This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürler Tıp Southern Illinois University School Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Temporal Bones 1. Ekstraksiyon <ol><li> Fare kafatası 13 tabanındaki zamansal kemikler tespit ve standart model forseps kullanılarak kranial sinirler kazınması. </li><li> Kapsüllü koklea çıkarmak için otik kapsül ucunda aşağı posteriyor semisirküler kanal üzerinde ters elle basının başparmak ile standart model forseps yerleştirin. </li><li> El başparmak ve işaret parmağı ile ya da 10.5 cm ince makas kullanarak kafatası temporal kemiğin alt yarısı boşaltın. </li></ol> 2. Geçici Bones Post-fix <ol><li> 10 mM fosfat tamponlanmış tuzlu su içinde seyreltilmiş 500 ul% 4 paraformaldehit (PFA) (PBS) pH 7.4 ile inkubasyondan - 250 ihtiva eden 2 ml mikrosantrifüj tüpleri içine zamansal kemikler yerleştirin20 saat - 2 RT&#39;de yedik. NOT: yuvarlak veya oval pencereye PFA apikal kap veya enjeksiyon Hiçbir açılması gereklidir. Cam şişe içinde% 16 konsantrasyonda satın alınabilir metanol ücretsiz, ultra saf, elektron mikroskobu (EM) notu PFA kullanmanızı öneririz. Bir şişe açıldı ve 1 seyreltilmiş sonra:% 4 çözelti haline PBS 4 (Bazı antikorlar tolere edebilir kısa tespiti ve diğerleri gerektiren 4 o C&#39;de saklandığında, o kadar 2 hafta boyunca kullanılabilecek O / N (O / N) tespit). </li></ol> 3. decalcify Temporal Bones <ol><li> Tespit edildikten sonra, bir pipet kullanılarak, PFA çıkarın ve 120 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), biraz daha fazla 2 ml ile değiştirin. Tüp kapalı olduğunda hava kabarcıkları önlemek için tüm 2 ml&#39;lik ependorf tüp doldurmak için emin olun. <ol><li> Hemen dekalsifiye Eğer değilse, o 4 ° C&#39;de 10 mM PBS, pH 7,4 ve mağaza örnekleri ile PFA yerine Not: Tespit edildikten sonra, temporal kemik variab saklanabilirle antijenleri bağlı dekalsifikasyon incelenmeden önce zaman tutarındadır. </li></ol></li><li> Uçtan aşırı uca rotator yerleştirin tüpler ve RT&#39;de 4 rpm&#39;de döndürün. Bir pipet kullanarak günlük EDTA çözeltisi değiştirin. Dekalsifikasyon uzunluğu numunesinin yaş ve diseksiyon yaparak bilim adamı tercihine bağlıdır. <ol><li> Inkübasyon sürelerinde aşağıdaki yönergeleri kullanarak EDTA temporal kemikler inkübe: 8 P15 numunelerin doğum sonrası gün (P): 2-4 saat; P21 için numuneler P15 için: O / N; P30 örnekleri P21 için: 2 O / N; 3 ya da daha fazla, O / N: P30 daha büyük numuneler için. NOT: Decalcification süreleri kullanıcıların tercihine tabidir ve gerektiği gibi uzatılabilir. Decalcification süresi yaklaşık 8 saat arayla, günde iki kez EDTA çözeltisi değiştirerek düşürülebilir. Bulaşmasını önlemek için daha uzun bir süre için 3 gün dekalsifiye Bazı laboratuarlar EDTA solüsyonuna% 1 PFA ekleyin. </li></ol></li><li> Numune yeterince dekalsifiye ise o zamansal kemikler koyun belirlemek içinna silikon diseksiyonu çanak elastomer kaplamalı ve yavaşça salyangoz şeklindeki koklea üzerine forseps basın. Doku süngerimsi ise, yumuşatma işlemi tamamlanır. </li><li> Yumuşatma işlemi tamamlandıktan sonra, bir pipet kullanılarak EDTA çıkarın ve 10 mM PBS pH 7.4, 500 -1000 ul ekle. Kadar hazır 4 o C&#39;de saklayın örnekleri incelemek için. </li></ol> 4. Silikon Elastomer kaplı Diseksiyon Dish oluştur <ol><li> Taban ve üreticinin talimatlarına göre bir silikon elastomer kapsülleyici kitinin sertleştiriciyi birleştirin ve iyice karıştırın. </li><li> Çözüm siyah olana kadar toz kömür 3 yemek kaşığı ve iyice karıştırın - yaklaşık 2 ekleyin. NOT: Sıvı mürekkep veya sıvı kömür solüsyonu ile karıştırmak olmaz ve kullanılamaz. Silikon elastomer enkapsülant kitleri adım 4.2 atlanabilir sağlayan siyah satın alınabilir. </li><li> Kaplamak için yeterli alt doldurma 60 mm cam veya plastik petri kaplarının içine solüsyonu dökülür. Bu takdirdebbles, mevcut yüzey üzerinde hava ile puf. Ayarlamak için oda sıcaklığında en az 24 saat bekletilir. Not: Silikon elastomer kaplı tabaklar yıl tekrar tekrar kullanılabilir. Bu silikon elastomer çatlamasına neden olur Ancak, temizlik için etanol kullanmayın. </li></ol> (P7 ve Yaşlı Örnekleri için) Kohlea 5. Tüm Dağı Diseksiyon <ol><li> Orta / apikal döner bazal dönüş ayırın <ol><li> 10 mM PBS pH 7.4 ile üçte ikisi dolu dolu bir silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak bir dekalsifiye zamansal kemik yerleştirin ve aşağıdaki adımlar için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. </li><li> 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ve 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanılarak vestibüler bölgede zamansal kemiği tutun, kenarları boyunca ve apeks yukarıda aşırı otik kapsül doku kesip. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, oval pencere içine bir bıçak takın ve spiral ligament / yanal boyunca birkaç küçük kesikler yapmakBazal dönüş duvarı. </li><li> 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve temporal kemik dışında diğer bıçağı yerleştirin oval pencereye medial. Bu kesim, orta ve apikal döner gelen bazal dönüş ayırır. </li></ol></li><li> Bazal dönüş tam diseksiyonu. <ol><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, bazal sırayla gerginliği ve vestibüler organların ayrılması bazal dönüş kesim için modiolus bağlanmak spiral ganglion sinir liflerini kesti. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, Corti organı yukarıda ve aşağıda hem spiral ligament / lateral duvar kaldırmak için küçük kesikler bir dizi yapmak. Doku rehberlik 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanın. Silikon elastomer kaplı diseksiyon çanak spiral ganglion sinir liflerini Pin, ancak doku gözyaşı gibi bu bölgede tutunmaya yok. </li><li> Önceki adımlarda, Reissner en membranın bazı sırasındae sık sık silinecektir. Herhangi hala kalırsa, 4. veya 5. düz kuyumcu forseps ile Reissner en zarı kavramak ve Corti organı uzak çekin. NOT: örtü oluşturan zar nadiren görülür ve genellikle kaldırılması için özel bir adım gerektirmeden uzak yüzer. </li><li> Sonunda için, mümkün olduğunca düz dönüş yapmak ve spiral ganglion kalan aksonlar tutarak, disseke bazal dönüşü aktarmak için 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanmak için, spiral ganglion akson kalınlığını azaltmak için çeşitli kesimler yapmak Bir 48-yuvalı plaka (veya odacık slayt) 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul ihtiva etmektedir. </li></ol></li><li> Ayrı orta ve apikal dönüşler <ol><li> Koklea, aşağı apikal tarafında kalan üçte ikisini yerleştirin. </li><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, kullanılan orta dönüş bazal dönüş bağlanacak scala ortamı içine bir bıçak yerleştirin ve th spiral ligament / yan duvar boyunca birkaç küçük kesikler yapmake orta dönüş. </li><li> 5 mm Vannas-Tübingen yaylı makas kullanarak, sadece bıçağın üstüne yerleştirilir orta çevirmek ile kesilmiş bölgeye bir bıçak takın ve apikal ucundan 90 o açıyla, kemikli labirent dışında diğer bıçağı yerleştirin. Bu tepe dönüş gelen orta dönüş ayırır. </li></ol></li><li> Bazal da benzer bir şekilde, orta dönüş tam diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız). </li><li> Apikal dönüş tam diseksiyonu. <ol><li> 2.5 mm Vannas yaylı makas kullanarak, apikal dönüş kapsayan kapağı açın. Bazal da benzer bir şekilde komple diseksiyon (5.2.4 adımları 5.2.2 bakınız). Not: Dissected koklear döner immün önce birkaç hafta içinde 4 o C&#39;de 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) içinde 10 mM PBS, pH 7.4 içinde saklanabilir. Üzerine bakteriyel veya mantar büyümesi neden olabilir 3 hafta - Ancak PBS uzun 2&#39;den buharlaşması ve periyodik olarak doldurulan gerekiyor ve depolama olacakgörüntünün kalitesini düşürebilir doku. Biz undissected temporal kemik olarak numunelerin uzun vadeli depolama öneririz. </li></ol></li></ol> Floresan Tagged Antikorlar 6. immün <ol><li> Diseksiyon sonra, 10 mM PBS, pH 7.4 ~ 500 ul batırılmış bir 48 oyuklu plaka (veya oda slayt) ayrı bir kuyunun her koklear dönüş depolar. Aşağıdaki adımlardan her biri için koklear dönüş, sıvı batık gereken üstte yüzen değil ya da kuyunun yanına yapışmış. NOT: her bir sıvının sökerken, bu koklear dönüşler kaybetmek ya da pipet o kadar emmek için kolaydır. Bir diseksiyon kapsamı kullanarak 200 ul pipet ile çözümler Değişen bu önlemeye yardımcı olur. </li><li> Bir pipet kullanarak, her bir oyuğa PBS çıkarıp yerine ~ 200 - / bloke permeabilizasyon çözeltisi (oyuk başına 300 ul% 1 Triton X-100,% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS) 10 mM PBS içinde seyreltilmiş pH 7.4). 3B rotator oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Not: kullanılan herhangi bir birincil antikor, bir keçi konukçuda yapılmış ise, o zaman ikinci bir anti-keçi antikoru gerekli olacak ve NGS herhangi bir aşaması için kullanılmamalıdır gerekir. Normal at serumu NGS için bir yedek olarak kullanılabilir. </li><li> Bir pipet kullanılarak bloke / geçirimli hale çözeltisini çıkarın ve primer antikor çözeltisi, oyuk başına 100 ul ~ ile değiştirin (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). Her primer antikor için sulandırma faktörü değişir. 3D döndürücüde 4 o C&#39;de O / N (en az 14 saat) inkübe edin. Not: birden çok birincil antikoru kullanıldığında, tüm sadece her birincil antikor farklı ev sahibi olduğundan emin olun, inkübasyon için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. </li><li> Bir pipet kullanılarak birincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. Her bir yıkama 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum kuluçkaya. </li><li> Geçen P kaldırBS, bir pipet kullanılarak ve ikincil antikor çözeltisinin oyuk başına 100 ul ile ul yerine yıkama (% 0.1 Triton X-100, 10 mM PBS, pH 7.4 içinde sulandırılmış% 1 BSA ve% 5 NGS). 500 ya da 1: 1000 her biri için sulandırma faktörü floresan ikincil antikor, genellikle 1 olan etiketli. Floresan ışıktan korumak sekonder antikorlar etiketli bir kara kutu 48-plaka koyun. 3B rotator oda sıcaklığında 3 saat - 2 inkübe edin. Not: birden fazla ikincil antikor ihtiyaç varsa, inkubasyondan için aynı çözelti içinde kombine edilebilir. Çapraz etiketleme imkanı yoktur emin olun (örn., Keçi anti-tavşan ve tavuk anti-keçi ikincil antikorlar kullanarak) </li><li> Bir pipet kullanılarak ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. </li><li> Bir pipet kullanarak son PBS yıkama çıkarın ve Hoec oyuk başına ~ 100 ul ile değiştirinçekirdekleri etiketlemek için: hst 33.342 (10 mM PBS pH 7.4 2,000 1 seyreltilmiş). 3B rotator oda sıcaklığında 20 dakika - 15 inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. Uzun 20 dakika inkübe yapmayın. </li><li> Bir pipet kullanılarak Hoechst çözeltisi çıkarın ve oyuk başına 500 ul ~ 10 mM PBS, pH 7.4 3 yıkama yapar. 3B rotator oda sıcaklığında 5 dakikalık bir minimum her yıkama inkübe edin. Işıktan korumak için bir kutu olarak 48 oyuklu plaka tutun. </li><li> Gerekirse tüm adımlar birkaç saat, Hoechst inkübasyon hariç uzatılabilir. Herhangi bir aşamada reaksiyonu durdurmak için, sadece 10 mM PBS pH 7.4 ~ 500 ul örnekleri batırmayın ve protokol saat veya 1 sürdürmek için hazır olana kadar 4 o C&#39;de 48 eh plaka (veya bölme slayt) saklamak - 2 gün sonra . </li></ol> 7. Dağı Koklear slaytlar açar <ol><li> Etiket kullanılan örnek ve antikorlar konusunda ilgili bilgiler slaytlar. </li><li> Pipet montaj medya ~ 50 ul her slayt üzerine ve dikkatli olmakkabarcıklarını engellemek için. Herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için montaj ortamı içeren tüp santrifüj. </li><li> 4. veya 5. düz kuyumcu forseps kullanarak, hafifçe montaj medyada slayt ve yere 48 plaka itibaren bir koklear dönüş transfer spiral ganglion aksonları kavramak. Slayt başına Dağı tek koklear dönüş görüntüleme işlemi sırasında ışığa maruz ve photobleaching önlemek için. </li><li> Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, kullanım # 4 ya da 5. düz kuyumcu forseps koklear dönüş yeniden konumlandırmak için. </li><li> Slayt üzerinde bir lamel bir ucunu yerleştirin ve yavaşça lamel düşmesine izin için bırakın. </li><li> Koklear dönüş, katlanmış bükülmüş veya hava kabarcığı yakın olmadığından emin olmak için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Bu koşullardan herhangi biri meydana gelirse, yavaşça koklear dönüş yeniden konumlandırmak için ileri ve geri lamel hareket ettirin. </li><li> Yer slaytlarböylece bir slayt klasörüne onlar düz koymak. Montaj edelim medya kür O / oda sıcaklığında N (DARK tutmak) </li><li> Net oje ve mağaza oda sıcaklığında veya -20 o C Seal lamelleri kadar görüntülenmiş. Slaytlar slayt klasör veya slayt kutusunda saklanabilir. NOT: Slaytlar -20 o C veya -80 o C ve floresan uzun süreli saklanabilir birkaç ay için muhafaza edilecektir. </li><li> Immün işlemi sırasında kullanılan ikincil antikorlar göre uygun dalga boyunda bir konfokal mikroskop kullanılarak Görüntü slaytlar. Parlaklık ve kontrast ayarı konfokal satıcı tarafından sunulan görüntüleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Robles, L., Ruggero, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+the+mammalian+cochlea.">Mechanics of the mammalian cochlea.</a> Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).</li><li>Ehret, G., Frankenreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitattive+analysis+of+cochlear+structures+in+the+house+mouse+in+relation+to+mechanisms+of+acoustical+information+processing.">Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing.</a> J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).</li><li>Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+damage+in+the+C57BL/CBA+mouse+cochlea.">Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea.</a> Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).</li><li>Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).</li><li>Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+Recordings+at+Afferent+Dendrites+Contacting+Cochlear+Inner+Hair+Cells:+Monitoring+Multivesicular+Release+at+a+Ribbon+Synapse.">Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse.</a> J Vis Exp. (48), e2442 (2011).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+and+analyzing+the+mouse+temporal+bone+to+identify+gross,+cellular+and+subcellular+pathology.">Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology.</a> Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).</li><li>Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C., Willott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Mouse Auditory Research. , 171-187 (2001).</li><li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells.">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+proliferation+of+postmitotic+cochlear+supporting+cells+by+acute+ablation+of+the+retinoblastoma+protein+in+neonatal+mice.">In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice.</a> J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).</li><li>Steigelman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-1+Is+Required+for+Stereocilia+Structure+But+Not+for+Mechanotransduction+in+Inner+Ear+Hair+Cells.">Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells.</a> J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+in+vivo+conversion+of+mouse+cochlear+pillar+and+Deiters'+cells+to+immature+hair+cells+by+Atoh1+ectopic+expression.">Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression.</a> J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+half+the+hair+cells+in+the+mouse+utricle+first+appear+after+birth,+with+significant+numbers+originating+from+early+postnatal+mitotic+production+in+peripheral+and+striolar+growth+zones.">Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).</li><li>Collado, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postnatal+accumulation+of+junctional+E-cadherin+is+inversely+correlated+with+the+capacity+for+supporting+cells+to+convert+directly+into+sensory+hair+cells+in+mammalian+balance+organs.">The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs.</a> J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).</li><li>Meyers, J. R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+change+controls+supporting+cell+proliferation+in+lesioned+mammalian+balance+epithelium.">Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium.</a> J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).</li><li>Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+dysregulation+in+the+stria+vascularis+of+mice+with+Alport+syndrome:+implications+for+capillary+basement+membrane+pathology.">Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology.</a> Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Başarılı tüm montaj diseksiyonu ve immün için birkaç kritik adımlar vardır. Bu yöntemlerden birini gerçekleştirilir Ancak önce, koklear dokusunun uygun sabitleme gereklidir. Biz metanol, ücretsiz, ultra saf, EM dereceli PFA kullanmanızı öneririz. PFA metanol ve immünofloresan kalitesini düşüren dengesiz bir pH izlerini olabilir toz yaptı. Diğer gruplar, benzer diseksiyon formaldehit 14-16 içermeyen kullanılarak mümkün olan sabitleyiciler olduğunu göstermiştir. Sabitleme uzu...

Temporal kemik içinde yer alan iç kulağın spiral şekilli koklea, Corti, memelilerde işitsel duyu uç organ organı ev sahipliği yapmaktadır. Koklea tonotopically düzenlenen ve yaygın olarak apikal ortadan ayrılır ve bazal tepesi 1 taban ve düşük frekans tespiti yüksek frekanslı ses algılama ile farklı frekans bölgelerine tekabül eden döner bir. Saç hücreleri, Corti organı mechanosensory hücreleri, farelerin 2,3 yaklaşık 6 mm uzunluğunda koklea, uzunluğu çalıştırın. Bu hücreler, merkezi işitsel yapıları tarafından işlenen sinirsel sinyalleri içine, sıvı dolu Membranöz labirent aracılığıyla iletilen ses dalgalarının, mekanik enerjiyi dönüştürmek. Burada anlatılan teknik, (yaş bir hafta yetişkinliğe kadar numuneler için) koklea kalsifikasyonu sonra Corti organı tüm bağlar hazırlanması için bir yöntem, tamamlandığında içerir. Ayrıca immunosta için bir yöntem mevcutbütün ining koklear doku monte edilebilir. Koklear bütün bağlar tüm saç hücrelerinin görselleştirme ve doğal uzamsal düzenlemeler destekleyici hücrelerin çevredeki için çok önemlidir ve konfokal mikroskopi kullanılarak üç boyutlu olarak analiz için izin. Dr. Hans Engstrom ve Harlow Ades aslında onlar hızla mikroskopik analiz 4 Corti organı kısa bozulmamış kesimleri koruyarak, düzeltmek ve memelilerin çeşitli sıvı batık kalsifiye cochleae incelemek için bir teknik detaylı 1966 yılında bir bütün montaj koklear diseksiyon yöntemi tarif. Bir sabitlenmemiş, kalsifiye sıçan Kokleanın diseksiyonu da bir öğretim video 5&#39;te gösterilen edilmiştir. Dr. Barbara Bohne ve Washington Üniversitesinde Gary Harding bu yönteme pek çok önemli değişiklikler yaptı. Koklear tüm montaj yönteminin kendi versiyonunda, temporal kemik, dekalsifiye oldu plastik gömülü ve beş yarım dönüşler veya on çeyrek dönüşler dissec edildited 6,7. O plastik gömme 8 gerekli değildi bu yüzden Dr. Charles Liberman ve Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Göz ve Kulak Infirmary&#39;de meslektaşları, bu tekniği modifiye. Tekniğin daha da modifikasyon Burada sunulan diseksiyon yöntemi haberdar St. Jude Çocuk Araştırma Hastanesi 9-12 Dr. Jian Zuo&#39;nun laboratuarında meydana geldi. Biz tam apikal, orta ve bazal dönüşler izolasyonuna izin veren Bohne ve Liberman daha Corti, organı erişmek için farklı bir strateji kullanın. Böylece disseke doku büyük ve diseksiyon veya immün işlemleri sırasında kayıp ya da hasar olasılığı daha azdır. Buna ek olarak, güncel yöntem apikal uç veya frekans bölgesini tanımlamak için bazal kanca mesafenin ölçülmesini kolaylaştırır. Birçok laboratuarları koklear dokusunun immün gerçekleştirin rağmen bu yöntem nereden geldiğini, bu belli değildir. Bunun sonucunda Buffe engellemek için çeşitli tarifler vardırrs ve bireysel birincil antikor performansını etkileyebilir antikor inkübasyon tamponları. Burada, işitsel alanda en yaygın olarak kullanılan antikorlar için de geçerlidir floresan isim levhası antikor ile immünboyama için bir yöntem sunulmaktadır. Koklea karmaşık şekli, Corti organı hassas yapısı ve kemik kapatma histolojik ve biyokimyasal analiz için bir meydan okuma sağlamak. Çeşitli teknikler şu anda bu zor özellikleri aşmak ve Corti, kendi avantajları ve dezavantajları ile her tekniğin organı içindeki hücreleri görselleştirmek için işitme alanında kullanılmaktadır. Burada sunulan protokol küçük bir değişiklikle, potansiyel olarak bu alanda kullanılan diğer model organizmaların çeşitli cochleae içindeki kritik yapılara incelemek için kullanılabilir, yetişkin fare koklea bütün montaj diseksiyon sağlar ve.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1074">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:377px;">Standard&#160; pattern forceps</td>
			<td style="width:139px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11000-12</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">10.5 cm fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-11</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>18814</td>
			<td style="width:395px;">TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">end-over-end tube rotator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-450-127</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">activated charcoal</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC134372500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereo dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #4 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11241-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 jeweler&#39;s forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5 mm Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td>curved&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Vannas-Tubingen spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td>straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">48 well plates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-52</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">8 well chamber slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1256518</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-500</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA, fraction V</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1605</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NHS</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>S-2000</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3D rotator</td>
			<td>Midsci</td>
			<td>R3D-710</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western blot incubation box XL</td>
			<td>Licor</td>
			<td>929-97401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Prolong gold antifade mounting media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36930</td>
			<td style="width:395px;">can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">coverslips 22 x 22 x 1</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">clear nail polish</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cardboard slide folder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-587-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic slide box</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-448-10</td>
			<td>can be purchased from other vendors</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve tabanı) Şekil 1&#39;de sunulan anahtar diseksiyon adımlarla, kalsifiye olan koklear dokudan olarak Corti organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Gelişiminin ilk doğum sonrası haftasında, kalsifikasyon sırasında Fare koklea eksiktir ve daha basit bir diseksiyon yöntemi 13 kullanılabilir. Corti organı P7 gelen kokleadaki ve gözyaşları içinde eski fareler sonuçları ve parçalama ile neon...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea at JoVE.com

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası &#39;antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

whole-mount-dissection-immunofluorescence-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

54.6K Görüntüleme.  Southern Illinois University, School of Medicine.  Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar. 

Video: Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Nörobilim

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Yetişkin Tüm Dağı Hazırlık Drosophila Dev Fiber Boya Enjeksiyon Ventral Sinir Kablosu

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

Yetişkin Fare kesecik ve Adenovirüs aracılı Yardımcı hücre Enfeksiyon Diseksiyonu

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Labeling of Cilia in the Main Olfactory System of Mice

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.

Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single ...