Bu çalışma Fondation de France, Institut National de la Sante Et de la Recherche MEDICALE, Pierre &amp; Marie Curie Üniversitesi ve programın &#39;Investissements d&#39;avenir&#39; ANR-10-IAIHU-06 hibe ile desteklenmiştir.

Tüm işlemler Avrupa Birliği kurallarına uygun olarak yapılmıştır (direktif 2010/63 / AB) ve Hayvan Deneyleri Charles Darwin Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Ancak çoğu adımlar herkesin özel ihtiyaçlarına uygun şekilde adapte edilebilir, burada rutin laboratuvarda kullanmak prosedürü açıklar. 1. Cerrahi Hazırlık Not: Tüm kesi ve basınç noktaları tekrar tekrar lokal anestezi (lidokain veya bupivakain) ile infiltre edilmelidir. aseptik hazırlanışı çeşitli modifikasyonlar uygulanmalıdır gerekli ise, bu işlem, bir terminaldir. <ol><li> İki yerel olarak ayrılmış intraperitonal (IP) enjeksiyon sodyum pentobarbital (40 mg / kg) ve ketamin (50 mg / kg) ile, bir sıçan anestezisi. </li><li> Hayvan genel anestezi altında gitmek ve tekrar tekrar anestezi cerrahi düzlem (kısma ayak hiçbir tepki) elde doğrulamak edelim. Bir fe sıçan yerleştirinedback ısıtma battaniye ve 37 ° C civarında çekirdek sıcaklığını korumak için bir rektal prob takın. </li><li> Anestezik ajanların sonraki enjeksiyon kolaylaştırmak ve tekrarlanan iğne delikleri 30 ile organları perforan önlemek için periton boşluğuna bir kateter yerleştirin. <ol><li> Midenin alt sağ veya sol kadran içinde yer alan bir bölgede üzerindeki alana - küçük (3 mm ~ 2) üzerinden saç klibi. Not: Depilasyon krem ​​de kullanılabilir. </li><li> keskin bir makas veya neşter ile cilt üzerinde 3 mm kesi - 2 yapın. periton boşluğu görülmektedir kadar künt diseksiyon kullanarak, yağ ve kas tabakaları kaldırmak. </li><li> boşluğunda küçük bir kateter 2 cm ve cerrahi yapıştırıcı ile yarayı kapatmak - yaklaşık 1 yerleştirin. (. Örneğin, 2 Fransızca - iç çapı 0.043 mm karşılık gelen) Not: çap ve kateter toplam uzunluğu en az olmalıdır ölü hacimleri azaltmak için. Poliüretan tüpler en uygundur. </li><li> bir döngü ve dikiş t yapmako yere sabitlemek için cilde kateter. </li></ol></li><li> Suni solunum sırasında havalandırma kontrol etmek için bir trakeal tüp takın. <ol><li> Bir önceki adımda olduğu gibi, ilgi alanı hazırlamak (1 - sağ manubrium yukarıdaki trakea üzerinde 2 cm), saç kaldırmak ve cildi insizyon. </li><li> yağ ve kasların ilk katmanları incelemek künt, sonra bir kenara tükürük bezi taşımak ve yavaşça kasların son katmanını diseksiyon ile trakea maruz kalmaktadır. </li><li> Dikkatle trakea üzerinde dokuları kaldırmak ve küçük forseps kullanarak altında bir iplik kaydırın. iplik ile bir cerrahın düğümü yapmak ancak henüz sıkı değil. </li><li> İki kıkırdak halkaları arasındaki trakea enine doğru İnsizyon. trakea varsa içinde Swab kan. </li><li> Uygun çaplı bir trakeal tüp takın ve istikrarlı tüp güvenli parçacığının düğüm sıkın. Ek stabilite için iplik daha trakea borusunun daha yüksek bir noktasında eklenebilir. </li><li> sütüre yara yakın veya cerrahi zımba kullanın. Trakeal tüp yeniden amaçlanmıştır burada cerrahi yapıştırıcı kaçının. </li></ol></li><li> Stereotaksik çerçeve içinde hayvan takın ve dikkatlice aşağıdaki fizyolojik değişkenleri izlemek: EcoG, SpO 2, EtCO 2, ve iç sıcaklık (elektrokardiyogram, EKG aracılığıyla) kalp hızı. Monitör ve anestezi ve fizyolojik durumu uygun bir derinlik tutmak için bu değişkenleri ayarlayın. Özellikle, sodyum pentobarbital küçük bir doz (10 mg / kg), gerekirse anestezi tamamlar. </li><li> kuruma önlemek için her iki göze göz merhemi sürün. uzunlamasına bir kesi (~ 2 cm) yapmak, kafa derisi üzerinde saç klibi ve bir neşter veya küret kullanılarak kafatası örten bağ dokuları rezeksiyonu. </li><li> Bir diş matkap ile ilgi bölge üzerinde küçük bir (~ 1.5 mm çap) kraniotomiye olun. Not: Burada, birincil somatosensoriyel korteks varil alanı hedeflenmektedir (7-8 mm anterior interaural hattına, 4.5- 5,5 mm) orta hat 31 lateral. ısıyı dağıtmak için art arda durulayın. </li><li> yavaşça dura küçük bir delik yapmak için ekstra ince forseps kullanın. EcoG elektrot yerleştirmek için kranial trepanasyon içinde ~ 0,5 mm bölgesini ayırmak (sonraki adıma bakın). Kalıcı% 0.9 NaCl çözeltisi (ya da yapay beyin omurilik sıvısı) ile nemli korteks tutmak. </li><li> değil menenjlerin kapsadığı kortikal bölgeyi kaçınarak, dura üzerinde düşük empedans (~ 60 kÊ) gümüş elektrot (EcoG elektrot) yerleştirin ve başın diğer tarafında bir kafa derisi kas üzerindeki referans elektrot yerleştirin. </li><li> Bu aşamada (son sodyum pentobarbital enjeksiyondan sonra 30 dakika), bir IP kateter vasıtasıyla sodyum pentobarbital (10-15 mg / kg / saat) veya fentanil (3-6 ug / kg / sa) tekrarlanan enjeksiyonu ile anestezi bakımı. ikincisi desynchronized, uyanma gibi, kortikal profiline neden olur, oysa önceki yavaş salınım, uyku-benzeri, ECoG model ile sonuçlanır. </li><li> yapay v ayarlayınsolunum frekansı ve hacim sıçan spontan solunum (- 115 nefes / dk 32 normal aralık 70) benzemektedir böylece entilation sistemi. Ardından, trakeal tüp mekanik ventilasyon bağlamak ve (her iki tarafta) uygun göğüs kafesi enflasyonu kontrol edin. Eğer değilse, nefes borusu ekseni havalandırma boru konumunu ayarlamak. Gerekirse, bir şırınga ya da bir vakum pompasına bağlı bir kateter ile trakea mevcut salgılanmasını emmek. </li><li> 29,36 desen anestezi istikrarlı bir cerrahi uçağı yansıtan 32-35 ve EcoG tüm fizyolojik değişkenler, sıçan, 40 mg felç için her bacaktaki gallamine trietiodidi bir kas içi enjeksiyon yaparsanız / ilk enjeksiyon için kg ve daha sonra 20 mg / kg her 2 saatte 19,29,36,50. </li></ol> 2. Hücre içi Kayıtlar <ol><li> Bir ~ 0.2 mikron ucu ile bir cam mikropipet (keskin mikroelektrot) çekin gibi direnci betwee aralıkların, 50 ile 80 M? kez 2 M potasyum asetat (KAC) ile doldurulur. </li><li> (Bir kafa aşamasında aracılığıyla) bir hücre içi amplifikatöre pipet çözüm bağlamak için gümüş / gümüş-klorür (Ag / AgCl) tel ile belirli bir tutucu pipet yerleştirin. sahibinin bir micromanipulator eklenmelidir. Sıçan boyun kasları üzerinde bir Ag / AgCl referans elektrodu yerleştirin. </li><li> Yavaş yavaş ilgi bölgeye aşağı beyinde pipet eklemek ve mevcut adımlarla cevaben düşer gerilim izleyerek direncini doğrulayın. Gerekirse pipet temizlemek için amplifikatörün düğmesini vızıltı kullanın (ya da zap). </li><li> kraniotomiye beyin hareketlerini azaltmak için silikon elastomer ya da% 4 agaroz ile kaplayıp önce (ECoG ya da hücre içi elektrotlar dokunmamaya dikkat edin) kuru pamuklu çubuklarla veya sentetik emilim üçgenleri kullanın. </li><li> Bir hücre yaklaşırken direnci artar kadar 2 mikron adımda - 1 pipet indirin. Sonra PENETRA için amplifikatörün vızıltı işlevini kullanınnöron içine te. </li></ol> 3. Isoelectric State øndükle <ol><li> Aynı anda nöronun membran potansiyelini, ECoG ve fizyolojik değişkenleri izlerken bu aşamada uygun deneysel protokol (örneğin, yanıtları ateş hücre enjekte akımlar, akım-gerilim ilişkileri, duyusal uyaranlar yanıtları) gerçekleştirin. </li><li> Hücre içi elektrot kayıt oturum boyunca membran potansiyeli ve aksiyon potansiyel tıbbi özellikleri metanet analizi ile hücre içinde stabil olduğundan emin olun. Değilse, sonraki adıma geçin ve kayıt stabil hale gelene kadar tekrar beklemek veya başka bir nöron için aramazlar. </li><li> sodyum pentobarbital yüksek, ancak alt-ölümcül doz enjekte IP hattı ile (~ / kg 90 mg, pentobarbital, ilk durumda 35 mg / kg fentanil ilk durumuna gelen 155 mg / kg &#39;a kadar düşük olabilir). Not: 15 içinde - 20 dakika hücre içi ve EcoG waveforms geçici giderek tam bir izoelektrik duruma çöker, hangi 37,38 profil sözde &quot;patlama-bastırma&quot; ulaşmak için aralıklı elektrik sessizlikler ile yavaşlatmak gerekir. Kalp hızı belirgin olarak (~ 10 tarafından -% 20) yavaşlatır beklenmektedir ancak SpO2 ve EtCO 2 nispeten sabit kalmalıdır. </li><li> izoelektrik devlet ulaşılamaması halinde, sodyum pentobarbital küçük bir miktar enjekte (~ adım 3.1 dozun% 10). izoelektrik devlet hala elde değilse daha fazla anestezik eklemeden önce 15 dakika bekleyin. </li><li> Kaydedilen nöronun bütünleştirici özellikleri üzerine ağ dinamiklerinin etkisini karşılaştırmak için deneysel protokol tekrarlayın. Not: anestezik enjeksiyon kesilmesinden sonra, elektriksel beyin aktivitesi tamamen 3 ila 4 saat içinde kurtarmak gerekir. </li><li> Deneyin sonunda, sodyum pentobarbitalin letal doz enjekte (200 mg / kg, ip) sıçan euthanize. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biz burada ağ ve hücresel düzeydeki in vivo spontan serebral elektriksel aktivitenin içinde bastırmak için yeni bir yöntem tarif. Bu prosedür, izoelektrik koma 41 olarak bilinen bir aşırı beyin durumuna yol açar. görünümünde bir klinik açıdan bakıldığında, böyle bir elektroserebral hareketsizlik EEG görülebilir en ağır anormallik olduğunu. Çoğunlukla ya ölüyor ya da kalıcı bitkisel 42 devam tüm hastalarla, geri dönüşü olmayan bir koma ile ili...

herhangi bir çevresel uyaranlara veya davranışsal görevlerin yokluğunda, &quot;dinlenme&quot; beyin elektroensefalografi (EEG) dalgalar olarak kafa derisi kaydedilebilir elektriksel aktivitenin sürekli bir akış oluşturur. Bu endojen serebral aktivitenin hücre içi korelasyon afferent ağlar 1,2 sürekli aktiviteyi yansıtan eksitatör ve inhibitör sinaptik potansiyellerin bir arada oluşur (aynı zamanda &quot;sinaptik gürültü&quot; olarak da bilinir) arka plan membran voltaj dalgalanmaları ile karakterizedir. Bu spontan aktivite teyakkuz farklı devletleri ile frekans ve genlik değişir. Tek nöronların eksitabilite ve cevaplılığı üzerine ağ etkinliğinin etkisini aydınlatılması sinirbilimlerden 3,4 büyük zorluklardan biridir. Birçok deneysel ve hesaplamalı çalışmalar bütünleştirici propertie devam eden sinaptik aktivitenin fonksiyonel etkilerini araştırdınöronların s. Ancak, arka plan sinaptik gürültü etkilenen farklı nöronal parametrelerin rolü belirsiz kalır. Örneğin, membran depolarizasyon ortalama seviyesi pozitif 5,6 veya negatif 7-9 aksiyon potansiyelleri tetiklemek için algılama verilerinin yeteneği ile ilişkili bulunmuştur. Bazı araştırmalar afferent sinaptik girdi sürekli değişen akışından kaynaklanan zar potansiyeli dalgalanmalar, güçlü bir şekilde giriş-çıkış ilişkisi 3,10-13 kazancını düzenlenmesiyle tek nöronların yanıt etkilediğini düşündürmektedir oysa Ayrıca, diğerleri göstermektedir inhibisyonu şant aracılık ettiği zar girişi iletkenlikteki değişimler ne olursa olsun, membran dalgalanmalar 14,15 büyüklük nöronal kazanç modüle edilmesi için yeterli olmaktadır. Son olarak, uyanık hayvanlar üzerinde yapılan son çalışmalar, tek bir nöron duyusal bilginin işleme eleştirel uyanıklık a durumuna bağlıdır nasıl vurguladınd mevcut davranışsal talep 16,17. son derece enterkonnekte sistemin belirli bir sürecin işlevsel rolünü aydınlatmak için bir basit strateji yokluğu özellikle sistemin işleyişini nasıl değiştirdiğini tespit etmektir. Bu yöntem geniş bir deney lezyonlar ya da farklı beyin bölgeleri 18-21 inaktivasyonunu veya spesifik iyon kanalları 22,23 farmakolojik blokajı kullanılarak, örneğin, nörolojik araştırmalarında kullanılmıştır. Özellikle, fonksiyonel bağlantı ve ağ dinamikleri tek hücre hesaplama 24-27 nasıl etkilediğini açıklayacak in vivo olarak tatbik edilmiştir. Bununla birlikte, bugüne kadar yerel manipülasyonlar nöronların ateş engellemek ve / veya kısmen etkili olabilir temel biyofiziksel özellikleri karıştırmayı amaçlanmıştır ve nispeten küçük beyin hacmi 28 ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları aşmak için, in vivo deneysel bir yaklaşımla yeni bir geliştirilmişSıçan tüm beyin sinaptik etkinlik 29 tamamen bastırılmasıyla sonra elde edilen belirli bir ağ, dinamik gömülü belirli bir beyin durumda kaydedilen tek nöronların, yani, elektrofizyolojik özellikleri karşılaştırma. Kontrol koşulları olarak, iki farklı kortikal dinamikleri oluşturulabilir. Uyku benzeri elektrokortikografik (ECOG) desenleri, sodyum pentobarbital orta doz enjeksiyonu ile indüklenmiştir. Seçenek olarak ise, uyanıkken (uyanık benzeri örneği) temel kortikal aktivite ile karşılaştırılabilir küçük genlikli hızlı ECoG dalgaları fentanil enjeksiyonla üretilebilir. Aynı ECoG ve hücre içi kayıt korurken Daha sonra, endojen beyin elektriksel aktivitesi tam bir susturma izoelektrik ECOG ve hücre içi faaliyetleri, özelliği, sodyum pentobarbital yüksek doz, sistemik enjeksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Böyle bir aşırı koma indüksiyon potansiyel olarak ölümcül Ardışık olabilir çünkübiyolojik fonksiyonları ces, fizyolojik değişkenlerin dikkatli ve sürekli izleme gerekliydi. Bu nedenle, biz titizlikle deneyler boyunca kalp atım frekansını, end-tidal CO 2 konsantrasyonu (EtCO 2), O 2 doygunluğu (SpO2) ve sıçan çekirdek sıcaklığını izledi. Biz, in vivo uzun ve istikrarlı bir kayıtlar için uygundur keskin Mikroelektronlar kullanarak bu farklı durumlarında tek nöronlar özelliklerini değerlendirir. Burada tarif edilen prosedür, diğer elektrofizyolojik ve görüntüleme yaklaşımları ile kombine edilebilir ve diğer hayvan modelleri genişletilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Centravet</td>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 500</td>
			<td>Merial</td>
			<td>Imalg&#232;ne 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl&#160;</td>
			<td>Janssen-Cilag</td>
			<td>Fentanyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine</td>
			<td>Centravet</td>
			<td>Xylovet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallamine triethiodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECoG amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>AC amplifier, Model 1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition interface</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>CED power 1401-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Spike2 version 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>IVM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire 0.125mm (intracellular recording)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-AgCl reference</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>E242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire 0.25mm (ECoG recording)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial respiration system</td>
			<td>Minerve</td>
			<td>Alpha Lab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological parameters monitoring</td>
			<td>Digicare</td>
			<td>LifeWindow Lite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Blanket</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15005-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5SF</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69mm&#160;&#160;</td>
			<td>Instech</td>
			<td>BTPU-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon elastomere</td>
			<td>WPI</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>NSK</td>
			<td>Y1001151 and P496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>3M</td>
			<td>vetbond</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of an isoelectric brain state to investigate the impact of endogenous synaptic activity on neuronal excitability in vivo

yolu nöronlar işlem bilgileri kendi içsel membran özelliklerine ve afferent sinaptik ağının dinamikleri hem de bağlıdır. kuvvetle uyanıklık durumunun bir fonksiyonu olarak değişmektedir özellikle endojen üretilen ağ aktivitesi, olarak, önemli ölçüde nöronal hesaplama modüle eder. Spontan serebral dinamikleri tek nöronların bütünleştirici özelliklerini nasıl etkilediğini farklı araştırmak için, sodyum pentobarbital yüksek dozda sistemik enjeksiyonu yoluyla in vivo olarak serebral aktivitesi bastırmada oluşan sıçan yeni bir deneysel strateji geliştirmiştir. Sürekli kombine elektrokortikogram (EcoG) ve hücre içi kayıtları tarafından izlenen kortikal faaliyetleri, giderek istikrarlı bir izoelektrik profiline lider, yavaşlar. derin bir koma halinde sıçan koyarak bu aşırı beyin devleti, dikkatle deneyler boyunca hayvanın fizyolojik sabitleri ölçülerek izlendi. Hücre içi recordings bize karakterize ve uyku-uyanıklık döngüsü karşılaşıldığı gibi fizyolojik ilgili kortikal dinamikleri, içine gömülü aynı nöronun bütünleştirici özelliklerini karşılaştırmak için izin ve beyin tamamen sessiz olduğu zaman.

Uyaran ve bir izoelektrik beyin durumunu korumak in vivo deneysel prosedürde bir hassastır. Doğrudan sinirsel uyarıların ve transfer fonksiyonunun 29 kortikal ağ etkinliğinin etkisini incelemek için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Şekil 1 (Şekil 1A önce hayvanın fizyolojik durumunun ECOG ve hayati sabitleri de dahil olmak üzere çok parametreli izleme, gösterir izoelektrik devletin) ve sonra <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo at JoVE.com

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Bu prosedür bir izoelektrik beyin devlet sonuçlanan fizyolojik ilgili beyin durumlarında ve devam eden elektrik faaliyetlerinin tam kaldırılmasından sonra tek nöronların uzun ömürlü in vivo hücre içi kayıtları gerçekleştirir. hayvanın fizyolojik sabitleri dikkatle yapay komada durumuna geçiş sırasında izlenir.

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için<em&gt; İn Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

induction-an-isoelectric-brain-state-to-investigate-impact-endogenous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

8.0K Görüntüleme.  Inserm U1127.  Bu prosedür bir izoelektrik beyin devlet sonuçlanan fizyolojik ilgili beyin durumlarında ve devam eden elektrik faaliyetlerinin tam kaldırılmasından sonra tek nöronların uzun ömürlü in vivo hücre içi kayıtları gerçekleştirir. hayvanın fizyolojik sabitleri dikkatle yapay komada durumuna geçiş sırasında izlenir. 

Video: Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Nörobilim

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Murine Model of Controlled Cortical Impact for the Induction of Traumatic Brain Injury

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the United States. In fact, TBI is a contributing factor to over a third of all injury-related mortality. Nonetheless, the cellular and molecular mechanisms underlying the pathophysiology of TBI are poorly understood. Thus, preclinical models of TBI capable of replicating the injury mechanisms pertinent to TBI in human patients are a critical research need. The controlled cortical impact (CCI) model of TBI utilizes a mechanical device to directly impact the exposed cortex. While no model can full recapitulate the disparate injury patterns and heterogeneous nature of TBI in human patients, CCI is capable of inducing a wide range of clinically applicable TBI. Furthermore, CCI is easily standardized allowing investigators to compare results across experiments as well as across investigative groups. The following protocol is a detailed description of applying a severe CCI with a commercially available impacting device in a murine model of TBI.

Here we describe a protocol for the induction of murine traumatic brain injury via an open-head controlled cortical impact.

Travmatik Beyin Hasarı İndüksiyonu için Kontrollü Kortikal Etki Murine Modeli

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the ...

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması_{1-42 İndüksiyon}

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

Travmatik Beyin Hasarı İndüksiyonu için Kontrollü Kortikal Etki Murine Modeli

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42 İndüksiyon

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

Hayvanlar davranmak, Awake Tek-birim Recordings Microwires Organize Dizileri implantasyon için Usulü

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

Travmatik Beyin Hasarı İndüksiyonu için Kontrollü Kortikal Etki Murine Modeli

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması_{1-42 İndüksiyon}