+Compounds+in+Complex+Mixtures.">An On-Line HPLC Method for Detection of Radical Scavenging Compounds in Complex Mixtures.</a> Anal Chem. 72, 2323-2328 (2000).</li><li>Selim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Two-component+Post-column+Derivatisation+Method+Utilsing+Reaction+Flow+Chromatography.">A Two-component Post-column Derivatisation Method Utilsing Reaction Flow Chromatography.</a> Microchem. J. 116, 87-91 (2014).</li><li>Bigley, F. P., Grob, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phenols+in+Water+and+Wastewater+by+Post-column+Reaction+Detection+High-performance+Liquid+Chromatography.">Determination of Phenols in Water and Wastewater by Post-column Reaction Detection High-performance Liquid Chromatography.</a> J. Chromatogr. A. 350, 407-416 (1985).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaction+flow+chromatography+for+rapid+post+column+derivatisations:+The+analysis+of+antioxidants+in+natural+products.">Reaction flow chromatography for rapid post column derivatisations: The analysis of antioxidants in natural products.</a> J. Chromatogr. A. 1303, 62-65 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RF-PCD bant genişletilmesi etkilerinin en aza indirilmesi ve ayırma performansını artırmak, reaksiyon bobinler kullanılmadan HPLC atık sonrası sütun ile türetme reaktif verimli karıştırma sağlar. RF-PCD yöntemler de tespit yöntemi ile ilgili olarak, sinyal yanıt olarak iyileşme göstermiştir. Camenzuli ve ark., 28 espresso kahve numunesinde ROS tespiti için DPPH • reaksiyon akış sütun kullandığını rapor için ilk oldu. Yaptıkları çalışmada çeşitli DPPH <...

Kolon sonrası türevlendirme (PCD) ile birleştirilen yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analiz laboratuarda bir dizi konu çözümünde yararlı olan güçlü bir araçtır. Bu, 1,2 uygun dedektörler paketi ile başka bir tespit edilemeyen bileşikler tespit seçici saptanması ve nicelenmesi 3-5 alt sınırları sağlar veya hedef analitin sinyal geliştirmek için kullanılabilir önlemek için bir hedef analitin türetmek matriks etkileri 6. Yaygın olarak kullanılan PCD reaksiyonları 9,10 veya floreskamin 11,12, 2,2-difenil-ile reaktif oksijen türlerinin türetme (ROS) ninhidrin orto-phthaladehyde 7-9 olan amino asitler gibi aminlerin reaksiyonu içerir 1-picrylhydrazil kökü (DPPH) • 13,14 veya 2,2&#39;-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit (ABTS) 15,16 ve sülfür c türetmek için iyodid-azit belirteci kullanılmasıiçeren gruptur bileşikler 17,18. HPLC sistemleri 6 PCD reaksiyonlarının kullanılması ile pek çok dezavantajları, ancak vardır. Prensip olarak, bu arasında karıştırılması ve reaksiyon, 8 oluşması için zaman tanımak türetme reajan (lar) ve dedektör, ilave alanına arasındaki reaksiyon, rulo kullanılmasıdır. Bu reaksiyon genellikle HPLC sistemi 19 geri kalan hacmi ile karşılaştırıldığında önemli 500 ul ya da daha fazla, hacimleri var döngüler. Bu yüksek hacim, reaksiyon bölgesinin kullanımı Reaksiyon bağın varlığı olmaksızın gözlenebilir etkilere kıyasla artırılmış tepe genişletilmesi sonuçları döngüler. Bu kantitatif ve algılama yüksek sınırları var kısa, daha geniş zirveleri ile sonuçlanır ve olumsuz kromatografik çözünürlüğü etkiler. 1 Rakamlar ve 2 farklı sonrası kolon reaksiyon döngü hacimlerinin yanı sıra kaynaklanan pik şeklinin bozulmasını vurgulayın. Bu analiz,bir cep 94% metanol faz bileşimi ve% 6 Milli-Q su ile yapıldı. Hareketli fazın akış oranı 1 ml / dak, enjeksiyon hacmi 20 ul ve analiz dalga boyu 265 nm idi. 20 ul 1.000 ul ölü hacimleri değişen Rulo sütun ve PCD yöntemleri reaksiyon döngü ölü hacim etkilerini simüle etmek için dedektör arasına yerleştirildi. Bu ilmekler, 0.5 mm iç çapa sahip, paslanmaz çelik boru hazırlandı. Deney, denetleyici (SCL-10AVP) &#39;den oluşan bir HPLC sistemi üzerinde gerçekleştirilmiştir, bir düşük basınç Gradyan Vana (FCL-10ALVP), bir pompa (LC-20AD), bir enjektör (SIL-10ADVP) ve PDA dedektör ( SPD-M10ADVP). Mobil faz önce HPLC sistemine sokulmadan bir faz giderme yoluyla pompalanmıştır. Ayırma 250 mm x 4.6 mm İD 5 um kolonu kullanılarak gerçekleştirildi. Deney koşulları en son literatürde yayınlanmıştır PCD reaksiyonlar tipik olarak seçilmiştir. En basit, en yaygın sonrası kolon reaktör kurulum etkili bir sıvı akabilir ve reaksiyon gerçekleşebilir hangi aracılığıyla uzun, ince bir tüp olmayan bir parçalı boru şeklinde reaktör denir. Bu sistem, zirve genişleme sadece sisteme eklenen ölü hacim değil, aynı zamanda lijima ve arkadaşları. 8 tarafından belirtildiği gibi borunun iç çapına bağlıdır. Ayrıca, bobin geometrisi gözlenen marka genişlemesi bir rol oynar. Reaktörün sarma ölü hacim minimize edilebilir, yani daha iyi bir karıştırma sonucu, ikincil akış profilleri değiştirir Stewart 20 belirtti. 21 bobin örme açık boru şeklinde kullanırken pik genişlemesi önemli olmadığı ifade edilmiştir. Pik genişletilmesi aşırı büyük olduğunda, başka reaktör tipleri de 20,22 düşünülebilir. Bunlar yatak reaktörleri veya parçalı akış reaktörleri içerebilir. Bu reaktörler, ki bunlar aksi takdirde requir olur yavaş reaksiyonlar için özellikle yararlı olane&#39;nin büyük tepki döngüler. olmayan parçalı boru şeklinde reaktörler PCD uygulamalarında kullanılan reaktörlerin en yaygın türleri, reaktör kurulum bu tür ile bu makalede fırsatlar geri kalanı gibi. Reaksiyon akışı (RF) sütunun tasarımı mobil faz dış bulunan radyal merkez kolonun bölge veya üç limanlarında bulunan tek bir bağlantı noktası aracılığıyla ya sütunu çıkmak (veya girmek) için izin veren bir çok portlu sonu uydurma içermektedir sütunun duvar kısmı (bakınız Şekil 3). Bu iki akım deliklerden dışarı uzanan bir dış gözenekli cam malzeme ile çevrili da bir su geçirmez halka tarafından çevrelenen bir merkezi gözenekli cam malzeme ihtiva eden bir uç teçhizatı kullanılarak ayrılır. Santral geçirmeyen bir halka çapraz akışına iki gözenekli bölgeler arasında mümkün değildir. Reaksiyon akış kromatografisi sırasında, türetme reaktif (ler) bir veya TW olarak mobil faz akış yönüne karşı pompalanırReaksiyon akış sütunun dış limanlarından o. Elüsyon maddesi serbest bir dış port üzerinden dış frit türetme reajan (lar) ile karıştırılmış ve dedektör geçirilir. Reaksiyon akımı ya tek reaktif türetme için kullanılabilir ya da ikili bir madde sistemi (türevlendirme reaktifleri 2 portu ve 1 bağlantı noktası (türetme reaktifin 1 bağlantı noktasına 1 bağlantı dedektörü ve 1 bağlantı bloke kolon eluent geçmek için) ) dedektöre sütun eluent geçmektedir. Merkezi akıştan akış ya da türetilmemiş Elüsyon maddesi etkin çoklayıcı algılama 23 ya da atık geçer tespit etmek için kullanılabilir. RF-PCD kromatografisi çalışan santral ve periferik akımlarının oranı olduğunda kullanılabilir bir büyük ayar tekniği. Her bir türetme için en uygun oranı, merkezi akış tespit edilmesi veya atık geçilecek olmadığı gibi bir dizi faktöre bağlıdır. Bu nedenle, optimum oranı tespit edildikten sonra, Doğru akım oranı her çalışma gerçekleştirildiğini önce elde edilir sağlanmalıdır. Bir cam hamuru kullanımı Elüsyon maddesi akışı ve tipik olarak sıfır ölü hacim T parçasını ya da düşük bir ölü hacmi kullanılması, geleneksel karıştırma teknikleri ile karşılaştırıldığında, daha etkili karıştırma RF-PCD sonuçlarında türetme reaktif karışımı olduğu bulunmuştur W- parça iki akışları karıştırmak için. Bu nispeten küçük Reaksiyon döngüleri kullanımı için izin verilen ya da tamamen reaksiyon, döngünün bile ortadan kaldırılması yer alır. Geleneksel sonrası sütun türevlendirme yöntemlerine göre daha keskin zirveleri reaksiyon döngü boyutu sonuçlarının azaltılması. Bu, tüm sütun elüsyon türetilmiş olmasına rağmen, gürültü oranı daha büyük bir sinyal gözlenir ve saptanması ve nicelenmesi dolayısıyla alt sınırları elde edilebilir olduğu anlamına gelir. Reaksiyon akış kromatografisi PCD reaksiyon adaptasyonu ile zorlukların üstesinden gelmek için geliştirilmiştirnedeniyle büyük hacimli reaksiyon döngüler istihdam ihtiyacı nedeniyle büyük yazılan sütun ölü hacimleri modern HPLC kolon ve sistemleri, genişletilmesi bant kaynaklanan verimlilik özellikle kaybına s. Geleneksel PCD göre RF-PCD daha verimli karıştırma işlemleri daha az, reaksiyon döngüsü hacimleri gözlenen ayırma veriminde bir artışa yol kullanılabilir anlamına gelir. Ayrıca, RF-PCD kromatografisi her iki sinyal artan geleneksel PCD yöntemlerine göre saptanması ve nicelenmesi alt sınırları ile sonuçlanan klasik PCD tekniklere kıyasla gürültü azalması gösterir. Geleneksel PCD yöntemlerine göre RF PCD ilave bir avantajı, RF sütun merkez noktası olarak kolonun çevre bölgesinde elute olur türevlendirilmiş akımından ayrılır be türetilmemiş akışı izleme yeteneği. RF-PSD geleneksel PCD yöntemlerine göre birçok avantaj görüntüler nispeten yeni ama gelecek vaat eden bir tekniktir. <p class="jove_content"&gt; RF sütunun bağlantısı önemli bir fark, bir RF kolonu üzerinde son parçaları sayısı olmak geleneksel bir HPLC kolonu ile hemen hemen aynı şekilde elde edilir. HPLC sistemi standart bir HPLC kolonu bağlamak için kullanılan Bağlantı HPLC sistemine RF sütun bağlamak için kullanılabilir edebiliyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HPLC instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>1290 Series HPLC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Pump(s) for derivatisation system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>LC-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF colum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z227307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column stoppers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided with column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tube cutter</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z290882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Scale Balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4-point analytical balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop watch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-Scientific equiptment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eluent collection vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will depend on instrument used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Laboratory glassware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPPH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescamine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F9015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoantipyrene&#160;</td>
			<td>Acros Organics BVBA</td>
			<td>AC103151000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferricyanide&#160;</td>
			<td>AnalaR</td>
			<td>B10204-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

post column derivatization using reaction flow high performance liquid chromatography columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

RF-PSD tarafından kullanılmak üzere uyarlanmıştır ilk PCD yöntemi 2,2-difenil-1-picrylhydrazil kökü (DPPH) • 24 ile antioksidanların türetilmesi olmuştur. Bu reaksiyon. Koleva ve ark 25 tanıtıldı ve yaygın beri kullanılmaktadır. Algılama, reaktif oksijen türlerinin varlığında, radikal DPPH • renksizleşme, gözlenen absorbans bir damla antioksidanlar sonuçlar dolayısıyla varlığına dayanır. DPPH • Reaksiyon genell...

Watch this Scientific Journal Video about Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns at JoVE.com

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Mesaj Sütun Türevlendirme Reaksiyon Akış Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sütunlar kullanma

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

post-column-derivatization-using-reaction-flow-high-performance

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Chemistry

Unit 1

Principles of Chromatography

SCIENTISTS IN ACTION

14.9K Görüntüleme.  University of Western Sydney. A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Video: Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Kimya

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Paralel Segment Akış Sütun Tuning ve Multipleks Algılama etkinleştirme

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Akış Sütun Perde: Verimliliği ve Duyarlılık Optimizasyonu

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Synthesis of Programmable Main-chain Liquid-crystalline Elastomers Using a Two-stage Thiol-acrylate Reaction

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline elastomers (LCEs) with facile control over network structure and programming of an aligned monodomain. Tailored LCE networks were synthesized using routine mixing of commercially available starting materials and pouring monomer solutions into molds to cure. An initial polydomain LCE network is formed via a self-limiting thiol-acrylate Michael-addition reaction. Strain-to-failure and glass transition behavior were investigated as a function of crosslinking monomer, pentaerythritol tetrakis(3-mercaptopropionate) (PETMP). An example non-stoichiometric system of 15 mol% PETMP thiol groups and an excess of 15 mol% acrylate groups was used to demonstrate the robust nature of the material. The LCE formed an aligned and transparent monodomain when stretched, with a maximum failure strain over 600%. Stretched LCE samples were able to demonstrate both stress-driven thermal actuation when held under a constant bias stress or the shape-memory effect when stretched and unloaded. A permanently programmed monodomain was achieved via a second-stage photopolymerization reaction of the excess acrylate groups when the sample was in the stretched state. LCE samples were photo-cured and programmed at 100%, 200%, 300%, and 400% strain, with all samples demonstrating over 90% shape fixity when unloaded. The magnitude of total stress-free actuation increased from 35% to 115% with increased programming strain. Overall, the two-stage TAMAP methodology is presented as a powerful tool to prepare main-chain LCE systems and explore structure-property-performance relationships in these fascinating stimuli-sensitive materials.

A novel methodology is presented to synthesize and program main-chain liquid-crystalline elastomers using commercially available starting monomers. A wide range of thermomechanical properties was tailored by adjusting the amount of crosslinker, while the actuation performance was dependent on the amount of applied strain during programming.

Bir iki-aşamalı Tiol akrilat reaksiyonu kullanılarak programlanabilir ana zincirli Sıvı kristal Elastomerler sentezi

This study presents a novel two-stage thiol-acrylate Michael addition-photopolymerization (TAMAP) reaction to prepare main-chain liquid-crystalline ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

Yüksek basınçlı Sıvı Kromatografi ile Glukosinolat Ekstraksiyon ve Analiz A Basit Yöntemi (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and related diseases, but their precise measurement is still a challenge. Many protocols have been described for neurotransmitter measurement by a variety of instruments, including high-pressure liquid chromatography (HPLC). However, there are shortcomings, such as complicated operation or hard-to-detect multiple targets, which cannot be avoided, and presently, the dominant analysis technique is still HPLC coupled with sensitive electrochemical or fluorimetric detection, due to its high sensitivity and good selectivity. Here, a detailed protocol is described for the pretreatment and detection of catecholamines with high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ECD) in real urine samples of infants, using electrospun composite nanofibers composed of polymeric crown ether with polystyrene as adsorbent, also known as the packed-fiber solid phase extraction (PFSPE) method. We show how urine samples can be easily precleaned by a nanofiber-packed solid phase column, and how the analytes in the sample can be rapidly enriched, desorbed, and detected on an ECD system. PFSPE greatly simplifies the pretreatment procedures for biological samples, allowing for decreased time, expense, and reduction of the loss of targets. 
Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for solid-phase extraction coupled to an HPLC-ECD system for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters (norepinephrine (NE), epinephrine (E), dopamine (DA)) and two of their metabolites (3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (DOPAC)) in infants' urine. The established protocol was applied to assess the differences of urinary catecholamines and their metabolites between high-risk infants with perinatal brain damage and healthy controls. Comparative analysis revealed a significant difference in urinary MHPG between the two groups, indicating that the catecholamine metabolites may be an important candidate marker for early diagnosis of cases at risk for brain damage in infants.

We present a convenient solid-phase extraction coupled to high-pressure liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection (ECD) for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters and two of their metabolites in infants' urine. We also identify the metabolite MHPG as a potential biomarker for the early diagnosis of brain damage for infants.

Ayıklama ve çözümleme katekoiamin nörotransmitter ve onların metabolitleri yüksek basınçlı sıvı Kromatografi ile uygun bir yöntem

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and cost savings through the &#34;scaling out&#34; strategy as opposed to the traditional &#34;scaling up&#34;. Herein, we report the reaction of diphenyldiazomethane with p-nitrobenzoic acid in both batch and flow modes. To effectively transfer the reaction from batch to flow mode, it is essential to first conduct the reaction in batch. As a consequence, the reaction of diphenyldiazomethane was first studied in batch as a function of temperature, reaction time, and concentration to obtain kinetic information and process parameters. The glass flow reactor set-up is described and combines two types of reaction modules with &#34;mixing&#34; and &#34;linear&#34; microstructures. Finally, the reaction of diphenyldiazomethane with p-nitrobenzoic acid was successfully conducted in the flow reactor, with up to 95% conversion of the diphenyldiazomethane in 11 min. This proof of concept reaction aims to provide insight for scientists to consider flow technology&#39;s competitiveness, sustainability, and versatility in their research.

Continuous Flow Chemistry: Reaction of Diphenyldiazomethane with p-Nitrobenzoic Acid

Flow chemistry carries environmental and economic advantages by leveraging superior mixing, heat transfer and cost benefits. Herein, we provide a blueprint to transfer chemical processes from batch to flow mode. The reaction of diphenyldiazomethane (DDM) with p-nitrobenzoic acid, conducted in batch and flow, was chosen for proof of concept.

Sürekli akışı kimya: Diphenyldiazomethane p- Nitrobenzoic asit tepki

Continuous flow technology has been identified as instrumental for its environmental and economic advantages leveraging superior mixing, heat transfer and ...