Name: fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
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This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.

1. Preparazione del capillare microreattore <ol><li> Tagliare il diametro interno 100 micron (ID) x 360 micron di diametro esterno (OD) capillare ad una lunghezza di 7-8 cm, e 20 micron ID x 90 micron OD capillare per 3-5 cm con il coltello capillare di vetro; verifica al microscopio che entrambe le estremità capillari hanno un taglio netto, diritta, senza bave sporgenti. </li><li> Inserire il 20 um ID x 90 micron OD capillare in un&#39;estremità del 100 micron ID x 360 micron OD capillare, per una lunghezza di ~ 6 mm; in caso di necessità, osservare questa operazione al microscopio. </li><li> Applicare una piccola goccia di colla E6000 attorno alla giunzione dei 90 micron OD / 100 micron capillari ID con la fine di un Q-tip, e lasciare che la colla cura O / N a temperatura ambiente. </li><li> Tagliare il inserita 20 micron ID x 90 micron OD capillare ad una lunghezza di ~ 10-15 mm; questo sarà l&#39;emettitore Elettrospray. </li><li> Pre-tagliare il 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; OD PEEK e 1/16 &quot;PTFE vasca ODzione in pezzi di 4-5 cm di lunghezza; questi saranno i manicotti utilizzati nei sindacati capillari per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Collegare l&#39;estremità opposta del 100 micron ID x 360 micron OD capillare per un&#39;unione PEEK; usare un manicotto 1/32 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Inserire / serrare un pezzo di ~ 5 cm di lunghezza 1/16 &quot;tubo PTFE nella estremità opposta del raccordo. </li><li> Pesare ~ 4 mg di C18 (5 micron) particelle in un pre-pulito / secca 2 ml flacone di vetro; aggiungere 0,5 ml di isopropanolo, chiudere la fiala e disperdere il liquame nella vasca da bagno ultrasonicatore. </li><li> Prelevare con una siringa 250 microlitri di circa 200 pl liquami, inserire l&#39;ago della siringa nel &quot;tubo 1/16 PTFE dell&#39;unione PEEK, e dispensare lentamente l&#39;impasto in 100 micron ID x 360 micron OD capillare, osservare al microscopio come capillare riempie di particelle fino una lunghezza di 2-3 mm di imballaggio è realizzato; questo sarà il microreattore (Figura 1) il 20 μ.m ID capillare trattiene le particelle nel microreattore con un effetto Keystone. 15 </li><li> Risciacquare microreattore con ~ soluzione 50 ml di H 2 O / CH 3 CN 50:50 v / v, e poi con soluzione ~ 50 ml di H 2 O / CH 3 CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. preparazione di soluzioni campione Nota: Le operazioni che comportano la manipolazione di solventi organici e acidi e la preparazione della soluzione devono essere eseguite in una cappa aspirante. Indossare occhiali, guanti e indumenti protettivi. <ol><li> Risciacquare con CH 3 OH e asciugare alcune fiale di vetro (4 ml) e tubi di polipropilene (15 ml). </li><li> Preparare 10 ml di una soluzione di H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 9,8 ml H 2 O con 200 microlitri CH 3 CN; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 10 ml di una soluzione di H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 5 ml H 2 &lt;/ sub&gt; O con 5 ml di CH 3 CN; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 4 ml di una soluzione acquosa acidificata (TFA 0,01% v / v) con l&#39;aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare 4 ml di una soluzione organica acidificata (TFA 0,01% v / v) con l&#39;aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Pesare 16 mg di NH 4 HCO 3 con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml di H 2 O / CH 3 CN: soluzione (98 2 v / v) e disperdere per sonicazione; questo si traduce in una soluzione 50 mM di NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) in tampone acquoso. </li><li> Pesare 5 mg di proteina standard (ad esempio, albumina di siero bovino, emoglobina α / β, citocromo C, anidrasi carbonica, α-2-HS-glicoproteina, etc.) con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml DI wateR e disperdere mediante ultrasuoni; questo genere si traduce in una soluzione ad elevata concentrazione di livello pM. </li><li> Preparare 1 ml di soluzione proteica (1-2 mM) diluendo la soluzione a concentrazione alto livello mM con un volume adeguato di NH 4 HCO 3 (50 mM) tampone acquoso; mescolare mediante ultrasuoni. </li><li> Preparare la soluzione di tripsina (5 mM) sciogliendo 20 mg sequenziamento grado tripsina in 170 microlitri NH 4 HCO 3 (50 mM) tampone acquoso; disperdere mediante ultrasuoni. </li></ol> 3. apparato sperimentale Nota: Il sistema LTQ-MS è dotato di una sorgente ESI modificato che comprende un XYZ stadi casa costruzione che abilita l&#39;interfacciamento dello spettrometro di massa a vari approcci ingresso campione. <ol><li> Scollegare il microreattore capillare dall&#39;unione PEEK e connettersi al PEEK Tee. </li><li> Inserire lunga ~ 2 centimetri di filo Pt nel braccio laterale del PEEK Tee; utilizzare un &quot;manicotto 1/32 PEEK per fornire un-Perdita di connessione e per isolare il filo Pt. </li><li> Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare all&#39;estremità opposta del PEEK Tee; usare un manicotto 1/32 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Fissare il Tee PEEK sul XYZ-stage e posizionare la ESI emettitore ~ ​​2 millimetri di distanza dal capillare di ingresso spettrometro di massa. </li><li> Collegare il filo Pt alla sorgente di alimentazione ESI dello spettrometro di massa. </li><li> Collegare l&#39;estremità opposta del capillare trasferimento del campione all&#39;unione di acciaio inossidabile; usare un manicotto 1/16 &quot;PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite. </li><li> Collegare un lungo 4-5 cm 1/16 &quot;tubo in teflon all&#39;estremità opposta del raccordo in acciaio inox e inserire l&#39;ago della siringa 250 microlitri nel tubo PTFE, accendere la pompa e impostare la portata al valore desiderato (ad esempio, 2 microlitri / min). </li><li> tandem Input parametri di acquisizione dati MS nel pacchetto software che controlla lo strumento un MSd salvare come file il metodo per preparare la messa a punto per l&#39;esecuzione di analisi; per il sistema LTQ-MS, utilizzare i parametri di analisi dipendenti seguenti dati: l&#39;esclusione dinamica abilitato per 180 sec con larghezza di massa esclusione ± 1,5 m / z; uno Stato membro scan seguito da uno zoom e MS 2 scansioni su i primi 5 picchi più intensi, zoom larghezza di scansione ± 5 m / z; dissociazione indotta da collisione (CID) parametri impostati in larghezza isolamento 3 m / z, energia di collisione normalizzato del 35%, l&#39;attivazione Q 0.25, e il tempo di attivazione di 30 msec. </li></ol> 4. Configurazione Microfluidic <ol><li> Preparare un dispositivo microfluidico in vetro o substrati polimerici; 16-18 il layout del dispositivo è fornito in Figura 2A, consistente in un microreattore (1) (0,13 mm Lunghezza larghezza x 2 mm x 50 micron di profondità) collegato ad un ingresso (2 ), uscita (3) e una porta laterale (4); i canali comunicanti per le manipolazioni fluidica sono ~110 micron di larghezza e ~ 50 micron in profondità; una struttura multicanale (5), costituito da ~ 1,5-2 micron profondo x 10 micron di larghezza x 100 micron lunghi microcanali posti 25 micron a parte, fungerà da filtro per trattenere le particelle nel microreattore. </li><li> Attiva connessioni fluido consegna al chip incollando connettori specializzati verso le luci di entrata, o escogitando un supporto polimerico che ospita raccordi per la consegna fluido (Figura 2B). 16 </li><li> Preparare una sospensione di particelle di C18 (5 micron), come descritto al punto 1.8; consegnare la sospensione al microreattore con una siringa utilizzando 1/16 &quot;tubo in teflon collegato alla porta lato di chip (4); chiudere la porta dopo il caricamento delle particelle con colla epossidica e la cura per 1 ora in stufa a 90 ° C 16. </li><li> Inserire un capillare (20 micron ID x 90 micron di lunghezza OD x 10 mm) nel porto di uscita, sigillare con la colla E6000, e lasciare che la cura O / N; questo diventerà l&#39;emettitore ESI ( <sTrong&gt; 6). </li><li> Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare alla porta di ingresso del circuito integrato (2); collegare l&#39;estremità opposta del capillare ad un microlitri siringa 250 e la pompa a siringa, come descritto in 3.6-3.7. </li><li> Collocare un leggero connettore PEEK Tee sulla linea di trasferimento del campione appena prima luce di ingresso (2) e inserire un filo di Pt sul braccio laterale della T, come descritto in 3.2; questo sarà l&#39;elettrodo ESI. </li><li> Fissare il dispositivo microfluidica sul palco XYZ con l&#39;emettitore ESI posizionato ~ 2 mm di distanza dal capillare spettrometro di massa in ingresso; preparare la MS per l&#39;analisi come descritto in 3.8. </li></ol> 5. Campione Caricamento, proteolitica Digestione e eluizione per MS Analysis Nota: Tutte le fasi di trasferimento soluzione / campione vengono eseguite con l&#39;ausilio di una pompa a siringa e dovrebbe consentire per alcuni minuti supplementari per completare, per compensare la dead-volumes associati alle linee di trasferimento da e per il microreattore; il tempo necessario dipenderà dalle portate coinvolti. <ol><li> Risciacquare microreattore e prepararla per analisi infondendo una soluzione acquosa di NH 4 HCO 3 (50 mM) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Caricare il campione di proteine ​​(1 pM) sul microreattore infondendo la soluzione campione a 2 microlitri / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Infondere la soluzione di tripsina (5 mM) sopra la proteina adsorbita sul microreattore a 2 microlitri / min per 1-3 min. </li><li> Quench il processo di digestione proteolitica risciacquando il microreattore con una soluzione acquosa acidificata di TFA (0,01% v / v) in H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri. </li><li> Avviare eluendo la proteina digerire dal microreattore infondendo una soluzione organica acidificato di TFA (0,01%v / v) in H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) a 300 Nl / min. </li><li> Accendere il processo di acquisizione dei dati MS e la tensione ESI (~ 2.000 V); acquisire i dati MS utilizzando i parametri di acquisizione dati forniti al punto 3.8; osservare l&#39;eluizione dei peptidi trittico. </li></ol> 6. Elaborazione dati <ol><li> Elaborare i dati in tandem MS con un motore di ricerca compatibile con il formato di dati di MS crudo. <ol><li> Elaborare i file RAW LTQ-MS utilizzando un organismo specifico database di proteine ​​minimamente ridondante; caricare i dati grezzi nel motore di ricerca, impostare le tolleranze di massa genitore e ioni frammento di 2 e 1 Da rispettivamente, e utilizzare frammenti completamente solo triptici con un massimo di due perse spaccature per la ricerca; non consentono modifiche post-; fissare i tassi di rilevamento di alta e media fiducia falsi (FDR) a 1% e il 3%, rispettivamente, e non consentono modifiche post-traduzionali. </li></ol></li><li> Filtrare i dati per selezionare solo di alta fiduciapeptide corrisponde alle proteine ​​presenti nel database; valutare i risultati proteine ​​e livello peptide. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

Il microreattore descritto in questo lavoro fornisce un facile da implementare apparato sperimentale per mineralizzazione enzimatica delle proteine ​​per permettere l&#39;analisi MS e identificazione in meno di 30 min. I vantaggi di questo sistema, rispetto agli approcci convenzionali, comprendono semplicità, velocità, basso consumo di reagenti e bassi costi. In particolare, non vi è alcuna necessità di costosi perline tripsina immobilizzati e cartucce. La preparazione del microreattore capillare è semplice <st...

L&#39;identificazione e la caratterizzazione di proteine ​​purificate si ottiene spesso utilizzando tecniche MS. La proteina viene digerito con un enzima e dei suoi peptidi sono ulteriormente analizzato da MS utilizzando un semplice apparato sperimentale infusione. digestione proteolitica è necessaria per la generazione di piccoli frammenti peptidici che rientrano nel range di massa utile della maggior parte degli analizzatori MS, e che può essere facilmente frammentato attraverso bassa energia di collisione di dissociazione indotta per generare aminoacido informazioni sulla sequenza. Per proteine ​​isolate o semplici miscele proteiche, non vi è alcuna ulteriore necessità di separazione cromatografica dei peptidi prima della rivelazione MS. Una miscela di 25-50 peptidi può essere facilmente analizzato infondendo il campione con una pompa a siringa direttamente nella sorgente MS ioni. Lo spettrometro di massa può eseguire l&#39;analisi e confermare la sequenza di una proteina in un breve lasso di tempo. Con i moderni metodi di acquisizione dati, questo processo può essere realizzato well&#39;ambito pochi minuti o addirittura secondi. Il fattore limitante nel completare l&#39;intero processo in un breve lasso di tempo è la fase di digestione proteolitica. In genere, questa viene eseguita nell&#39;arco di alcune ore (o O / N), in soluzione, a 37 ° C, con substrato: rapporti di enzimi di (50-100): 1. Per ridurre il tempo di digestione enzimatica a minuti o secondi, microreattori enzima immobilizzato, in forma di reattori microfluidici o cartucce disponibili in commercio, sono stati descritti. 1-6 Tipicamente, l&#39;enzima è immobilizzato da covalente, non covalente / adsorbimento fisico, complesso formazione o incapsulamento, 3,6 la maggiore efficienza del processo enzimatico viene abilitato dalla grande superficie-volume e rapporti enzima-to-substrato. Ulteriori vantaggi di reattori immobilizzate comprendono la riduzione autolisi e interferenze da parte dell&#39;enzima in analisi MS, una migliore stabilità enzimatica e riutilizzabilità. Una varietà di approcci, utilizzando il vetro o dispositivi microfabbricate polimerici sono stati descritti,utilizzando enzimi immobilizzati su sfere magnetiche da interazioni antigene-anticorpo, 7,8 intrappolati nelle reti di nanoparticelle d&#39;oro, 9 incapsulato in titanio-allumina sol-gel 10 e nanozeolites, 11 o catturati attraverso Ni-NTA o His-Tag formazione del complesso. In alternativa 6 , sono stati sviluppati capillari aperti tubolari con enzimi immobilizzati, pure. 12 Inoltre, maggiore segmentazione proteolitica è stata dimostrata utilizzando controllata irradiazione a microonde 13 o tecnologia cicli di pressione assistita o pressione (PCT) per ridurre i tempi di reazione a 30-120 min. 14 Nonostante i molteplici vantaggi dei reattori enzima immobilizzato, i costi delle cartucce commerciali è alto, la disponibilità di dispositivi microfluidici per uso di routine è limitato, e l&#39;uso di tecnologie microonde o PCT risultati in necessità di strumentazione aggiuntiva. L&#39;obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un metodo che circumveNTS questi svantaggi, e che può essere facilmente implementato in ogni laboratorio per potenziare ricercatori un approccio semplice ed efficace per l&#39;esecuzione di scissione enzimatica di proteine ​​in preparazione per l&#39;analisi MS in pochi minuti. Questo approccio si basa sull&#39;uso di idrofobici, C18-particelle che sono pre-caricate in un capillare o dispositivo microfluidica, e l&#39;adsorbimento della proteina (s) di interesse nelle particelle seguita da digestione enzimatica durante l&#39;infusione dell&#39;enzima sul letto impaccato e proteine ​​catturato (s). In questo approccio, il substrato viene immobilizzato attraverso interazioni non covalenti, e l&#39;enzima è infuso proteina immobilizzata. L&#39;efficienza proteolitica digestione viene aumentata dalle grandi superfici di particelle che espongono la proteina per la trasformazione enzimatica, distanze e tempi di diffusione da e verso la superficie delle particelle ridotta, migliorato trasferimento di massa, nessun legame covalente che possono influenzare l&#39;attività dell&#39;enzima, capacità rapidamente evaluate combinazioni di diversi enzimi, disponibilità, e multiplexing se il processo viene eseguito in un formato microfluidica. Questo approccio è dimostrato con l&#39;uso di una miscela di proteine ​​standard e tripsina-enzima più comunemente usato per la digestione proteolitica prima della rilevazione ESI-MS. Lo spettrometro di massa utilizzato per la rilevazione in questo studio era uno strumento lineare trappola quadrupolo (LTQ).

<table><tbody><tr><td>Ion trap ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data</td></tr><tr><td>XYZ stage</td><td>Newport</td><td>Multiple parts</td><td>The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>The microscope is used to observe the microreactor packing process</td></tr><tr><td>Analytical balance/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>The balance is used to weigh the protein samples</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry</td></tr><tr><td>Syringe pump 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor</td></tr><tr><td>Milli-Q ultrapure water system</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&amp;nbsp;</td><td>The MilliQ water system is used to prepare purified DI water</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (100 &amp;micro;m ID x 360 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>This capillary is used for the fabrication of the microreactor</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (20&amp;nbsp;&amp;micro;m ID x 100 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (50&amp;nbsp;&amp;micro;m ID x 360 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor</td></tr><tr><td>Glass capillary cleaver</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded</td></tr><tr><td>Reversed phase C18 particles (5&amp;nbsp;&amp;micro;m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4&amp;nbsp;mm x 20 cm C18 LC column from Agilent</td></tr><tr><td>Syringe/glass (250 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor</td></tr><tr><td>Internal reducing PEEK Union (1/16&amp;rdquo; to 1/32&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>This union is used to connect the 250 &amp;micro;l syringe to the microreactor for loading the 5 &amp;micro;m particle slurry</td></tr><tr><td>Stainless steel union (1/16&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary</td></tr><tr><td>Microvolume PEEK Tee connector (1/32&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire</td></tr><tr><td>Tee connector (light weight)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line</td></tr><tr><td>Pt wire (0.404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply</td></tr><tr><td>PTFE tubing (1/16&amp;rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK tubing (0.015&amp;rdquo; ID x 1/16&amp;rdquo; OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50&amp;nbsp;&amp;micro;m ID transfer capillary</td></tr><tr><td>PEEK tubing (0.015&amp;rdquo; ID x 1/32&amp;rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee</td></tr><tr><td>Clean-cut polymer tubing cutter</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>This cutter is used to pre-cut the 1/16&amp;rdquo; and 1/32&amp;rsquo; Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length</td></tr><tr><td>Amber vial (2 ml)</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amber vial (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>The vials are used to prepare sample solutions</td></tr><tr><td>Polypropylene tube (15&amp;nbsp;ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>The vials are used to prepare buffer solutions</td></tr><tr><td>Cylinder (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td></tr><tr><td>Cylinder (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td></tr><tr><td>Pipette tips (1,000 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips (100 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Glass substrates</td><td>Nanofilm</td><td>B270 white crown, 3&amp;rdquo; x 3&amp;rdquo;</td><td>These are glass substrates for microchip fabrication</td></tr><tr><td>Male nut fitting (1/16&amp;rdquo;)</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Nanoport assembly</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Protein standards</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, HPLC grade</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, sequencing grade</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor

La grande maggioranza di spettrometria di massa (MS) a base di metodi di analisi di proteine ​​implicano un&#39;attività digestione enzimatica prima della rivelazione, tipicamente con tripsina. Questo passo è necessario per la generazione di piccoli peptidi peso molecolare, generalmente con MW &lt;3000-4000 Da, che rientra nell&#39;intervallo di scansione effettiva della strumentazione di spettrometria di massa. protocolli convenzionali coinvolgono O / N digestione enzimatica a 37 ° C. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di una varietà di strategie, tipicamente coinvolge l&#39;uso di un microreattore con enzimi immobilizzati o di una serie di processi fisici complementari che riducono il tempo necessario per proteolitica digestione per alcuni minuti (per esempio, microonde o ad alta pressione). In questo lavoro, si descrive un approccio semplice e conveniente che può essere implementato in qualsiasi laboratorio per la realizzazione rapida digestione enzimatica di una proteina. La proteina (o miscela di proteine) è adsorbito sulla alta perf C18-bonded fase inversaormance particelle di silice cromatografia liquida (HPLC) precaricate in una colonna capillare, e tripsina in tampone acquoso viene infusa in particelle per un breve periodo di tempo. Per attivare il rilevamento on-line MS, i peptidi triptici vengono eluite con un sistema solvente con maggiore contenuto organico direttamente nella sorgente MS ioni. Questo approccio consente di evitare l&#39;uso di particelle ad alto prezzo degli enzimi immobilizzati e non richiede alcun aiuto per il completamento del processo. Protein digestione e l&#39;analisi del campione completo può essere realizzato in meno di ~ 3 min e ~ 30 minuti, rispettivamente.

Un risultato rappresentativo di un processo di digestione proteolitica eseguito contemporaneamente su una miscela di proteine, con le microreattori sopra descritti (figure 1 e 2), è fornita in Tabella 1. La tabella comprende le sequenze peptidiche uniche che identificano una proteina particolare, la croce punteggio correlazione (Xcorr) (ossia, un punteggio che caratterizza la qualità della partita sperimentale-to-teorico per lo spettro di mass...

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Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K Views.  Virginia Tech. A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

Real-time Monitoring of Reactions Performed Using Continuous-flow Processing: The Preparation of 3-Acetylcoumarin as an Example

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible to ensure consistent product quality over time using this technique. We here show how to interface a commercially available flow unit with a Raman spectrometer. The Raman flow cell is placed after the back-pressure regulator, meaning that it can be operated at atmospheric pressure. In addition, the fact that the product stream passes through a length of tubing before entering the flow cell means that the material is at RT. It is important that the spectra are acquired under isothermal conditions since Raman signal intensity is temperature dependent. Having assembled the apparatus, we then show how to monitor a chemical reaction, the piperidine-catalyzed synthesis of 3-acetylcoumarin from salicylaldehyde and ethyl acetoacetate being used as an example. The reaction can be performed over a range of flow rates and temperatures, the in-situ monitoring tool being used to optimize conditions simply and easily.

Real-time monitoring allows for fast optimization of reactions performed using continuous-flow processing. Here the preparation of 3-acetylcoumarin is used as an example. The apparatus for performing in-situ Raman monitoring is described, as are the steps required to optimize the reaction.

Monitoraggio in tempo reale delle reazioni eseguita utilizzando la lavorazione a flusso continuo: La preparazione di 3-Acetylcoumarin come un esempio

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible ...

Chimica

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually determined by transcriptomic, proteomic, metabolomics and lipidomic measurements. In this protocol, we introduce a simple method for the reproducible extraction of metabolites, lipids and proteins from biological tissues using a single aliquot per sample. The extraction method is based on a methyl tert-butyl ether: methanol: water system for liquid: liquid partitioning of hydrophobic and polar metabolites into two immiscible phases along with the precipitation of proteins and other macromolecules as a solid pellet. This method, therefore, provides three different fractions of specific molecular composition, which are fully compatible with common high throughput 'omics' technologies such as liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometers. Even though the method was initially developed for the analysis of different plant tissue samples, it has proved to be fully compatible for the extraction and analysis of biological samples from systems as diverse as algae, insects, and mammalian tissues and cell cultures.

A protocol for comprehensive extraction of lipids, metabolites and proteins from biological tissues using one sample is presented.

Un semplice metodo di estrazione frazionata per l&#39;analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Miscelatori per lo studio microfluidici Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Bioingegneria

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves numerous incubation and liquid transfer steps in order to achieve denaturation, reduction, alkylation, and cleavage. Adapting this workflow onto an automated workstation can increase efficiency and reduce coefficients of variance, thereby providing more reliable data for statistical comparisons between sample types. We previously described an automated proteomic sample preparation workflow1. Here, we report the development of a more efficient and better controlled workflow with the following advantages: 1) The number of liquid transfer steps is reduced from nine to six by combining reagents; 2) Pipetting time is reduced by selective tip pipetting using a 96-position pipetting head with multiple channels; 3) Potential throughput is increased by the availability of up to 45 deck positions; 4) Complete enclosure of the system provides improved temperature and environmental control and reduces the potential for contamination of samples or reagents; and 5) The addition of stable isotope labeled peptides, as well as &#946;-galactosidase protein, to each sample makes monitoring and quality control possible throughout the entire process. These hardware and process improvements provide good reproducibility and improve intra-assay and inter-assay precision (CV of less than 20%) for LC-MS based protein and peptide quantification. The entire workflow for digesting 96 samples in a 96-well plate can be completed in approximately 5 hours.

Here, we present an automated plasma protein digestion method for mass spectrometry-based quantitative proteomic analysis. In this protocol, the liquid transferring and incubation steps for protein denaturation, reduction, alkylation, and trypsin digestion reactions are streamlined and automated. It takes approximately five hours to prepare a 96-well plate with desired precision.

Preparazione di un campione di plasma per la spettrometria di massa mediante una workstation automatizzata

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate protein interactions, structure, and protein conformational dynamics as a function of solvent accessibility. In recent years, the scope of FPOP, a hydroxyl radical protein foot printing (HRPF) technique, has been expanded to protein labeling in live cell cultures, providing the means to study protein interactions in the convoluted cellular environment. In-cell protein modifications can provide insight into ligand induced structural changes or conformational changes accompanying protein complex formation, all within the cellular context. Protein footprinting has been accomplished employing a customary flow-based system and a 248 nm KrF excimer laser to yield hydroxyl radicals via photolysis of hydrogen peroxide, requiring 20 minutes of analysis for one cell sample.To facilitate time-resolved FPOP experiments, the use of a new 6-well plate-based IC-FPOP platform was pioneered. In the current system, a single laser pulse irradiates one entire well, which truncates the FPOP experimental time frame resulting in 20 seconds of analysis time, a 60-fold decrease. This greatly reduced analysis time makes it possible to research cellular mechanisms such as biochemical signaling cascades, protein folding, and differential experiments (i.e., drug-free vs. drug bound) in a time-dependent manner. This new instrumentation, entitled Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), allows the user to perform cell culture and IC-FPOP directly on the optical bench using a platform incubator with temperature, CO2 and humidity control. The platform also includes a positioning stage, peristaltic pumps, and mirror optics for laser beam guidance. IC-FPOP conditions such as optics configuration, flow rates, transient transfections, and H2O2 concentration in PIXY have been optimized and peer-reviewed. Automation of all components of the system will reduce human manipulation and increase throughput.

A new static platform is used to characterize protein structure and interaction sites in the native cell environment utilizing a protein footprinting technique called in-cell fast photochemical oxidation of proteins (IC-FPOP).

Incubatore di piattaforme con stadio XY mobile: una nuova piattaforma per l'implementazione dell'ossidazione fotochimica veloce in cella delle proteine

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Biologia

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

A Streamlined Approach for Mass Spectrometry-Based Proteomics Using Selected Tissue Regions

Mass spectrometry (MS)-based proteomics enables comprehensive proteome analysis across a wide range of biological samples, including cells, tissues, and body fluids. Formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue sections, commonly used for long-term archiving, have emerged as valuable resources for proteomic studies. Beyond their storage benefits, researchers can isolate regions of interest (ROIs) from normal tissue regions through collaborative efforts with pathologists. Despite this potential, a streamlined approach for proteomic experiments encompassing ROI isolation, proteomic sample preparation, and MS analysis remains lacking. In this protocol, an integrated workflow that combines macrodissection of ROIs, suspension trapping-based sample preparation, and high-throughput MS analysis is presented. Through this approach, the ROIs of patients' FFPE tissues, consisting of benign serous cystic neoplasms (SCN) and precancerous intraductal papillary mucinous neoplasms (IPMN) diagnosed by pathologists, were macrodissected, collected, and analyzed, resulting in high proteome coverage. Furthermore, molecular differences between the two distinct pancreatic cystic neoplasms were successfully identified, thus demonstrating the applicability of this approach for advancing proteomic research with FFPE tissues.

Here, we establish a mass spectrometry-based proteomic method using isolated regions of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. This protocol is used to analyze proteome from specific tissue areas in archived formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.

Mass spectrometry (MS)-based proteomics enables comprehensive proteome analysis across a wide range of biological samples, including cells, tissues, and ...

Veloce enzimatica Trattamento di proteine per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine Struttura e dinamica

Monitoraggio in tempo reale delle reazioni eseguita utilizzando la lavorazione a flusso continuo: La preparazione di 3-Acetylcoumarin come un esempio

Un semplice metodo di estrazione frazionata per l'analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine da un singolo campione

Miscelatori per lo studio microfluidici Protein Folding

Preparazione di un campione di plasma per la spettrometria di massa mediante una workstation automatizzata

Incubatore di piattaforme con stadio XY mobile: una nuova piattaforma per l'implementazione dell'ossidazione fotochimica veloce in cella delle proteine

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

A Streamlined Approach for Mass Spectrometry-Based Proteomics Using Selected Tissue Regions

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

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Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine Struttura e dinamica

Un semplice metodo di estrazione frazionata per l'analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine da un singolo campione