Biz Doğal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) ve mali destek için Kanada Kanser Derneği teşekkür ederim. SCCS sayesinde NSERC ve VNL sayesinde lisansüstü eğitim bursları için Ontario Yüksek Lisans Bursu (OGS) programı. ARW Kanada Araştırma Başkanı CRC teşekkürler.

Bölüm 1: Cihaz Fabrikasyon <ol><li> Piranha çözüm temiz bir cam yüzeyler (3:1 kons sülfürik asit:% 30 hidrojen peroksit). Piranha çözümü için sık sık ajitasyon ile 10 dakika Yüzeyin bırakın. </li><li> Deiyonize (DI) su ile durulama ve N 2 gazı ile substratlar kurutma sonra, elektron ışını odasının içine, krom birikimi (250 nm kalınlığı) substratları yerleştirin . </li><li> Krom kaplı substrat kurutmak için, sonra 115, 5 dakika sıcak bir plaka üzerinde fırında isopropanol yıkayın ve ° C </li><li> Spin kaplama (30 s, 3000 rpm) yüzeylerde ve prime hexamethyldisilazane (HMDS) ile kurulayın. Shipley S1811 fotorezist ile yeniden Spin-kat (aynı parametreleri kullanarak). </li><li> Ön fırında sıcak bir tabak (100 ° C, 2 dak) substrat, daha sonra desen bir photomask üzerinden 5 sn ışınlama için ultraviyole (UV) maruz kalma fotorezist. </li><li> Shipley MF 321 geliştirici DI suda 3 dakika ve yıkama UV ışınlarına maruz kalan yüzeylerde geliştirin. 100 sıcak bir tabak Post-fırında ° C 1 dak. </li><li> 30 saniye krom asitlenmesi daldırma Asitli maruz krom Kalan fotorezist kaldırmak için, 10 dakika AZ300T striptizci sonra batırmayın, DI su ile durulayın. DI suyla durulayın ve N 2 gazı ile kurulayın. </li><li> Mevduat 2-5 mikron krom desenli bir substrat yatak üzerine kimyasal buhar Parylene-C (bir yalıtkan polimer) birikimi. Mevduat 60 s 2000 rpm&#39;de spin kaplama çözeltisi (% 1 ağırlık / ağırlık Fluorinert de FC-40) ile 50 nm (yüzeyini hidrofobik yapmak için Teflon-AF) Post-sıcak bir tabak (160 ° C, 10 dakika) pişirin. </li><li> Üst plaka formu için, bir kat yukarıda un desenli indiyum kalay oksit (ITO) cam yüzeylerde 50 nm Teflon-AF. </li><li> Sıcak bir tabak (160 ° C, 10 dk) hem substratlar Post-pişirin. </li></ol> Bölüm 2: Cihaz Set-up ve Otomasyon <ol><li> &quot;Iki-plate&quot; yapılandırma işletilen dijital mikroakışkan cihazlarda bir alt yüzey (desenli elektrotlar) ve bir üst substrat (genellikle İTO oluşan bir bitişik, şeffaf elektrot,), 1 damlacıkları arasında konumlandırılmış. </li><li> Cihazı kurmak için, bir bistüri ile nazik kazıma tarafından bir alt substrat temas pedleri polimer kaplamalar çıkarın. Çift, 40-pin konnektör (Şekil 1a) ile alt zemin pedleri maruz. </li><li> Power-on LabView (National Instruments, Austin, Teksas), bir ev inşa edilmiş bir kontrol kutusu (National Instruments DaqPad gelen sinyaller tarafından kontrol edildiği bir dizi yüksek gerilim röleleri), bir fonksiyon jeneratör ve bir amplifikatör çalıştıran bir bilgisayara . Bilgisayar / kontrol kutusu, 100 V RMS / 18 kHz sinyaller 40-pin konnektörü üzerinden cihaza uygulama üzerinde kullanıcı kontrolü kolaylaştırır . </li><li> Alt yüzey kenarları çift taraflı bant ile iki adet (140 mikron toplam kalınlığı) konumlandırma cihazı birleştirin ve unpatterned İTO slaytlar (üst plaka) ile tamamlandı. </li><li> Kontrol sistemi başlatmak için, geri beslemeli kontrol kalibre için LabView kalibrasyon programı (in-house yazılı) çalıştırın. </li><li> Numune ve reaktiflerin uygun rezervuarlar (bkz. aşağıdaki bölüm 3) içine yerleştirin ve en substrat (Teflon kaplamalı yüzü aşağı bakacak şekilde) içine alın. Üst yüzey toprak fişini takın. </li><li> LabView kumanda kodu (in-house yazılı) yükleyin ve damlacık harekete başlatmak için programı çalıştırmak. </li></ol> Bölüm 3: Numune ve Reaktif Hazırlama <ol><li> 100 mM TrisHCl (pH 7.8) ve% 0.08 Pluronic F127 w / v: çalışma tamponu (WB) hazırlayın </li><li> Şekil 1b gösterildiği gibi WB ve pipetle numune cihaz üzerindeki rezervuar 1 (R-1) analiz edilecek protein (ler), çözülür. </li><li> R-2 Yağışlı,% 20 Trikloroasetik DI su asit (TCA), pipet hazırlayın. </li><li> Tampon yıkama hazırlayın, 70/30 Kloroform / R-4 asetonitril (ACN) ve pipet içine. </li><li> R-5 resolubilizing tampon, 100 mM Amonyum Bikarbonat (pH 8.0) ve% 0,08 Pluronic F127 w / v ve pipet hazırlayın. </li><li> R-6 içine indirgeyici, tris (2-carboxyethyl) fosfin (TCEP), DB ve pipet 10 mM eritin. </li><li> Alkilleyici ajan, iodoacetamide (IAM), R-7 WB ve pipet 12 mM eritin. </li><li> WB R-8, total protein örneği konsantrasyonu (yukarıda 3.1 &#39;e bakın) ve pipet 1&#39;e / 5 eşit bir konsantrasyonda tripsin çözülür. </li></ol> Bölüm 4: Dijital mikroakışkan Örnek İşleme <ol><li> Aşağıdaki yordam, in-house yazılı LabView kodu sayesinde otomatik olarak gerçekleştirilir. Rezervuarları dağıtılır damlacıklarının hacmi elektrotlar (bu durumda, reçete damlacıkları ~ 600nL) boyutları ile tanımlanır. </li><li> R-1 protein içeren örnek bir damlacık ve R-2 (Şekil 2, Kare 1) Yağışlı bir damlacık koyun. Iki damlacıkları Birleştirme ve kombine damlacık pr yağış sonucu, 5 dakika boyunca inkübeyüzeye oteins (Şekil 2, Çerçeveler 2-3). Atık deposu, R-3 (Şekil 2, Çerçeve 4) çöktürülmüş protein uzak süpernatant şarjörü. </li><li> R-4 yıkama tamponu üç damlacıkları dağılır ve atık deposu, R-3 (Şekil 2, Çerçeve 5) çöktürülmüş protein üzerinden sürücü. </li><li> Çökelti kurumasını bekleyin, ve R-5 protein resolubilizing tampon bir damlacık dağıtmak. Çökelti (Şekil 2, Çerçeve 6) eriyene kadar tampon 20 dakika inkübe izin verin. </li><li> R-6 indirgeyici bir damlacık Uygulama ve örnek damlacık ile birleştirmek. Dairesel bir desen 6 elektrotlar arasında harekete geçirerek, kombine damlacık karıştırın. Damlacık nemlendirilmiş bir odası (Şekil 3, Çerçeveler 1-2) oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe izin verin. </li><li> R-7 ajan alkilleyici bir damlacık koyun ve karıştırma (4,5) takip örnek damlacık ile birleştirmek. Damlacık nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında ışıktan koruyarak 15 dakika, (Şekil 3, Çerçeveler 2-3) inkübe izin verin. </li><li> R-8 tripsin Bir damla koyun ve karıştırma (4,5) takip örnek damlacık ile birleştirmek. Damlacık 37, 3 saat süreyle inkübe ° C sıcak bir plaka üzerinde nemlendirilmiş bir odası (Şekil 3, Çerçeveler 3-4) izin verin. </li></ol> Bölüm 5: Post-İşleme Numune Hazırlama <ol><li> 0.6 mL% 2.5 trifloroasetik asit su ekleyerek üst yüzey ve quench sindirim reaksiyonu çıkarın. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) ile söndürülür reaksiyon ürünü arındırın. </li><li> DI su son hacim 100 mL örnek saflaştırılmış seyreltilir. </li></ol> Bölüm 6: Kütle Spektrometresi <ol><li> Tandem kütle spektrometre evlendirilen bir nano-HPLC işlenmiş örnek değerlendirin. Burada kullanılan HPLC sistemi Eksigent Teknolojileri ve bir tuzak sütun (3 mm çap. C18 boncuk, 150 mikron ID x 2,5 cm) ve bir ters-faz ayrılması sütun (3 mikron çap ile donatılmıştır. C18 boncuk, 75 mikron ID x 15 cm). Burada kullanılan kütle spektrometresi Thermo Fisher Scientific bir LTQ. </li><li> % 5 su asetonitril oluşan bir mobil faz 2 mcL örnek 5μL/min tuzak sütun üzerine yükleyin. 0.5μL/min az% 20 asetonitrilden 25 dk% 80 asetonitril doğrusal bir degrade kullanarak ters faz sütun örnek ayırın. Başka bir 10 dakika süreyle% 80 asetonitril çalıştırmaya devam edin. </li><li> Tandem kütle spektrometresi sütun salınımlı bantları analiz edin. Burada bildirilen çalışma, Eluent NewObjective nanoelectrospray yayıcı (20 mikron ID 10 mikron ID konik) ile kütle spektrometresi örneklenir. </li><li> SEQUEST gibi bir veritabanı programı kullanılarak örnek proteinler belirleyin. Bu çalışmada, biz Bioworks v3.01 (Thermo Fisher Scientific) dahil SEQUEST sürümünü tespit proteinler 1.0E-03 daha az olasılık puanları (99.9% güven aralığı eşdeğer), ve az bir sıra coverages en az 30% (Şekil 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> Şekil 1 (a) Bir resim, bir DMF cihaz, otomatik damlacık kumanda için 40-pin konnektörler çiftleş. (B) bir cihaz şematik bir örnek ve proteomik tetkikleri için gerekli reaktiflerin konumlandırma tasvir. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> Şekil 2 bir film. Çerçeveler% 20 TCA (Yağışlı) ve 70/30% kloroform / asetonitril (çözüm durulayın) otomatik ekstraksiyon ve saflaştırma BSA tasvir. 6 çerçeve, çöktürülmüş protein 100 mM amonyum bikarbonat bir damlacık çözünene. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> Şekil 3 sıralı azaltma, alkilleme ve protein resolubilized bir damlacık sindirimi gösteren bir film Çerçeveler. Bu rakam, reaktifler netlik için boya ile renkli, pratikte, reaktifler renkli değildir. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> Şekil 4 dijital Mikroakiskan tarafından işlenmiş sığır serum albümini bir örnek MS kromatogram. 25 farklı peptidler bir dizi kapsama karşılık% 44 (% 99.9 güven aralığı) tespit edilmiştir.

<ol>
	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

Proteomik standart numune alma ve işleme eksikliği alan için önemli bir sınırlama yoktur. Buna ek olarak, geleneksel macroscale numune alma, örnek kaybı ve kirlenmeye yol açabilecek birden fazla kaplar ve çözüm transferleri içerir. Bu sorunlara olası bir çözüm, dijital Mikroakiskan 1 (DMF) dayanarak örnek işleme için entegre sistemler oluşturmaktır . Önceki çalışmada, DMF heterojen istenmeyen kirleticiler verimli çıkarılması protein içeren solüsyonlar için yararlı olduğu gö...

digital microfluidics for automated proteomic processing

Klinik proteomik, hastalığın erken tanı ve prognoz için yararlı olacaktır biyobelirteç keşif umut verici, yeni ve önemli bir disiplin olarak ortaya çıkmıştır. Klinik proteomik yöntemleri çok çeşitlilik gösterirken, bir ortak özelliği son derece heterojen sıvıları (örneğin, serum, kan, vs) ve analizden önce, (ii) geniş biyokimyasal işlem proteinlerin ekstraksiyonu (i) ihtiyaç vardır. Burada, klinik proteomik kullanılan birçok işlem adımı birleştirerek yeni bir dijital Mikroakiskan (DMF) tabanlı yöntemi raporu. Bu, protein ekstraksiyon, resolubilization, azaltma, alkilleme ve enzimatik sindirim içerir. Dijital Mikroakiskan nanoliter mikrolitrelik ölçekli damlacıkları açık bir yüzey üzerine manipüle edildiği bir microscale sıvı-işleme tekniği. Damlacıkları dielektrik tabakası ile kaplı elektrotlar bir dizinin üstüne konumlandırılmış bir elektrik potansiyeli damlacık uygulandığında, masraflar dielektrik her iki tarafında birikir. Suçlamalar damlacık konumunu kontrol etmek için kullanılan elektrostatik kolları olarak hizmet ve seri bir dizi elektrot kutuplama damlacıkları dağıtmak, hareket, birleştirme, mix ve yüzey üzerinde bölünmüş yapılabilir. Bu nedenle, DMF, hızlı, sıralı, çok adımlı, minyatür otomatik biyokimya testleri taşımak için, doğal bir uyum. Bu, geleneksel yöntemler (elle pipetleme veya robotlar dayanarak) üzerinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder ve klinik proteomik yararlı bir yeni bir araç olma potansiyeline sahiptir. Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, ve Steve CC Shih, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu. Sergio LS Freire mevcut adresi 600 Güney 43rd Street, Philadelphia, PA 19.104 bulunan Philadelphia Bilimler Üniversitesi.

Watch this Scientific Journal Video about Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing at JoVE.com

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Elektrik alanların uygulama tarafından bir dizi elektrot - Dijital Mikroakiskan ayrık damlacıklar (ml ~ nL) manipülasyon ile karakterize bir tekniktir. Hızlı, sıralı, minyatür otomatik biyokimya testleri yürütmek için çok uygundur. Burada, birkaç proteomik işlem adımlarını otomatik olarak yetenekli bir platform raporu.

Otomatik Proteomik İşleme Dijital Mikroakiskan

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K Görüntüleme.  University of Toronto. Elektrik alanların uygulama tarafından bir dizi elektrot - Dijital Mikroakiskan ayrık damlacıklar (ml ~ nL) manipülasyon ile karakterize bir tekniktir. Hızlı, sıralı, minyatür otomatik biyokimya testleri yürütmek için çok uygundur. Burada, birkaç proteomik işlem adımlarını otomatik olarak yetenekli bir platform raporu.

Video: Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Mikro Ölçekli Besin Katmanlar Deniz Mikro-organizmalar kemotaktik Tepki

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Biyoloji

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Mikroakiskan kullanarak Bakteriyel Kemotaksis Çalışmaları - Röportaj

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Elektrofizyoloji için Mikroakiskan uygulama

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Mikroakiskan kullanarak Yeni Tedavi Uygulamaları Geliştirme

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Proteinlerin Elektrogöçer Ayırma

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immüno Analizi

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Jeller içinde Proteinler Boyama

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Toksin İndüksiyon ve Protein Ekstraksiyonu Fusarium Spp.</emProteomik Araştırmalar> Kültürler

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...