This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.

Not: Bu protokol mültipleksli tespiti için birden fazla dedektörleri ile birleştiğinde bir HPLC sistemi üzerinde bir PSF sütununu nasıl kullanılacağı ile ilgili talimatları içerir. Protokol okuyucu varsayarak kromatografi ve çeşitli HPLC algılama yöntemleri temel bilgi ve deneyime sahiptir yazılmıştır. Dikkat: (metanol, yani MSDS) kullanmadan önce tüm malzeme ve reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) bakınız. Çözücüler ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) yıkayıcı işlerken tüm uygun güvenlik uygulamalarının kullanımını sağlamak. HPLC, analitik terazi ve dedektör enstrümantasyon mühendislik kontrolleri uygun kullanımını sağlamak ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı ayakkabı ayak) kullanımını sağlamaktadır. HPLC Enstrüman 1. Setup <ol><li> Lin için, aşırı saf su (örneğin,% 100 Milli-Q su) HPLC aleti hazırlayıne A ve mobil faz olarak B hattı için% 100 metanol ve üretici şartının olarak pompalar temizlemek. Kullanılan dedektörlerin biri MS ise burada olduğu gibi, hem mobil fazlar A ve B için% 0.1 formik asit eklemek </li><li> Dedektör ve sütun arasındaki ölü hacmi en aza indirmek amacıyla, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi HPLC enstrümantal parça ve dedektörler ayarlayın. Bu sütuna göre dedektörlerin uygun yerleştirilmesi gerekir. HPLC sistemi yapılandırmasında esneklik istenmektedir. </li></ol> UV-Vis ve MS Dedektörleri 2. Kurulum <ol><li> İlgili örnek (örneğin, 280 nm) bağlı istenen dalga boyuna UV-Vis detektörü ayarlayın. </li><li> Tam Tarama algılama yöntemi kullanılarak toplam İyon Sayısı (TIC) analizi için pozitif modda MS dedektörü ayarlayın. Ayrıca buna göre aşağıdaki MS parametrelerini ayarlamak: buharlaştırıcı sıcaklığı 500 60 birimlik bir oranda, yardımcı gaz akışı ayarlanır ° C, kılcal sıcaklığı 350 ° C, kılıf gaz40 ve 5 adet gaz akışı, ve sprey voltajı 3.5 kV süpürme. Bu ayarlar, numune analiz edilen bağımlı özel kullanıcı ihtiyaçlarına daha sonra ayarlanabilir. </li></ol> DPPH • Sistem Dedektörü 2,2-Difenil-1 picrylhydrazyl Radikal (DPPH) • Reaktif Kur&#39;un 3. Hazırlık <ol><li> DPPH • 25 mg tartılır ve volümetrik bir şişede 250 ml metanol içinde çözülür. </li><li> DPPH • reaktifine formik asit 250 ul ekle. Işığa maruz kalmasını önlemek için folyo balon örtün. </li><li> 10 dakika boyunca DPPH • reaktifi ihtiva eden bir şişeye sonikasyon. </li><li> Üreticinin şartının gibi hazırlanan DPPH • reaktif ile DPPH • Pompayı temizleyin. </li><li> T-parçasının girişine pompa hattı takarak Şekil 2&#39;ye göre DPPH • sistemi kurmak. </li><li> Inci bir 100 ul reaksiyon bobin takınT-parçasının e çıkış ve dedektör reaksiyon bobin diğer ucunu takın. </li><li> Ve bir sütun ısıtıcı reaksiyon bobini örten 60 ° C kolon ısıtıcı sıcaklığını ayarlamak. </li><li> 520 nm DPPH • UV-Vis detektörü ayarlayın. </li></ol> PSF Sütun 4. Kur <ol><li> HPLC cihazına PSF sütunun girişini bağlayınız. </li><li> 0,13 mm id bir boru uzunluğu 15 cm kullanarak MS dedektörü merkezi bağlantısı. </li><li> 0,13 mm id bir boru uzunluğu 15 cm kullanılarak UV-Vis dedektörü çevresel bir bağlantı noktası bağlayın. </li><li> 0,13 mm id bir boru uzunluğu 15 cm kullanarak DPPH • algılama sisteminin T-parçasına bir çevresel bağlantı noktası bağlayın. </li><li> Bir sütun tıpa kullanarak kullanılmayan periferik bağlantı noktasını engelleyin. </li><li> 1 ml dk HPLC pompası akış hızını getirmek -1% 100 hattı B -% 100 metanol (% 0.1 formik asit). </li><li> % 100 metanol mobil ph ile kolon dengeyeBir 4.6 mm id x 250 mm uzunlukta sütun için 20 dakika boyunca ase. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre tartılır. </li></ol> 5. Multiplexed Algılama için PSF Sütun Tuning <ol><li> En az iki boş toplama gemiler bir analitik terazi kullanılarak (DPPH • dedektörü UV-Vis dedektör ve birine bağlı port için bir) kütlesi ölçün. </li><li> Iki ayrı, önceden tartılmış toplama kaplarının (5,1) içine, UV-Vis ve DPPH • bağlantı noktaları mobil fazı toplayın. Toplanması için süreyi kaydedin. Her bir kap içinde solventin en az 500 mg toplayın. </li><li> Toplama kabının tartın ve mobil faz kütlesini belirler. 0.791 g ml -1 metanol yoğunluğu göz önüne alındığında, her bir port toplanan mobil faz hacmi belirlemek. </li><li> Fark ile, yani anma pompa seti debisi eksi DPPH • aracılığıyla akış hızı ve UV-Vis Detector akış portu, MS dedektöre akış hızını belirler. Toplam akışın bir yüzdesi olarak, her bir akış oranını ifade eder. Not: İdeal olarak, akış oranları aşağıdaki gibidir: MS toplam akış hızının% 18 da, UV-Vis% 22, DPPH • detektörü 60% kadar. </li><li> Eğer değilse, UV-Vis detektörü arka basıncı değiştirerek akış yüzdelerini ayarlayın. UV-Vis akış çok yüksek ise, örneğin, UV-Vis detektörü çıkışına 0,13 mm id bir boru 15 cm bölüm eklemek ekleyerek oranını azaltır. Sonra 5.5 adımları 5.1 tekrarlayın. </li></ol> 6. Final Kurulum Koşullar <ol><li> DPPH • detektöre bağlanan çıkış ağzı terk eden, aynı akış hızına DPPH • reaktifi pompa akış hızını ayarlayın. Not: UV-Vis ile çoğullanır PSF sütun, DPPH • ve MS şimdi analiz için hazırdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+a+new+concept+chromatography+column.">The design of a new concept chromatography column.</a> Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+separation+performance+using+a+new+column+technology:+Parallel+segmented+outlet+flow.">Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow.</a> J. Chromatogr, A. 1232, 47-51 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+flow+management+in+preparative+chromatographic+separations:+A+preliminary+investigation+into+enhanced+separation+using+a+curtain+flow+inlet+fitting+and+segmented+flow+outlet.">Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet.</a> 35 (3), 410-415 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+elution+chromatography+with+segmented+parallel+flow+column+technology:+A+study+on+4.6mm+analytical+scale+columns.">Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns.</a> J. Chromatogr., A. 1270, 204-211 (2012).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+HPLC+separation+performance+using+parallel+segmented+flow+chromatography.">Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography.</a> Microchem. J. 111, 3-7 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Ritchie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segmented+flow+and+curtain+flow+chromatography:+Overcoming+the+wall+effect+and+heterogeneous+bed+structures.">Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures.</a> J. Chromatogr, A. 1335, 122-135 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+active+flow+technology+HPLC+columns+as+a+platform+for+multiplexed+detection.">Evaluating active flow technology HPLC columns as a platform for multiplexed detection.</a> Microchem. J. 110, 473-479 (2013).</li><li>Camenzuli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+outlet+flow+high+performance+liquid+chromatography+with+multiplexed+detection.">Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection.</a> Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).</li><li>Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns:+Conventional+analytical+scale+column+formats+presenting+as+a+'virtual'+narrow+bore+column.">Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column.</a> J. Chromatogr., A. 1262, 64-69 (2012).</li><li>Soliven, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+performance+of+narrow-bore+HPLC+columns+using+active+flow+technology.">Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology.</a> Microchem. J. 116, 230-234 (2014).</li><li>Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Dennis, G. R., Shalliker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+segmented+flow+chromatography+columns+with+multiplexed+detection:+An+illustration+using+antioxidant+screening+of+natural+products.">Parallel segmented flow chromatography columns with multiplexed detection: An illustration using antioxidant screening of natural products.</a> Microchem. J. 110, 726-730 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma karakterizasyonu ve mültipleksli algılama paralel parçalı akış (PSF) sütunu istihdam ile HPLC kullanılarak kahve profilleme gerektirir. PSF sütunlarını kullanarak Multiplexed HPLC geleneksel multi-algılama süreçleri kullanarak alır zaman bir kısmını içinde molekül-özel bilgilerin daha yüksek derecede elde ederken örnek veri karmaşıklığını azaltarak önemli kimyasal kişilerin belirlenmesi ve tanımlanmasını sağlar. PSF sütun mültipleksli tespiti için bir platform sağlar,...

Aktif Akış Teknoloji Sütunlar Aktif akım teknolojisi (AFT) kromatografi kolonları son zamanlarda akış heterojenite 1-6 ile bağlantılı ayrımları verimsizliğe üstesinden gelmek için geliştirilmiş ve aynı zamanda mültipleksli algılamayı etkinleştirmek için. Bu özel iletişim ayrıntılarıyla paralel operasyonel süreç mültipleksli algılama ile akış (PSF) sütun bölümlenmiş. PSF kolonun temel fonksiyonel avantajlar şunlardır: (1) kolon yatak radyal merkezi bölgeden akışı, (2), bir tespit tarafından işlenen mobil faz hacim akışının çevre ya da duvar bölgesinden izole edilir Kaynak azalır, ve (3) algılama kaynakları her algılama süreci boyunca tespit gecikmeleri instilling veya sonradan yazılan sütun akışın 7,8 yarma gerektirmeden örnek bilgileri genişletmek için çoğaltılmış olabilir. A sağlayan PSF sütunun tasarımında anahtar özelliğibirden fazla mesaj saptama dvantage yeni çıkış bağlantı ve frit düzeneği olup. 1, geleneksel bir kolona kıyasla AFT kolonun bir fotoğrafıdır. Bu bölme işlemi sonrası kolon akış akış bölme aynı değildir paralel parçalı akış sütunlar kullanılarak elde anlamak için önemlidir. Bir post kolon akımdan (yani, eksenel), böylece her bir akış akışı verimliliği ve duyarlılık ile eşit derecede örneklenir kuyruk ekstremitelere lider kenarından tüm numune bandı bölünmüş; duyarlılık büyüklüğü dolayısıyla sayısı böler tarafından bölünmüş. PSF ise, bölme işlemi örnekleri bant radyal, eksenel değil. Bu nedenle, merkez liman örnekleri zirve apeks - tepe en konsantre bölgesi. Pik yaygın atık bölgeye göre seyreltilmiş değildir Böylece, burada hassasiyet yüksektir. Periferik bağlantı noktalarından elüsyon Örnek merkezindeki kadar etkili değildirbandı yerine eksenel olarak daha radyal olarak örneklenmiş olduğu için l bölgesi, ancak, tepe genişliği, örneğin, eksenel yönde bir Kolon sonrası bölünme tepe bölen bir numune alma işlemi için olacağından daha dardır. Bu nedenle, konsantrasyon bağımlı bir detektör ile hassasiyet azaltılmaz. PSF sütununda, çıkış bağlantı çok sayıda çıkış ağızlarından oluşan ve montaj bu amaçla iç kısmında halka şeklinde bir cam hamuru vardır yer almaktadır. Çıkış hamuru kanallarının dış radyal kısmı çevresel veya duvar kısmı çıkış akış portları yoluyla kolondan dışarı akarlar ise, bu halka şeklindeki frit kanallarının iç kısım, radyal merkezi çıkış portu üzerinden kolondan dışarı akarlar. Çıkış frit iç ve dış kısımlar, bu akım bölgeleri 2 arasındaki çapraz akışını önleyen bir geçirmez bir bariyer ile ayrılır. Bu tasarımın bir sonucu olarak, kolon yatağı üzerinden merkezi radyal akış akımı duvar kısmı akış bileşenler ayrılırsütun ide. Bu iki bölgeden akışının ilgili kısım bu tür bir ayırma verimliliği veya algılama hassasiyeti sütun teknolojinin çeşitli fonksiyonel yönleri, optimize etmek için, basınç yönetimi hemen hemen herhangi bir arzu edilen orana değiştirilebilir. Özünde, bu tasarım etkili bir dar iç çapa sahip, geniş formatlı sütununda bir &#39;sanal&#39; sütunu içinde kurar ve kolon yatak heterojenitesini ve duvar efektleri 9,10 üstesinden gerçek bir duvar daha az sütun olarak dolayısıyla kolon fonksiyonları. PSF sütunların önemli faydaları kolon verimliliği, algılama kaynağı (lar) ve mültipleksli algılama etkinleştirmek için çözücü işlem minimize gelişmeler vardır. Bununla birlikte, ek bir avantajı, herhangi bir bandın atık ve önü bölgeleri genel elüsyon çıkarılır, çünkü elüsyon veya saptama de çözünmüş madde profili olmasıdır, aksi takdirde, aynı s gözlemlenen edilenden daha yüksek bir konsantrasyonda mevcut olduğuKullanılan bölütleme oranına bağlı olarak, geleneksel bir sütun üzerinde enjeksiyon ve konsantrasyon yük olute. Bunun bir sonucu olarak genellikle PSF sütun 2 üzerinde yapılan ayırımlar için sinyal yoğunluğundaki bir kazanç olduğu gözlemlendi. Aslında, bölütleme oranı, dört çıkış ağızlarının her biri akış çıkış% 25, ​​mor ötesi (UV) algılama kullanılarak gözlenir sinyal yoğunluğu, geleneksel bir ile belirgin olarak aynı sinyal yoğunluğu pratik gösterir, öyle ki düzeltilmiş olup olmadığını Hareketli fazın tamamı (% 100) 7 incelendiğinde kolonu. Ayrıca, merkez ve çeper akış bölgeleri arasındaki çıkış oranı ince ayar kolon verimliliği optimize edilmesini sağlar. (1) debi, (2) segmentasyon oranı ve (3) çözünen tutma faktörü: Sütun verimliliği kazançlar bu verimlilik kazançları üç faktörün fonksiyonu olduğundan, tek bir değere ifade edilemez AFT sütunlarını kullanarak gözlenen . Bununla birlikte, verimlilik kazanımları conv göreentional sütunlar hemen hemen her zaman gözlenir ve bazen bu kazanımlar teorik plaka 1,2 sayısında% 100&#39;den fazla bulunmaktadır. Ayarlamak için yeteneği segmentasyon oranı analisti etkin bir &#39;sanal&#39; sütununun çapı terzi sağlar ve bu algılama sürecine ilişkin önemli bir faktördür. Bölütleme nispeti dairesel merkez çıkış portundan elüsyon mobil faz% 21 olduğu zaman, örneğin, bir sanal 2.1 mm iç çapı (id) kolonu, fiziksel bir 4.6 mm id kolonundan kurulur. Bu koşullar altında, 2.1 mm id, sanal sütun, akış hızına bağlı olarak, geleneksel bir 2.1 mm id sütun daha fazla% 70 daha büyük olabilir verimlilik ve çözünen tutma faktörü 10 ile gerçekleştirir. Mültipleksli tespiti için kullanılan geçerli PSF kolon tasarımı 4-portlu uydurma çıkış içeriyor, ancak sütun takılabilir 2 port uç parçası da, ancak, bu algılama t sınırlarSadece iki dedektör o. Bu dört dedektörleri mültipleksli tespiti için kapsamının genişletilmesi 4-port çıkış PSF sütun aynı anda bağlanabilir dışında bu sütunlardan temel çalışma, ancak, aynıdır. Kenara öncesi ve sonrası kolon bağ borudan, sadece ek gereklilikleri PSF sütun periferal çıkış delikleri bağlanabilir boru ve her tüpe geçen mobil faz miktarı ölçülebilir hangi bir vasıta olup çalıştırmak için, tipik bir kitle ölçümü veya hacimsel ölçüm ya. Ayarlama kolaylığı açısından, bütün çıkış akış boru iç çapı ile aynı olmalıdır. Periferik ve santral radyal çıkış limanları arasında akış oranı daha sonra sadece uydurma periferal çıkışında, veya radyal merkezi çıkış noktası üzerinde tüp sonrası dedektör uzunluğu bulunan boru uzunluğunu değiştirerek, basınç yönetimi kullanımı yoluyla değiştirilir. Multiplexed Algılama PSF sütunlar kullanma </strong&gt; PSF gruplarından önemli bir avantajı, çıkış çıkış ağızlarının her biri, böylece birden fazla mesaj saptama sağlayan bir algılama kaynağına doğrudan bağlanabilir olmasıdır. Iyi tasarlanmış bir tespit sistemi olarak birden fazla mesaj göndermiş algılama ile tek bir analiz numunesi içindeki bileşenlerin doğası ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir. Önemlisi, yıkıcı ve tahribatsız testler algılama gecikmeden, tam olarak aynı anda yapılabilir. Bu bileşenler UV ve / veya kütle spektrometrisi (MS) tespit yanıtları 7,11 ile elüte gözlenmiştir ile DPPH • reaktifi kullanılarak, örnek, bir anti-oksidan için, mutlak atanmasına olanak verir. Bu nedenle, dört bağımsız detektörler, dört çıkış portu üzerinden her bir detektöre yönlendirilir akış uygun oranlarda eşzamanlı olarak çalıştırılabilir. Bu bağlantı noktaları üzerinden akışı kolayca dedektörleri herhangi ulaşan çözünen miktarı ayarlanabilir beri takım elbise ayarlanabilirAyrıca dedektörün kaynağının hassasiyeti. Bu en etkili çözünen geçiş radyal merkezi çıkış deliğinden görülmektedir ki, not edilmelidir. Periferik limanların her her port üzerinden% 25 olarak ayarlandığında, sadece biraz daha az verimli geleneksel sütunda daha eşdeğer ayırma verimliliği, sunuyoruz. Bunun gibi, nicel dedektör radyal merkezi çıkış ağzının numunenin analiz etmek için ayarlanmış olması önemlidir. Çoğullama tespiti amacıyla bir PSF sütun kurarken, verimli ve yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için yapılması gereken hususlar bir dizi vardır; her port için tüp boyutları olduğunu, seçim dedektörü ve akış ayarlaması türü için hangi port. Her Limanı için Tüp Boyutları Kromatografide Kolon sonrası boru uzunluğu ayırma verimliliği ve performansında önemli bir rol oynar. Büyük deadetektöre kolon çıkışında, uzun ve geniş id boru sonucu d hacimli verimliliği, çözünürlük ve hassasiyet kaybına neden olur. Çoğullama faydalarını sağlarken etkili ayırma sağlayan maksimum potansiyel ulaşmak için PSF sütun kurarken Böylece, uygun boru ölçüleri kullanılmalıdır. Dedektör Port Şekil 2, birden fazla mesaj saptama (Ultraviyole-Görünür (U-Vis), kütle spektrometresi (MS) ve 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH) • tespiti) bir örnek kurulumun bir gösterimidir. Illüstrasyon, merkezi liman DPPH • oysa MS dedektör bağlı olduğu ve UV-Vis dedektörleri periferik limanlarına bağlı olduğunuzu gösterir. MS üç en hassas dedektör olduğundan, merkezi çıkış deliğinden yönettiği bu dedektöre akar. DPPH • algılama gibi presenc seçicidirantioksidanların e ve bu dedektöre akış, en az duyarlı ve bant genişlemesine en hoşgörülü bir çevresel limandan yönetilmiştir. UV-Vis ikincil &#39;genel&#39; dedektör olduğunu, bu yüzden ikinci bir çevresel limandan yönettiği bu dedektöre akar. Akış Ayarı Uygun boru dedektöre bir limandan bir kere yerleştirildikten sonra, dedektörden her biri çıkan akım gerekli miktara ayarlanabilir. Her dedektör çıkan akış miktarını ölçmek için basit bir yolu zaman belirli bir süre boyunca her port üzerinden elutes mobil faz miktarını tartmak etmektir. Yüzde akışı böylece tespit edilebilir ve akış oranları kısaltılması veya buna uygun olarak tercih edilen detektör gereksinimlerine uygun detektör üzerindeki çıkış hattına bağlı boru uzatma biri tarafından ayarlanabilir. Farklı detektörler, örneğin, akış hücresi, akış farklı gereksinimleri vardırBir floresan dedektörü (FLD) oranı sınırlı akış değil, ama bakım akış hücresi aşırı basınçlandırma önlemek için alınmalıdır. Bu nedenle FLD boyunca akış kontrolü genellikle, diğer dedektör boyunca basınç düşüşünü ve akışın geri kalan daha sonra FLD geçer ayarlanmasıyla elde edilir. Teslim edilir akış miktarı duyarlı olan bir detektör, MS olup. Genellikle, mevcut yüksek uç kütle spektrometre kolayca yaklaşık 1 ila 1.5 ml / orta sulu mobil faz min işleyebilir. Bu akış hızının üzerinde, kaynağın sel MS çalışamaz hale getirebilir. Ancak, çoğu kitle spektrometrelerde algılama hassasiyeti düşük akış oranları kullanılarak yararlandı; dolayısıyla PSF akış bölme yetenekleri, MS algılama içeren uygulamalar için son derece faydalıdır. Yüksek kolon hacimsel debiler ancak MS dedektör taşınan düşük hacimli yükleri ile, kullanılabilir. MS detektöre akış ayarlama Bununla birlikte, önceki basınç düşüşü ayarlama yapılmalıdırMS dedektör yerine yazılan MS. Basınç kolayca uygunsuz ölü hacim eklemeden ayarlanabilir olarak Burada, dar delik boru (0.1 mm id) kullanımı çok yararlıdır. Dedektör tipine segmentasyon oranının ayarlanması bağlı öncesi ya da sonrası her iki dedektör yapılabilir. UV-Vis kullanıldığı gibi bir tahribatsız dedektör, akış yüzdesi ölçülür ve sonrası dedektörü ayarlanmış olsaydı. Tek bir yıkıcı dedektör kurmak multipleks kullanılması durumunda akış yüzdesi geri diğer liman akış yüzdeleri bakımından hesaplanarak belirlenir. Reaktif detektör gibi DPPH • olarak kullanılır ise, akış oranı reajanı eklenmesi olmaksızın direk detektörü ölçülür; İki veya daha fazla yıkıcı dedektörleri kullanılırsa, o zaman akış oranı öncesi dedektör ölçülür. Algılama ek enstrümantasyon gibi DPPH • gerektirebilir sistemleri, akış değiştirebilir ekstra sistem basıncını olacakyüzde kez algılama sistemine bağlı. Bu nedenle, dikkatli bir değerlendirme yıkıcı bir dedektörün sistem basıncı, debi oranını ayarlayarak ön dedektöre dikkat edilmelidir. Bakılmaksızın port herhangi aracılığıyla ayarlanır akış oranı, kantitatif bilgiler uygun standardizasyon yoluyla elde edilmelidir. Akış oranları ayarlandıktan sonra, ancak, bunlar sağlam ve hatta gradient çıkma koşulları 7 altında değişmeyen, Bu yazının eşlik ayrıntılı video protokolü algılama çoklanmış modda PSF sütun işleyişini kullanmak ve ayarlamak nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>HPLC instrument</td><td></td><td></td><td>Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, pump.</td></tr><tr><td>Parallel Segmented Flow HPLC column</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Not Defined</td><td>Soon to be commercialized</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>HPLC Grade</td></tr><tr><td>PEEK tubing</td><td>Any brand</td><td></td><td>Various lengths and i.d.</td></tr><tr><td>Column stoppers</td><td>Any brand</td><td></td><td>For blocking unused peripheral ports.</td></tr><tr><td>PEEK tube cutter</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Scale Balance</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stop watch</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eluent collection vessels</td><td>Any brand</td><td></td><td>1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels</td></tr></tbody></table>

tuning a parallel segmented flow column and enabling multiplexed detection

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.

Bir multiplekslenmiş HPLC analizi PSF modunda (Şekil 1) bir AFT kolonu kullanılarak gerçekleştirilen ve Şekil 2 &#39;de gösterildiği gibi oluşturuldu. Kurulum Bu tür kahve numunesi toplam UV-Vis, DPPH • ve MS kullanılarak eş zamanlı olarak analiz edilmesine izin İyon Sayısı (TIC) modu. Şekil 3&#39;te görüldüğü gibi kromatogramları eş zamanlı olarak kaydedildi beri, tutma süresi uyum dayalı TIC tepkiler - DPPH • yanıt...

Watch this Scientific Journal Video about Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection at JoVE.com

Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.

Paralel Segment Akış Sütun Tuning ve Multipleks Algılama etkinleştirme

Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms ...

tuning-parallel-segmented-flow-column-enabling-multiplexed

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.3K Görüntüleme.  University of Western Sydney. Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection. 

Video: Tuning a Parallel Segmented Flow Column and Enabling Multiplexed Detection

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Biyokimya

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Mesaj Sütun Türevlendirme Reaksiyon Akış Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi sütunlar kullanma

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Kimya

Curtain Flow Column: Optimization of Efficiency and Sensitivity

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Akış Sütun Perde: Verimliliği ve Duyarlılık Optimizasyonu

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially ...

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.

This protocol outlines the fabrication of a large-scale, multiplexed two-dimensional DNA or antibody array, with potential applications in cell signaling studies and biomarker detection.

Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Mühendislik

A Modular Microfluidic Technology for Systematic Studies of Colloidal Semiconductor Nanocrystals

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light emitting diodes (LEDs) and photovoltaics (PVs). Among this material group, inorganic/organic perovskites have demonstrated significant improvement and potential towards high-efficiency, low-cost PV fabrication due to their high charge carrier mobilities and lifetimes. Despite the opportunities for perovskite QDs in large-scale PV and LED applications, the lack of fundamental and comprehensive understanding of their growth pathways has inhibited their adaptation within continuous nanomanufacturing strategies. Traditional flask-based screening approaches are generally expensive, labor-intensive, and imprecise for effectively characterizing the broad parameter space and synthesis variety relevant to colloidal QD reactions. In this work, a fully autonomous microfluidic platform is developed to systematically study the large parameter space associated with the colloidal synthesis of nanocrystals in a continuous flow format. Through the application of a novel translating three-port flow cell and modular reactor extension units, the system may rapidly collect fluorescence and absorption spectra across reactor lengths ranging 3 - 196 cm. The adjustable reactor length not only decouples the residence time from the velocity-dependent mass transfer, it also substantially improves the sampling rates and chemical consumption due to the characterization of 40 unique spectra within a single equilibrated system. Sample rates may reach up to 30,000 unique spectra per day, and the conditions cover 4 orders of magnitude in residence times ranging 100 ms - 17 min. Further applications of this system would substantially improve the rate and precision of the material discovery and screening in future studies. Detailed within this report are the system materials and assembly protocols with a general description of the automated sampling software and offline data processing.

Detailed herein are the operation and assembly protocols of a modular microfluidic screening platform for the systematic characterization of colloidal semiconductor nanocrystal syntheses. Through fully adjustable system arrangements, highly efficient spectra collection may be carried out across 4 orders of magnitude reaction time scales within a mass transfer-controlled sampling space.

Kolloidal yarı iletken Nanocrystals sistematik çalışmalar için modüler bir mikrosıvısal teknolojisi

Colloidal semiconductor nanocrystals, known as quantum dots (QDs), are a rapidly growing class of materials in commercial electronics, such as light ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Biyomühendislik

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.