Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı fibr (NSF EF-0.623.664) ve IDBR (NSF DBI-0.754.570) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma kısmen Kooperatif Anlaşması PHY 0120999 altında Kaliforniya Üniversitesi, Davis tarafından yönetilen Biophotonics, bir NSF Bilim ve Teknoloji Merkezi Merkezi tarafından yönetilen Ulusal Bilim Vakfı fibr Hibe 0623664, fon tarafından desteklenmiştir. Lisa Lapidus, doktora ve araştırma Burroughs Hoşgeldiniz Fonundan Bilimsel Arayüz bir Kariyer Ödülü kısmen desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+and+mechanisms+in+protein+folding.">Fast kinetics and mechanisms in protein folding.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).</li><li>Hertzog, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtomole+mixer+for+microsecond+kinetic+studies+of+protein+folding.">Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding.</a> Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).</li><li>Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+microfluidic+mixer+for+studying+protein+folding+kinetics.">Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics.</a> Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).</li><li>Yao, S., Bakajin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+Mixing+Time+and+Mixing+Uniformity+in+Devices+Designed+for+Studies+of+Protein+Folding+Kinetics.">Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics.</a> Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).</li><li>Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Hydrophobic+Collapse+and+Early+Folding+Steps+Observed+in+a+Microfluidic+Mixer.">Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).</li><li>Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microchannel+solution+mixer+for+studying+microsecond+protein+folding+reactions.">A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions.</a> Review of Scientific Instruments. 76, (2005).</li><li>Chan, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submillisecond+protein+folding+kinetics+studied+by+ultrarapid+mixing.">Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing.</a> PNAS. 94, 1779-1784 (1997).</li><li>Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous-flow+capillary+mixing+method+to+monitor+reactions+on+the+microsecond+time+scale.">A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale.</a> Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).</li><li>Pollack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compactness+of+the+denatured+state+of+a+fast-folding+protein+measured+by+submillisecond+small-angle+x-ray+scattering.">Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).</li><li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+cytochrome+c+initiated+by+submillisecond+mixing.">Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing.</a> Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).</li><li>Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+focusing+on+a+silicon+chip:+Mixing+nanoliters+in+microseconds.">Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds.</a> Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).</li><li>DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Observation+of+Downhill+Folding+of+lambda-Repressor+in+a+Microfluidic+Mixer.">Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).</li><li>Waldauer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruggedness+in+the+folding+landscape+of+protein+L.">Ruggedness in the folding landscape of protein L.</a> Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).</li><li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale.">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li><li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness.">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li><li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain.">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Uzun biyomoleküllerin moleküler süreçlerin, piko saniye kadar zaman ölçeğindeki meydana geldiği kabul edilmiştir, çünkü Hızlı karıştırma yıllarca protein katlanması alan için bir gelişme hedefi olmuştur. Konvansiyonel durdu-akış karıştırıcılar başta türbülans ile sınırlıdır 1-5 ms ölü zamanları vardır. 30-300 ms&#39;den karıştırma süreleri ile Çalkantılı sürekli akış mikserler gruba az sayıda son 15 yılda geliştirilen ancak genellikle bu karıştırma süreleri elde etmek için yüksek debi gerektiren ve bu nedenle örnek 6-8 çok kullanmaya başlamıştır. Bu protokol laminer akış rejimindeki hızlı seyreltme ulaşmak için mikroakışkan karıştırma fiş kullanımı anlatılmaktadır. Orada bu rejim içinde çalışan birden çok avantajı vardır, ancak birincil bir bir karıştırma yanıt değiştirmenize olanak veren yüksek hassasiyet ile tüm karıştırma işlemi taklit yeteneğidir. Basit geom ile diğer gruplar tarafından geliştirilen T-mikserleretries öncelikle kanal 9-10 büyüklüğü ile sınırlı kaldı 100-200 ms&#39;den karıştırma kez gösterilmiştir. 10 mikron Knight kanallarının boyutunu ölçekleme By ~ 10 ms&#39;dan 11 karıştırma süresi azalır. Yao ve Bakajin geometri küçük değişiklikler karıştırma süresi 4 önemli gelişmelere yol açabileceğini gösterdi. Bununla birlikte, bu çalışma karıştırma olduğu ivme zamanda da yavaş fazlar yol açabilir gösterdi. Bu çalışmada 12-13 kullanılan tasarım denaturant konsantrasyon yavaş üstel çürüme en aza indirmek ve aynı zamanda Drie aşındırma bir özelliği daha tekrarlanabilir yapmak için referans 4&#39;te iki iyi tasarımları arasında bir uzlaşmadır. Karıştırma süresi tanımı içinde karıştırılması ultrahızlı bireylerde alanında bazı tartışmalara olmuştur. Bu &quot;karıştırma süresi&quot; ve &quot;ölü zaman&quot; arasındaki farkı fark etmek önemlidir. Ölü zaman zarfında bir ÖLÇME süre olarak çalkantılı bir mikser tanımlanırt yapılamaz ve aslında gerçek karıştırma süreden önemli ölçüde daha uzun olabilir. Bu, tipik olarak, çeşitli konsantrasyonlarda bir sahte-birinci dereceden iki moleküllü reaksiyonu (örneğin, N bromosuccinate tarafından triptofan floresans soğutmadan gibi) çeşitli ölçümler yapmak tarafından belirlenir. Gözlenen üstel çürükleri t = 0 s olarak kabul tek bir değerde yakınsama takılan ve bu noktadan ve ilk ölçülen nokta arasındaki zaman ölü bir zamanı vardır. Herhangi bir ölü zaman, sadece bir karıştırma süresi olacak şekilde laminar akış karıştırıcılar için ölçüm karıştırma işlemi sırasında yapılabilir. Karıştırma süresi gerçekte yeterli homojenlik elde edilene kadar iki çözüm birleştirme zamanı. Biz daha önce 90/10, karıştırılmamış değerinin% 10 ila% 90 azaltmak için denaturant konsantrasyonu için zaman olması karıştırma süresi belirledik. Bununla birlikte, karıştırma eğrisi şekil küçük üstel bileşenine sahip çürüme kuyruk ile mükemmel simetrik değildir. Ayrıca, protein katlanması, bir vardenaturant konsantrasyonu üzerindeki yüksek doğrusal-olmayan bir bağımlılığının katlama genellikle denaturant sadece iki misli azalır bile başlaması böylece. Bu nedenle son zamanlarda% 80 oranında denaturant konsantrasyonunu azaltmak için zaman olarak karıştırma süresi belirledik. Kuşkusuz, diğer tanımları deney gereksinimlerine bağlı olarak kullanılabilir. Protein katlanması incelemek için bu mikser kullanımı sürekli şaşırtıcı sonuçlar ortaya koymuştur. Uzun sürekli akış mikserler ile çoklu katlama adımları ve erken sonuçlar almaya çalışılmıştır sitokrom c ve apomyoglobin katlanması ~ 100 s ölçeğinde 10,14-15 oluşmasına çöküşü gösterdi. Bu mikser ile yaptığımız ölçümler (olarak daha yavaş bir faz takip Mikserin karıştırma süre içinde, çok hızlı, muhtemelen spesifik olmayan, çökmek (as Trp floresans spektral vardiya ile ölçülen) bu ölçeğinde en az 2 adım olacaksa gösterdi ) toplam Trp emisyon soğutma ile ölçülen olasılıkla fdoğal yapısı 5 IRST oluşumu. Ayrıca, bu proteinin, bir 2-klasörün 13 durumu olduğu geleneksel yorumlama iptali için, protein, L B1 alanı içinde bir 50 μs işlemi araştırmacılar tarafından gözlenmiştir. Bu hızlı bir mikser bir avantajı, genellikle sadece nanosaniye T-atlama araçlar ile ölçülebilir olmuştur hızlı katlama proteinlerin katlama yoklamak olmasıdır. T-atlama genellikle katlama / protein erime sıcaklığına yakın rahatlama açılması ve bu nedenle bütün nüfusun katlanması aşağıdaki asla gözlem gerektirir. Bu mikser ile biz Trp toplam emisyon ve spektral vardiya her ikisi ile γ-repressör katlama (λ 6-86) baktım ve protein önceki T tarafından erişilebilir olmadığını güçlü katlama koşullarda katlama için hiçbir engel olmadığını kanıtlar buldular ölçümleri 12-atlamak. Son olarak, bir t villin başlık HP-35 ile katlama ölçülenO hızlı klasörleri henüz ölçülür ve karıştırma sonra ölçülen katlama oranı aynı şartlar altında 16 T-atlama ile ölçülen daha ~ 5 kat daha yavaş olduğunu buldu. Bu katlanma kinetikleri alanda büyük bir varsayımı devrilmesiydi başlangıç ​​şartlarına bağlı olduğunu göstermektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> AZ P4110 rezist </td><td> AZ Elektronik Malzemeler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K Geliştirici </td><td> AZ Elektronik Malzemeler </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Baker PRS 2000 fotorezist striptizci </td><td> Avantor Performans Malzemeleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBond Teknolojileri </td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500 mikron kapak gofret </td><td> SENSÖR Hazırlık Hizmetler </td><td></td><td> Ø: 100 mm ± 0.5 mm Kalınlık: 0.5 mm ± 0.025 mm Standart Toleranslar (Kaydetti sürece) Yüzey: SI: 4-8A; SII: 8-12a Daire: Bir İlköğretim YARI-STD; Bir Scribe Temiz ve Parlak, Her İki Tarafa </td></tr><tr><td> 170 mikron kapak gofret </td><td> SENSÖR Hazırlık Hizmetler </td><td> 7980 2G Gofret </td><td> Ø: 100 mm ± 0.5 mm Kalınlık: 0.17 mm ± 0.025 mm Standart Toleranslar (Kaydetti sürece) Yüzey: SI: 4-8A; SII: 8-12a Daire: Bir İlköğretim YARI-STD; Bir Scribe Temiz ve Parlak, Her İki Tarafa </td></tr><tr><td> Oksitler için derin reaktif iyon yakıcısı </td><td> ULVAC </td><td> ULVAC NL-6000 </td><td></td></tr><tr><td> Argon Lazer İyon </td><td> Cambridge Lazer Laboratuvarları </td><td> LEXEL 95-SHG </td><td> λ = 258 nm </td></tr><tr><td> Argon Lazer İyon </td><td> Melles Griot </td><td></td><td> λ = 488 nm </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Olympus </td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Amaç </td><td> Thor Labs </td><td> OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA </td><td> λ = 258 nm </td></tr><tr><td> Mikroskop Amaç </td><td> Olympus </td><td> UPLSAPO 60XW 1,2 NA </td><td> λ = 488 nm </td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td></td></tr><tr><td> Motorlu Çeviri Sahne </td><td> Semprex Corp </td><td> KL-12-6436 Serisi </td><td></td></tr><tr><td> GaAsP Foton Sayaç </td><td> Hamamatsu </td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td> Monochrometer </td><td> Horiba Instruments Inc </td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> Andor Teknoloji </td><td> idus 420A-BU </td><td></td></tr><tr><td> Guanidin hidroklorür (GuHCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic mixers for studying protein folding

Kendi doğal yapısındaki bir proteini kıvrımlar biyoloji ve insan sağlığı hala henüz tam olarak anlaşılamamıştır oldukça alakalı olan süreçtir. Bunun bir nedeni, bu katlama protein 1 bağlı olarak, nanosaniye ile saniye ya da daha fazla, süresini çok geniş bir aralık içinde yer alan bir. Konvansiyonel durdu-akış mikserler katlama kinetik ölçümü yaklaşık 1 ms başlayan sağladı. Biz son zamanlarda ~ 8 μs 2 denaturant ~ 100 kat sulandırır bir mikroakışkan karıştırıcı geliştirdik. Durmuş bir akış mikser aksine, bu mikser türbülans oluşmaz hangi laminer akış rejimi çalışır. Türbülans olmaması 3-4 deneme için mükemmel bir anlaşma ile mikser içindeki tüm akımları hassas sayısal simülasyonu sağlar. Laminar akış ≤ 100 Re Reynolds sayıları için elde edilir. Sulu çözelti, bu mikron ölçeğinde geometri gerektirir. Bu tür silikon veya erimiş silikonlu yağla olarak, sert bir yüzey kullanımıca, (Bakınız Şekil 1) kanalları 5-10 mikron genişliğinde ve 10 mikron derin yapmak. Küçük boyutları, karıştırma bölgeye girişinde, boyutu 1 mikron mertebesinde vardır. Çip optik erişim için ince bir cam veya silika coverslip ile örtülmüştür. Tipik toplam doğrusal akım hızları ~ 1 m / s, akma Re ~ 10, fakat protein tüketimi sadece 0.5 ~ nL / s veya 1.8 uL / saat. Protein konsantrasyonu tespit yöntemi bağlıdır: triptofan floresans için tipik derişim 100 uM (1 Trp / protein) ve tipik konsantrasyonu ~ 100 nM&#39;dirki FRET için. Katlama işlemi 6 M 0.06 M guanidin hidroklorür denaturant hızlı seyreltme tarafından başlatılır. Yüksek denaturant bulunan protein merkezi bir kanal aşağı akar ve denaturant (bkz. Şekil 2) ~ 100 kat daha hızlı hareket ettirmeden tampon ile karıştırma bölgede iki tarafında karşılanmaktadır. Bu dar bir geometri içine proteini akışının hızlı daralma nedenjet ~ 100 nm çapında. Ağır protein moleküllerinin difüzyon çok yavaş 1 ms difüzyon az 1 mikron iken ışık denaturant moleküllerin difüzyon, çok hızlıdır. Proteini yaklaşık denaturant etkili konsantrasyonu azaltarak denaturant ve protein akışından denaturant hızlı dilüsyonu proteini sonuçların sabit bir difüzyon farkı,. Protein jet bir tarama mikroskobu konfokal 5 kullanılarak tespit edilebilir katlama sırasında protein gözlem kanalı ve floresans aşağı doğru sabit bir hızda hareket eder.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding at JoVE.com

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Bu çalışmada biz ~ 8 μs iki çözüm karıştırma yeteneğine sahip mikroakışkan mikser imalat ve kullanımının açıklanması. Ayrıca UV floresan ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak spektroskopik tespiti ile bu karıştırıcı kullanımını göstermektedir.

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

microfluidic-mixers-for-studying-protein-folding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Görüntüleme.  Michigan State University. Bu çalışmada biz ~ 8 μs iki çözüm karıştırma yeteneğine sahip mikroakışkan mikser imalat ve kullanımının açıklanması. Ayrıca UV floresan ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak spektroskopik tespiti ile bu karıştırıcı kullanımını göstermektedir.