Bu protokol, her yaştan gerbilin kokleasındaki sinaptik bütünlüğün değerlendirilmesini sağlar. Bu, özellikle yaşlanmaya bağlı işitme problemleriyle ilgili temel araştırmalar için önemlidir. Protokol nispeten hızlıdır ve koklea boyunca çeşitli konumlardan nicel veriler verir.
Ayrıca, bir otofloresan söndürücü kullanarak yaşlanan dokunun belirli bir problemini ele alır. Sinapsların dejenerasyonu, kokleadaki fonksiyon kaybının en erken belirtisidir. Niceliklendirme, sinaptopati için invaziv olmayan tanı araçları geliştirmeye yönelik araştırmalarda önemli bir araçtır.
Koklear diseksiyon, pratik gerektiren en önemli kısımdır, bu nedenle deneysel olmayan kokli ile başlamak daha iyidir. Bullaları çıkararak başlayın. Kemiği makasla kesin veya forseps ile kemiği çatlatın ve kokleaya ulaşmak için forseps ile çıkarın.
Malleus, incus ve yarım daire şeklindeki kanalları çıkarın. Kokleanın tepesini kaplayan kemiği dikkatlice çıkarın ve tepede ve bazal dönüşte küçük delikler açmak için koklear kemiği forseps ile çizin veya her iki yerde de dikkatlice delikler açın. Bullaları hemen en az 50 mililitre soğuk fiksatif içine aktarın.
Kokliyi ikiye bölmek için, kokleanın sarmal uzunluğundan daha uzun bir tıraş bıçağı parçasını bir bıçak tutucuya yerleştirin. Ardından, kokleayı stereo mikroskop altında bir Petri kabına yerleştirin. Fazla dokuyu tıraş bıçağı veya ince makasla kesin.
Kokleayı ince forseps ile yerinde tutun ve modiolus boyunca ikiye bölün. Otofloresan söndürücünün% 5'lik bir çözeltisini% 70 etanol ile karıştırarak hazırlayın. Kokli'yi bu çözeltiye yerleştirin ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin, ardından beş dakika boyunca bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın.
Kokleanın diseksiyonu için iki ince forseps, süper ince forseps, vannalar, yaylı makas, bıçak tutucu, tıraş bıçağı toplayın ve polistirol Petri kabını ve kapağını PBS ile doldurun. İki ila dört milimetrelik bir kesme yüzeyi elde etmek için tıraş bıçağından parçaları kırın. Kokleayı doku hazırlığı için bölümde gösterildiği gibi ikiye bölün.
Koklear yarısını, forseps ile kesilmiş kenar yukarı bakacak şekilde dikkatlice sabitleyin. Kokleanın kemiğini tepeyi kaplayan helikotremanın üzerinde kesmek için ince yaylı makas kullanın. Daha sonra, modiolus ve işitme siniri ve scala vestibuli'yi keserek apikal dönüşü izole etmek için makas kullanın.
Yukarıdaki koklear kemiğin her iki tarafında iki kesik yapın veya stria vascularis daha fazla değerlendirme için gerekli değilse, doğrudan orta dönüşün stria vascularis'inden geçin. Koklear parçalarını ayırmak için tıraş bıçağını kullanın. Alternatif olarak, Corti Organı ile stria vascularis arasında kesin.
Stria vascularis'i spiral ligamente bağlı bırakın ve forseps kullanarak kireçlenmiş kemiği çıkarın. Ardından, koklear parçalarını PBS ile doldurulmuş bir Petri kabı kapağına aktarın. Sütun ve modiolar taraflardaki fazla dokuyu çıkarın, böylece tüm montajlar daha sonra slaytta mümkün olduğunca düz bir şekilde uzanacaktır.
Büyük koklear parçalar, özellikle bazal dönüşten kaynaklananlar, iki parçaya bölünmelidir. Tektoryal membranı süper ince forsepslerle dikkatlice çıkarın. Koklear parçaları bir damla montaj ortamına kaydırarak Corti Organının yukarı bakmasını sağlayın.
Koklear parçayı sagital düzleme kaydırın ve iç saç hücrelerine yakın bir yerde spiral limbusun invaginasyonunu arayın. Spiral limbusun bu invaginasyonu orta ve bazal koklear parçalarda daha net görülebilir. Bu adımları tekrarlayarak tüm kokleayı ve tüm stria vaskülarisi mikroskop slaytına aktarın.
Kapak sürgüyü kaydırın ve sızdırmazlık için kenarların etrafına siyah oje ekleyin. Karanlıkta kurutun ve dört santigrat derecede saklayın. BioVoxxel eklentisi yüklü ImageJ yazılımında deconvolved yığınlarının bir kopyasını açın.
Görüntü'ye, ardından Renk'e ve ardından Kanalları Böl'e tıklayarak kanalları bölün. Farklı renkler atamak için Görüntü'ye, ardından Renk'e ve ardından Kanalları Birleştir'e tıklayarak bunları birleştirin. Görüntü'ye tıklayarak görüntüyü RGB yığınına dönüştürün, ardından Renk'e gidin ve RGB'ye Yığınla'ya tıklayın.
Görüntü, Ayarla ve ardından Parlaklık/Kontrast'a tıklayarak parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Sinaptik öncesi ve sonrası yapıların ve iç saç hücresi etiketlerinin arka plandan farklı olduğundan emin olmak için otomatik veya kaydırıcı kullanın. Yığın içinde istediğiniz yere tıklayarak metin aracıyla beş iç saç hücresini etiketleyin.
Ardından, Çözümle'ye, ardından Araçlar'a gidin ve YG Yöneticisi'ni seçin. Noktaları bir sayı ile etiketlemek için onay kutusu etiketlerini işaretleyin. İlgilendiğiniz iç saç hücresini yakınlaştırın.
Çok noktalı modu seçmek için nokta aracına sağ tıklayın. Z boyutunda ilerleyin ve sinaptik bir glutamat sonrası yama ile yan yana duran bir sinaptik öncesi şerit tarafından tanımlanan işlevsel şerit sinapslarını sayın. İlgilendiğiniz tüm yapıları seçtikten sonra, YG Yöneticisini Ekle'yi tıklayın, ardından rastgele adı tıklayın ve Yeniden Adlandır'ı seçin.
El aletiyle, görüntüyü bir sonraki iç saç hücresini tam olarak görüntüleyecek şekilde ayarlayın. Önceden depolanmış verilere daha fazla puncta eklemekten kaçınmak için Çok noktalı araçtan Nokta aracına geçin. Bir sonraki iç saç hücresindeki ilgi çekici bir yapıya tıklayın ve Çok noktalı araca geçin.
Tüm iç saç hücreleri değerlendirilene kadar ROI Yöneticisi'ne fonksiyonel şerit sinapsını eklemeye devam edin. YG Yöneticisi'nde bir veri kümesine ve ardından Ölçüm'e tıklayın. Ölçülen veri noktalarını listeleyen yeni bir pencerenin görünmesini bekleyin ve bu listeyi elektronik tablo olarak kaydetmek için Dosya ve Farklı Kaydet'i tıklayın.
YG Yöneticisi'nde Tümünü Göster'i etkinleştirerek görüntüyü kaydedin. Nokta etiketlerini yığına kalıcı olarak eklemek için Düzleştir'e tıklayın ve değişiklikleri kaydederek kapatmak için Kabul Et'e tıklayın. 10 aylık genç bir gerbilin kokleasından elde edilen Z yığını projeksiyonları, burada beyaz kesikli çizgilerle özetlenen miyozin 7A etiketli iç saç hücrelerinin arka planla keskin bir kontrast oluşturduğunu göstermektedir.
Ön sinaptik şeritler yeşil renkte gösterilen anti-CtBP2 iki ile etiketlenirken, sinaptik sonrası glutamat yamaları kırmızı renkte gösterilen anti-GluA2 ile etiketlendi. 38 aylık eski bir gerbilden gelen koklea, otofloresan söndürücü ile tedavi edildi ve açıkça görülebilen sinaptik öncesi ve sonrası yapılara sahip farklı iç saç hücreleri gösterdi. İmmünoetiketlemenin stabilitesini test etmek için, genç gerbilden aynı koklea parçası üç ay ve 29 1/2 ay sonra görüntülendi.
Azalmış sinyal-gürültü oranına rağmen, fonksiyonel sinapslar farklı ve ölçülebilirdi. Bir kesim başarısız olsa bile, daha sonra koklear uzunluğun tamamını en doğru şekilde tahmin etmek için kalan doku parçasını monte edin. Bu protokolden elde edilen veriler, elektrofizyolojik veya psikofiziksel işitme testlerinden önce ve daha sonra bireysel olarak ilişkilendirilirse özellikle değerlidir.
