Name: fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor at JoVE.com

This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.

Kılcal mikroreaktör hazırlanması 1. <ol><li> 100 um iç çap (ID) 360 um dış çap (OD) 7-8 cm uzunluğunda kılcal ve cam kılcal bıçağıyla 3-5 cm 20 um çapa x 90 mm OD kılcal X ekseni; herhangi çıkıntılı çapaklar olmadan, hem kılcal ucu temiz, düz bir kesim var mikroskop altında doğrulayın. </li><li> ~ 6 mm uzunluğunda, 100 um iç çap x 360 mm OD borunun bir ucuna 20 mikron iç çapa x 90 mm OD kılcal yerleştirin; ihtiyaç halinde, mikroskop altında bu işlemi dikkate alınmalıdır. </li><li> Q-ucu sonu ile 90 mikron OD / 100 mikron ID kılcal damarların birleştiği etrafında tutkal E6000 küçük bir damlacık uygulayın ve oda sıcaklığında tutkal kür O / N izin verin. </li><li> ~ 10-15 mm bir uzunluğa eklenir 20 um çapa x 90 mm OD kılcal kesme; Bu elektrosprey iyonizasyon yayıcı olacaktır. </li><li> Önceden kesilmiş 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; OD PEEK ve 1/16 &quot;OD PTFE küvetuzunluğunda 4-5 cm parçalar halinde ing; Bu bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için kılcal birlikleri kullanılan kollu olacak. </li><li> Bir PEEK birliğe 100 mikron ID x 360 mm OD kılcal ucunu bağlayın; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için bir 1/32 &quot;PEEK kol kullanabilirsiniz. </li><li> Ekle / birliğin karşısında sonunda içine 5 cm uzunluğunda 1/16 &quot;PTFE tüp ~ bir parça sıkın. </li><li> önceden temizlenmiş / 2 ml bir cam şişe kurutuldu C18 (5 um) bir parçacık ~ 4 mg ağırlığında; , 0.5 ml izopropanol ilave şişeyi kapatın ve ultrasonikatör banyosunda bulamaç dağıtmak. </li><li> , 250 ul şırınga yaklaşık 200 ul bulamaç ile çekilme PEEK birliği 1/16 &quot;PTFE tüp şırınga iğne takın ve yavaş yavaş 100 mikron ID x 360 mikron OD kılcal içine bulamaç dağıtmak; olarak mikroskop altında gözlemlemek kılcal elde edilir 2-3 mm&#39;lik ambalaj uzunluğu kadar parçacıklar ile doldurur, bu mikroreaktör olacaktır (Şekil 1), 20 μ.m kimliği kılcal bir Keystone etkisi ile mikroreaktör partikülleri tutar. 15 </li><li> H2O / CH3CN 50:50 h / h 50 ul çözeltisi ~ ile mikroreaktör yıkayın ve daha sonra H2O / CH3CN 98 50 ul çözeltisi ~ ile: 2 h / h. </li></ol> Örnek Çözümleri 2. Hazırlık Not: Organik çözücü ve asitler ve çözelti hazırlama kullanımı içeren İşlemler davlumbaz ifa edilecek olan vardır. gözlük, eldiven ve koruyucu giysiler giyin. <ol><li> CH3 OH ile yıkayın ve bir kaç küçük cam şişeler (4 mi) ve polipropilen tüpleri (15 mi) kuru. </li><li> H2O / CH3CN içindeki bir çözeltisine, 10 ml hazırlama (98: 2 h / h), 15 ml polipropilen bir tüp içinde 200 ul CH3CN ile 9.8 mL H2O karıştırarak; sonikasyon ile karıştırın. </li><li> Oluşan bir çözeltiye 10 ml hazırlamak H2O / CH3CN (50:50 h / h), 15 ml polipropilen bir tüp içinde 5 ml H2 karıştırılarak &lt;/ sub&gt; O ile 5 ml CH3CN; sonikasyon ile karıştırın. </li><li> H2O / CH3CN, 4 ml 4 ul TFA (% 10) eklenmesi ile asitleştirilmiş sulu bir çözeltisi (TFA% 0.01 h / h) 4 ml hazırlanması: Bir 4 ml bir cam şişe içinde (98 2 h / h); sonikasyon ile karıştırın. </li><li> 4 ml H2O / CH3CN (50:50 h / h) &#39;de 4 ml bir cam şişeye 4 ul TFA (% 10) eklenmesi ile asitleştirilmiş, organik çözelti (TFA% 0.01 h / h) 4 ml hazırlamak; sonikasyon ile karıştırın. </li><li> 16 mg NH4 HCO3 tartılır 4 ml bir cam şişe içinde, bir analitik mikro-dengesi ile; (: 2 h / h 98) çözeltisi ve sonikasyon ile dispers, 2 O / CH3CN H 4 ml Bu sulu tampon içinde NH4 HCO3 (pH ~ 7.8), 50 mM çözeltisi ile sonuçlanır. </li><li> Standart proteinin 5 mg ağırlığında (örneğin, büyükbaş hayvan serum albümin, hemoglobin α / β, sitokrom c, karbonik anhidraz, α-2-HS-glikoprotein, vs.), bir 4 ml cam tüp içinde bir analitik mikro-dengesi ile; 4 mi DI wate eklemer ve sonikasyon ile dağıtmak; Bu, tipik olarak yüksek bir uM düzeyinde konsantrasyonu çözelti ile sonuçlanır. </li><li> NH4 HCO3 (50 mM), sulu tampon, uygun hacimde yüksek uM düzeyinde konsantrasyonu çözeltisi ile seyreltilmesi ile 1 ml protein çözeltisi (1-2 uM) hazırlama; sonikasyon ile karıştırın. </li><li> (50 mm) NH4 HCO3 170 ul sulu tampon 20 ug dizileme dereceli tripsin eritilerek tripsin çözeltisi (5 uM) hazırlama; sonikasyon ile dağılır. </li></ol> 3. Deneysel Kurulum Not: LTQ-MS sistemi, çeşitli örnek giriş yaklaşımlara kütle spektrometresi arabirim sağlayan bir ev yapımı XYZ kademeli içeren değiştirilmiş bir ESI kaynağı ile donatılmıştır. <ol><li> PEEK sendikası kılcal mikroreaktör ayırın ve PEEK Tee bağlanın. </li><li> PEEK Tee yan kolunda bir ~ 2 cm uzunluğunda Pt tel takın; Bir temin edilmesi için bir 1/32 &quot;PEEK kol kullanabilirsinizkaçak ücretsiz bağlantı ve Pt tel yalıtım. </li><li> PEEK Tee karşı ucuna (~ 0.5 m uzunluğunda) Örnek transferi kılcal kanallardan 50 mikron çapa x 360 um OD geç; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için bir 1/32 &quot;PEEK kol kullanabilirsiniz. </li><li> XYZ-sahnede PEEK Tee Güvenli ve uzak kütle spektrometresi giriş kılcal ESI yayıcı ~ 2 mm yerleştirin. </li><li> kütle spektrometresi ESI güç kaynağı kaynağına Pt tel bağlayın. </li><li> Paslanmaz çelik birliğe örnek transferi kılcal ucunu bağlayın; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için 1/16 &quot;PEEK kol kullanabilirsiniz. </li><li> Paslanmaz çelik birliği karşı ucuna 4-5 cm uzunluğunda 1/16 &quot;PTFE tüp bağlayın ve PTFE tüp 250 ul şırınga iğneyi; örneğin (pompa açmak ve istenilen değerde akış hızını ayarlamak, 2 ul / dakika). </li><li> MS Enstrüman bir kontrol yazılım paketi içine girdi tandem MS veri toplama parametrelerianalizi yapmak için hazır kurulum için bir yöntem dosyası olarak kaydetmek d; LTQ-MS sistemi için, aşağıdaki veri bağımlı analiz parametreleri kullanabilirsiniz: dışlama kitle genişliği ile 180 saniye süreyle etkin dinamik dışlama 1,5 m / z ±; bir MS bir zoom ardından tarama ve MS ilk 5 en yoğun zirveleri üzerinde 2 tarama, 5 m / z ± tarama genişliği Büyütmek; çarpışma kaynaklı ayrışma izolasyon genişliği 3 m / z, normalize çarpışma enerjisi% 35, aktivasyon Q 0.25 ve aktivasyon zamanında 30 milisaniye olarak belirlenmiştir (CID) parametreleri. </li></ol> 4. mikroakışkan Kur <ol><li> Cam ya da polimerik substratlardan mikroakışkan cihazı hazırlanması; bir girişine bağlı 16-18 cihazının yerleştirimini Şekil 2A&#39;da verilmiştir bir mikroreaktör oluşan (1) (0.13 mm genişlik x 2 mm uzunluk x 50 mm derinlik) (2 ), çıkışı (3) ve bir yan bağlantı noktası (4); Akışkan manipülasyonları için birbirine kanal ~ vardır110 mikron genişliğinde ve ~ 50 mikron derin; Çok kanallı yapı (5), oluşan ~ 1.5-2 mm derinlik x 10 mm genişlik x yerleştirilmiş 100 mikron uzunluğunda mikrokanallar 25 mikron dışında, mikroreaktör parçacıkları tutmak için bir filtre görevi görür. </li><li> Veya sıvı teslim (Şekil 2B) için parçaları barındıran bir polimerik tavır oluşturulması yoluyla giriş delikleri için özel konnektörleri yapıştırma çip sıvı-teslim bağlantılarını etkinleştirin. 16 </li><li> Aşama 1.8 de tarif edildiği gibi C 18 partikülleri (5 um) bir bulamaç hazırlamak; çip yan bağlantı noktasına bağlı 1/16 &quot;PTFE boru kullanarak bir şırınga ile mikroreaktör bulamaç sağlamak (4) 90 ° C sıcaklıktaki bir fırın içerisinde epoksi yapıştırıcı ve 1 saat için tedavi ile birlikte partikül yüklemeden sonra ağız yalıtım 16. </li><li> kür O / N E6000 yapıştırıcı ile mühürlenir, izin, çıkış limanında bir kılcal (20 mikron ID x 90 mm OD x 10 mm uzunluk) yerleştirin; Bu (ESI yayıcı olur <sTrong&gt; 6). </li><li> 50 mikron ID x 360 mikron OD bağlayın (~ 0.5 m uzunluğunda) yonga giriş portuna örnek transferi kılcal (2); 3.6-3.7 tarif edildiği gibi, bir 250 ul şırınga ve şırınga pompasına kılcal karşıt ucunu. </li><li> Giriş portuna hemen önce numune transfer hattı üzerinde, bir hafif PEEK bağlantı parçası yerleştirin (2) ve T-şekilli yan koluna bir Pt tel takmak, 3.2 de tarif edildiği gibi; Bu ESI elektrot olacaktır. </li><li> kütle spektrometresi giriş kılcal ~ 2 mm uzakta konumlandırılmış ESI yayıcı ile XYZ sahnede mikroakışkan cihaz Güvenli; 3.8 de tarif edildiği gibi analiz için MS hazırlar. </li></ol> 5. Numune Yükleme, MS Analizi için proteolitik sindirim ve Elüsyon Tüm solüsyon / Örnek aktarım basamağı, bir şırınga pompası yardımıyla gerçekleştirilir ve ölü volum telafi etmek için, tamamlamak için bir kaç dakika daha izin vermelidir: Notve mikroreaktör transfer hatları ile ilişkili es; Gerekli zaman ilgili akış oranları bağlıdır. <ol><li> Mikroreaktör durulayın ve 2 O / CH3CN H sulu bir NH4 çözeltisi HCO3 (50 mM) infüzyonu ile analiz için hazırlayın: 5 dakika için 2 ul (98 2 h / h) / dk; 250 ul şırınga kullanın. </li><li> 2 ul örnek çözeltisi infüzyonu ile mikroreaktör protein örneği (1 uM) yük / dakika, 5 dakika boyunca; 250 ul şırınga kullanın. </li><li> 1-3 dakika / 2 ul dakika mikroreaktör üzerinde adsorbe protein üzerinde tripsin solüsyonu (5 mcM) demlenmeye. </li><li> TFA asitleştirilmiş sulu bir çözelti ile mikroreaktör durulayarak proteolitik sindirim süreci söndürün (% 0.01 hacim / hacim) H2O / CH3CN (98: 2 h / h) 2 ul / dakika, 5 dakika boyunca, 250 ul şırınga kullanın. </li><li> (Protein TFA bir asitleştirilmiş organik bir çözüm beslerken tarafından mikroreaktör gelen sindirmek akıtılarak% 0.01 başlath / h) H2O / CH3CN (50:50 h / h), 300 NL / dakika. </li><li> MS veri toplama süreci ve ESI voltajı (~ 2.000 V) açın; Adım 3.8 sağlanan veri toplama parametreleri kullanılarak MS veri elde; Triptik peptidlerin elüsyonu izleyin. </li></ol> 6. Veri İşleme <ol><li> Ham MS veri formatı ile uyumlu bir arama motoru ile tandem MS verileri işlemek. <ol><li> bir organizmanın belirli minimal gereksiz protein veritabanı kullanılarak LTQ-MS ham dosyaları işlemek; , Arama motoru ham veri yüklemek, sırasıyla 2 ve 1 Da ebeveyn ve fragmanı iyon kütle toleransları ayarlayın ve en fazla iki arama çatışmaları cevapsız ile sadece tam triptik parçaları kullanmak; posttranslasyonel modifikasyonlar için izin vermez; sırasıyla% 1 ve% 3, yüksek ve orta-güven yanlış keşif oranları (FDR) ayarlamak ve posttranslasyonel modifikasyonlar için izin vermez. </li></ol></li><li> sadece yüksek güven seçmek için verileri filtrelemekpeptid veritabanındaki proteinlere maçları; Protein ve peptid düzeyi sonuçlarını değerlendirmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Petersen, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Bioreactors.">Microfluidic Bioreactors.</a> Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).</li><li>Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+and+applications+of+immobilized+microfluidic+enzymatic+reactors.">Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).</li><li>Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+enzymatic+reactors+for+proteome+research.">Microfluidic enzymatic reactors for proteome research.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).</li><li>Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping:+strategy,+characterization,+and+performance.">Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance.</a> LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).</li><li>Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchip-based+proteolytic+digestion+system+driven+by+electroosmotic+pumping.">A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping.</a> LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).</li><li>Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-immobilized+microfluidic+process+reactors.">Enzyme-immobilized microfluidic process reactors.</a> Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).</li><li>Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+enzyme+reactor+mass+spectrometry+platform+for+detection+of+anthrax+lethal+factor.">Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor.</a> , 1071-1074 (2009).</li><li>Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+microfluidic+enzyme+reactor+utilizing+magnetic+beads.">Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads.</a> Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).</li><li>Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold+nanoparticle+assembly+microfluidic+reactor+for+efficient+on-line+proteolysis.">Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).</li><li>Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Titania+and+alumina+sol-gel-derived+microfluidics+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping:+design,+characterization,+and+performance.">Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance.</a> J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).</li><li>Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+protein+digestion+through+the+confinement+of+nanozeolite-assembled+microchip+reactors.">Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors.</a> Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).</li><li>Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+enzyme+reactor+and+high+resolving+chromatography+in+&amp;#34;sub-chip&amp;#34;+dimensions+for+sensitive+protein+mass+spectrometry.">Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in &amp;#34;sub-chip&amp;#34; dimensions for sensitive protein mass spectrometry.</a> Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).</li><li>Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwave-enhanced+enzyme+reaction+for+protein+mapping+by+mass+spectrometry:+A+new+approach+to+protein+digestion+in+minutes.">Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes.</a> Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).</li><li>Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-assisted+sample+preparation+for+proteomic+analysis.">Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.</a> Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).</li><li>Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapers+and+restrictors+for+capillary+electrochromatography+and+capillary+electrochromatography-mass+spectrometry.">Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).</li><li>Lazar, I. M., Kabulski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+LC+Device+with+Orthogonal+Sample+Extraction+for+On-Chip+MALDI-MS+Detection.">Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection.</a> Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).</li><li>Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+and+sample+injection+systems+on+a+planar+glass+chip.">Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip.</a> Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).</li><li>Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Injection+Schemes+and+Column+Geometry+on+the+Performance+of+Microchip+Electrophoresis+Devices.">Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices.</a> Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).</li><li>Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Proteomic+Protocol+for+Biomarker+Fingerprinting+in+Cancerous+Cells.">Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).</li><li>Doucette, A., Craft, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+Spectrometric+Study+of+the+Effects+of+Hydrophobic+Surface+Chemistry+and+Morphology+on+the+Digestion+of+Surface-Bound+Proteins.">Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).</li><li>Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Liquid+Chromatography+System+for+Proteomic+Applications+and+Biomarker+Screening.">Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening.</a> Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).</li><li>Lazar, I. M., Karger, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Open-Channel+Electroosmotic+Pumping+System+for+Microfluidic+Sample+Handling,&amp;#34.">Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,&amp;#34.</a> Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).</li><li>Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+TOFMS+Detection+for+Capillary+Electrophoresis.">High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis.</a> Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Bu çalışmada tarif mikroreaktör sağlayan kolay uygulanması en az 30 dakika, MS analizi ve tanılanması için proteinlerin enzimatik sindirim yapmak için deney düzeneği. Geleneksel yaklaşımlara kıyasla bu sistemin farklı avantajları, basitlik, hız, düşük reaktif tüketimi ve düşük maliyetleri içerir. Özel olarak, pahalı bir hareketsiz tripsin boncuk ve kartuş için bir ihtiyaç vardır. Kılcal mikroreaktör hazırlanması basit (Şekil 1A), ve genel olarak, bir kromatografi lab...

saflaştırılmış proteinlerin belirlenmesi ve tanımlanması, genellikle MS teknikleri kullanılarak elde edilir. Protein bir enzimle sindirilir ve peptitler, basit bir infüzyon deney düzeneği kullanılarak MS ile analiz edilir. Proteolitik sindirim çoğu MS analiz yararlı kütle aralığında düşüş küçük peptid fragmanlarını üretmek için gerekli olan ve kolayca amino asit sekansı bilgi üretmek için düşük enerji çarpışma kaynaklı ayrışma yoluyla parçalanmış olabilir. izole edilmiş proteinler veya basit bir protein karışımları için, MS tespiti önce peptitlerin kromatografik ayrılması için başka bir ihtiyaç vardır. 25-50 peptidlerinin bir karışım, kolayca MS iyonu kaynağı, doğrudan bir şırınga pompası ile örnek infüzyonu ile analiz edilebilir. kütle spektrometresi analizi yapmak ve kısa zaman çerçevesi içinde bir proteinin dizisini teyit edebilir. modern veri elde etme yöntemleri ile, bu işlem, ağ yapılabilirbirkaç dakika, hatta saniye ithin. Kısa bir süre ölçeğinde tüm süreci tamamlamada sınırlayıcı faktör proteolitik sindirim adımdır. Tipik haliyle, bu işlem birkaç saat süreyle gerçekleştirilir (veya O / N), çözelti içinde, 37 ° C &#39;de, alt-tabaka kullanılarak: (50-100) enzim oranı: 1 arasındadır. Tarif edilmiştir mikroakışkan reaktörler veya ticari olarak temin edilebilen kartuş formunda, dakika ya da saniye hareketsizleştirilmiş enzim mikroreaktörlerde enzimatik sindirim süresini azaltmak için. 1-6 Tipik olarak enzim kovalent, kovalent olmayan bir fiziksel / adsorpsiyon, kompleks immobilize edilir oluşumu ya da kapsülleme, enzimatik işlemin 3,6 geliştirilmiş verimlilik ile elde edilmiş olmaktadır geniş yüzey-hacim ve enzim için alt-tabaka-oranları. immobilize reaktör diğer avantajları, MS analizinde enzimden otolitik ve parazit azalır enzim stabilitesi ve tekrar kullanılabilirliği geliştirilmiş bulunmaktadır. yaklaşımlar, cam ile ya da polimerik mikrofabrike cihaz çeşitli tarif edilmiştirantikor-antijen etkileşimleri, manyetik boncuklar üzerinde hareketsizleştirilmiş enzimleri kullanılarak, 7,8 9 titanyum-alümina sol-jel 10 ve nanozeolites, 11 içinde kapsüllenmiş ya da Ni-NTA veya His-Tag kompleks oluşumu yoluyla çekilen altın nano partiküler ağlarında yakalanmış. 6 Alternatif immobilize enzimler ile açık boru şeklindeki kılcal damarlar, hem de geliştirilmiştir. 12 Dahası, gelişmiş proteolitik bölünme 30-120 reaksiyon sürelerini azaltmak için kontrollü mikrodalga ışıması 13 veya basınç destekli veya basınç çevrim teknolojisi (PCT) kullanılarak ortaya konmuştur min. 14 İmmobilize enzim reaktörlerin birden avantajlarına rağmen, ticari kartuş maliyetleri yüksek olduğu, rutin kullanım için mikroakışkan cihazların kullanılabilirliği sınırlıdır ve ek araçları için ihtiyaç mikrodalga veya PCT teknolojileri sonuçlarının kullanılması. Bu çalışmanın amacı, circumve bir yöntem geliştirmektiBu dezavantajların NTS ve kolayca dakika içinde MS analizi için hazırlık proteinlerin enzimatik bölünme gerçekleştirmek için basit ve etkili bir yaklaşımla araştırmacılar güçlendirmek için, her laboratuarda uygulanabilir. yaklaşım kılcal ya da mikroakışkan cihaz önceden yüklenmiş olan hidrofobik, C18 partiküllerin kullanımına dayanır ve fazla enzimin infüzyonu sırasında enzimatik sindirme ile ve ardından bu parçacıklar üzerindeki ilgili protein (ler) adsorpsiyonu dolgulu yatak ve yakalanan protein (ler). Bu yaklaşımda, alt-tabaka kovalent olmayan etkileşimlerle hareketsizleştirilen edilir ve enzim hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​fazla demlenir. proteolitik sindirim verimliliği, enzimatik işlem, daha az ve parçacıkların yüzeyinden uzaklıkları ve yayılma süreleri için protein açığa büyük bir tanecik yüzey alanı artmıştır kütle transferi, enzim etkinliğine etki eden herhangi bir kovalent bağlanması, yeteneği artar hızla değerlendirme,Farklı enzimler, disposability ve çoğullama e kombinasyonları süreci mikroakışkan biçimde yürütülür ise. Bu yaklaşım, standart proteinler ve ESI-MS tespiti önce proteolitik sindirimi için tripsin en yaygın olarak kullanılan enzim karışımı kullanımı ile gösterilmiştir. Bu çalışmada tespiti için kullanılan kütle spektrometresi doğrusal bir tuzak dört kutuplu (LTQ) enstrüman oldu.

<table><tbody><tr><td>Ion trap ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data</td></tr><tr><td>XYZ stage</td><td>Newport</td><td>Multiple parts</td><td>The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>The microscope is used to observe the microreactor packing process</td></tr><tr><td>Analytical balance/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>The balance is used to weigh the protein samples</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry</td></tr><tr><td>Syringe pump 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor</td></tr><tr><td>Milli-Q ultrapure water system</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&amp;nbsp;</td><td>The MilliQ water system is used to prepare purified DI water</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (100 &amp;micro;m ID x 360 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>This capillary is used for the fabrication of the microreactor</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (20&amp;nbsp;&amp;micro;m ID x 100 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (50&amp;nbsp;&amp;micro;m ID x 360 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor</td></tr><tr><td>Glass capillary cleaver</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded</td></tr><tr><td>Reversed phase C18 particles (5&amp;nbsp;&amp;micro;m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4&amp;nbsp;mm x 20 cm C18 LC column from Agilent</td></tr><tr><td>Syringe/glass (250 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor</td></tr><tr><td>Internal reducing PEEK Union (1/16&amp;rdquo; to 1/32&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>This union is used to connect the 250 &amp;micro;l syringe to the microreactor for loading the 5 &amp;micro;m particle slurry</td></tr><tr><td>Stainless steel union (1/16&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary</td></tr><tr><td>Microvolume PEEK Tee connector (1/32&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire</td></tr><tr><td>Tee connector (light weight)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line</td></tr><tr><td>Pt wire (0.404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply</td></tr><tr><td>PTFE tubing (1/16&amp;rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK tubing (0.015&amp;rdquo; ID x 1/16&amp;rdquo; OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50&amp;nbsp;&amp;micro;m ID transfer capillary</td></tr><tr><td>PEEK tubing (0.015&amp;rdquo; ID x 1/32&amp;rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee</td></tr><tr><td>Clean-cut polymer tubing cutter</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>This cutter is used to pre-cut the 1/16&amp;rdquo; and 1/32&amp;rsquo; Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length</td></tr><tr><td>Amber vial (2 ml)</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amber vial (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>The vials are used to prepare sample solutions</td></tr><tr><td>Polypropylene tube (15&amp;nbsp;ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>The vials are used to prepare buffer solutions</td></tr><tr><td>Cylinder (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td></tr><tr><td>Cylinder (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td></tr><tr><td>Pipette tips (1,000 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips (100 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Glass substrates</td><td>Nanofilm</td><td>B270 white crown, 3&amp;rdquo; x 3&amp;rdquo;</td><td>These are glass substrates for microchip fabrication</td></tr><tr><td>Male nut fitting (1/16&amp;rdquo;)</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Nanoport assembly</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Protein standards</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, HPLC grade</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, sequencing grade</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor

kütle spektrometrisi (MS) büyük çoğunluğu, protein analiz yöntemleri, tipik olarak tripsin ile, saptama için enzimatik sindirim aşamasından önce dahil tabanlı. Bu adım, kütle spektrometrisi enstrümantasyon etkili tarama aralığı içinde MW &lt;3.000-4.000 Da genellikle, küçük molekül ağırlıklı peptid üretimi için gereklidir. Geleneksel protokoller 37 ºC&#39;de O / N enzimatik sindirim içerir. Son gelişmeler, tipik olarak, örneğin, mikrodalga ya da yüksek immobilize enzim ya da bir kaç dakika için proteolitik sindirimi için gerekli zamanı azaltmak tamamlayıcı fiziksel işlemler (bir dizi bir mikroreaktör kullanılmasını içeren, farklı stratejiler, gelişmesine yol açmıştır baskı). Bu çalışmada, bir proteinin hızlı bir enzimatik sindirim elde etmek için herhangi bir laboratuvar uygulanabilir basit ve maliyet-etkin bir yaklaşımı açıklar. Protein (veya protein karışımı) C18-bağlanmış ters fazlı yüksek perf üzerine emdirilirbir kılcal sütununda önceden sıvı kromatografisi (HPLC), silis parçacıkları sergilemiş ve sulu tampon içinde tripsin kısa bir süre için parçacıklar üzerinde demlenir. on-line MS algılanmasını sağlamak için triptik peptidler MS iyon kaynağı, doğrudan artan bir organik içeriğe sahip olan bir çözücü sistemi ile elüt edilmiştir. Bu yaklaşım, yüksek fiyatlı immobilize enzim parçacıklarının kullanımını önler ve işlemi tamamlamak için herhangi bir yardım gerektirmez. Protein sindirimi ve tam bir örnek analizleri sırasıyla ~ 30 dakika az 3 ~ daha dk gerçekleştirilebilir ve yapılabilir.

Proteolitik sindirim işleminin temsili bir sonuç, yukarıda tarif edilen mikroreaktörlerde (Şekil 1 ya da 2), Tablo 1 &#39;de verilmektedir sahip bir protein karışımı, eşzamanlı olarak gerçekleştirilir. Tablo belirli bir protein tespit benzersiz peptid dizilerini ihtiva eder, çapraz korelasyon skoru (Xcorr) (yani, ilgili tandem kütle spektrumunda deneysel-to-teorik maçın kalitesini karakterize bir skor), cevapsız bölünmeler sa...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor at JoVE.com

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

fast-enzymatic-processing-proteins-for-ms-detection-with-flow-through

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K Görüntüleme.  Virginia Tech. A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Video: Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biyokimya

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, glass coverslips are functionalized in a one-step reaction with silane-PEG-biotin. Flow cells are constructed by sandwiching an adhesive tape with pre-cut channels between a functionalized coverslip and a PDMS slab containing inlet and outlet holes. Multiple channels are integrated into one flow cell and the flow of reagents into each channel can be fully automated, which significantly increases the assay throughput and reduces hands-on time per assay. Inside each channel, biotin-&#955;-DNAs are immobilized on the surface and a laminar flow is applied to flow-stretch the DNAs. The DNA molecules are stretched to &#62;80% of their contour length and serve as spatially extended templates for studying the binding and transport activity of fluorescently labeled molecules. The trajectories of single molecules are tracked by time-lapse Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) imaging. Raw images are analyzed using streamlined custom single particle tracking software to automatically identify trajectories of single molecules diffusing along DNA and estimate their 1D diffusion constants.

This protocol demonstrates a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying one-dimensional (1D) diffusion of molecules along DNA.

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Biyomühendislik

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate protein interactions, structure, and protein conformational dynamics as a function of solvent accessibility. In recent years, the scope of FPOP, a hydroxyl radical protein foot printing (HRPF) technique, has been expanded to protein labeling in live cell cultures, providing the means to study protein interactions in the convoluted cellular environment. In-cell protein modifications can provide insight into ligand induced structural changes or conformational changes accompanying protein complex formation, all within the cellular context. Protein footprinting has been accomplished employing a customary flow-based system and a 248 nm KrF excimer laser to yield hydroxyl radicals via photolysis of hydrogen peroxide, requiring 20 minutes of analysis for one cell sample.To facilitate time-resolved FPOP experiments, the use of a new 6-well plate-based IC-FPOP platform was pioneered. In the current system, a single laser pulse irradiates one entire well, which truncates the FPOP experimental time frame resulting in 20 seconds of analysis time, a 60-fold decrease. This greatly reduced analysis time makes it possible to research cellular mechanisms such as biochemical signaling cascades, protein folding, and differential experiments (i.e., drug-free vs. drug bound) in a time-dependent manner. This new instrumentation, entitled Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), allows the user to perform cell culture and IC-FPOP directly on the optical bench using a platform incubator with temperature, CO2 and humidity control. The platform also includes a positioning stage, peristaltic pumps, and mirror optics for laser beam guidance. IC-FPOP conditions such as optics configuration, flow rates, transient transfections, and H2O2 concentration in PIXY have been optimized and peer-reviewed. Automation of all components of the system will reduce human manipulation and increase throughput.

A new static platform is used to characterize protein structure and interaction sites in the native cell environment utilizing a protein footprinting technique called in-cell fast photochemical oxidation of proteins (IC-FPOP).

Hareketli XY Stage ile Platform İnkübatörü: Proteinlerin Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonunu Uygulamak İçin Yeni Bir Platform

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Otomatik Proteomik İşleme Dijital Mikroakiskan

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Biyoloji

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Electrowetting-based Digital Microfluidics Platform for Automated Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits the dielectric properties of thin insulator films to enhance the charge density and hence boost the electrowetting effect. The presence of charges results in an electrically induced spreading of the droplet which permits purposeful manipulation across a hydrophobic surface. Here, we demonstrate EWOD-based protocol for sample processing and detection of four categories of antigens, using an automated surface actuation platform, via two variations of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) methods. The ELISA is performed on magnetic beads with immobilized primary antibodies which can be selected to target a specific antigen. An antibody conjugated to HRP binds to the antigen and is mixed with H2O2/Luminol for quantification of the captured pathogens. Assay completion times of between 6 and 10 min were achieved, whilst minuscule volumes of reagents were utilized.

Electrowetting-based digital microfluidic is a technique that utilizes a voltage-driven change in the apparent contact angle of a microliter-volume droplet to facilitate its manipulation. Combining this with functionalized magnetic beads enables the integration of multiple laboratory unit operations for sample preparation and identification of pathogens using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Electrowetting is the effect by which the contact angle of a droplet exposed to a surface charge is modified. Electrowetting-on-dielectric (EWOD) exploits ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks of Parkinson's disease. Yet, much of its biological activity, as well as its aggregation, centrally involves the soluble monomer form of the protein. Elucidation of the molecular mechanisms of aSyn biology and pathophysiology requires structurally highly resolved methods and is sensitive to biological conditions. Its natively unfolded, meta-stable structures make monomeric aSyn intractable to many structural biology techniques. Here, the application of one such approach is described: hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry (HDX-MS) on the millisecond timescale for the study of proteins with low thermodynamic stability and weak protection factors, such as aSyn. At the millisecond timescale, HDX-MS data contain information on the solvent accessibility and hydrogen-bonded structure of aSyn, which are lost at longer labeling times, ultimately yielding structural resolution up to the amino acid level. Therefore, HDX-MS can provide information at high structural and temporal resolutions on conformational dynamics and thermodynamics, intra- and inter-molecular interactions, and the structural impact of mutations or alterations to environmental conditions. While broadly applicable, it is demonstrated how to acquire, analyze, and interpret millisecond HDX-MS measurements in monomeric aSyn.

The structural ensemble of monomeric alpha-synuclein affects its physiological function and physicochemical properties. The present protocol describes how to perform millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry and subsequent data analyses to determine conformational information on the monomer of this intrinsically disordered protein under physiological conditions.

Fizyolojik Koşullar Altında Alfa-Sinüklein Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Milisaniye Hidrojen / Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...