We thank Cora H&#252;bner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

윤리 문 : 모든 실험 절차는 연구에 동물의 사용에 대한 EU 지침에 따라이었고, 지역 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (Regierungspräsidium 튀빙겐, 바덴 뷔 르템 베르크, 독일의 상태) 튀빙겐 대학에 대한 책임. 1. 정위 주입 절차 <ol><li> 멸균기를 사용하여 멸균 도구 (가위, 메스, 클램프, 드릴, 바늘, 봉합 재료)를 준비합니다. 이러한 무균 수술 드레이프에 멸균면 교환, 소독, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS, pH를 7.4), 및 H 2 O 2와 같은 살균 도구 및 기타 필요한 솔루션 및 수술 용품을 정리하십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 수평 미세 전극 풀러에 3 mm 폭 상자 필라멘트를 사용하여 주사에 대한 유리 Micropipette과 (그림 1A, 삽입)을 당깁니다. 주 : 깊은 주사제, 전극 테이퍼가 충분히 있어야복부 대부분의 좌표에 도달 할 길이 (약 5mm;. 좌표를 들면, 1.10 참조). </li><li> 프리믹스 바이러스 솔루션의 1 μL 멸균 PBS에서 0.1 % 빠른 그린 솔루션의 0.2 μL (유리 피펫의 솔루션의 더 나은 가시성). 좋은 팁 (그림 1A, 삽입)와 마이크로 리터 피펫을 사용하여 바이러스 솔루션과 빠른 녹색의 혼합물로 유리 피펫을 입력합니다. 참고 : 재조합 아데노 관련 바이러스 성 벡터 (rAAV)와 협력은 바이오 안전성 레벨 1 (BSL 1) 작업으로 간주하고 BSL (1) 실험실에서 수행 될 필요가있다. 이 연구 (그림 1C)에 사용 rAAVs이 있었다 : 1) mPFC : rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (혈청 형 2/9) (16) 2) MGM / PIN : rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (혈청 형 2/9) (23); 3) mpITC / BLA : rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (혈청 형 2/1) (23) </li><li> 작은 동물의 마취 기계 (: 유도 산소 3 % 아이소 플루 란)를 사용하여 마우스를 마취. 참고 :이 연구에 사용 된 마우스를 4이었다 -7 주 다음과 같은 균주 및 유전자형 (도 2A 및 3A-D에서 실험) C57BL6 / J 야생형; GAD67-GFP (24) (도 2b 및 3E-H의 실험); Tac2-Cre 호텔 (25) (도 2C 및 3I-J에서 실험). </li><li> 귀와 눈 사이의 머리를 면도. 면봉을 사용하여 면도 헤드 살균제 (기반 프로 비돈 요오드)를 적용합니다. </li><li> 마취 동안 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 피하 진통로 (멜 록시 캄 계, 0.1 ml의 5 ㎎ / ㎖ 용액)를 주입 마우스. </li><li> (: 유지 보수를 위해 산소의 2 % 아이소 플루 란) 정위 프레임 (그림 1A)에 마우스를 올려 놓고 가스 마취 마스크를 통해 마취를 유지한다. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. 참고 : 전체 수술시 무균 조건뿐만 아니라 수를 유지; 일회용 안면 마스크를 착용, 수술 이동, 장갑 WN. </li><li> 가위를 사용하여 머리의 상단에 피부 절개를합니다. 부드럽게 H 2 O 2와 두개골 표면, 청소 두개골을 노출 클램프로 고정, 무딘 집게를 사용하여 옆으로 피부를 당기십시오. </li><li> 두 반구 (그림 1B)에 대한 좋은 팁 영구 마커 및 드릴 구멍을 사용하여 두개골에 마크 주사 부위. mPFC :이 연구에서 주사 (브레 그마 (mm)에서)입니다 좌표 전방 1.9, 0.3 ± 측면, 복부 2.1; MGM / PIN : 1.8 ± 측면, 3.0 뒤, 복부 3.8; mpITC / BLA : 3.35, 및 4.75 복부 ± 측면, 1.45 후방. </li><li> 가압 주입 장치에 접속 정위 프레임에 채워진 유리 피펫 마운트 정수리 위치로 피펫을 가져온다. </li><li> 미세 스트레이트 팁 집게를 사용하여 유리 피펫의 팁을 끊다. 바이러스 솔루션의 에어로졸 발생을 방지하기 위해 부드럽게이 작업을 수행합니다. 피펫 팁 몇 압력 펄스를 적용하고 비루 한 방울의 압출을 관찰하여 열려 있는지 확인합니다의 솔루션입니다. </li><li> 원하는 주입 좌표로 이동하여 압력 분사 장치에서 다음 설정을 사용하여 피펫 콘텐츠 (~ 0.5 μL)의 절반을 주입 : 압력 : 20 psi의 평균 펄스 길이 : 30 밀리 초, 펄스의 평균 : 50. </li><li> 를 후퇴 천천히 (1mm / 분) 전 ~ 1 분 동안 장소에서 피펫을 둡니다. 참고 : 확인 피펫 다른 반구에 같은 피펫 절차를 반복하기 전에 차단되지되어 있는지 확인합니다. 차단 된 팁의 경우 청소하거나 다시 브레 그마에 팁과 제로 피펫 위치를 끊다. </li><li> PBS (산도 7.4) 청소 두개골, 부드럽게, 클램프를 제거 함께 피부를 당겨, 개별 버튼 봉합과 절개 봉합 (3-4 노트). 상처 주위에 살균제 (기반 프로 비돈 요오드)를 적용합니다. </li><li> 마취를 중지하고 완전히 깨어 때까지 무인 마우스를 두지 마십시오. 단일 보관되어 유지 또는 완전히 회복 만 다른 동물의 회사에 반환합니다. 수술 후는 건강 상태를 지속적으로 모니터링하고, adminis터 진통 필요한 경우. 지역 동물 관리 및 사용위원회가 제시 규칙에 따라 절차를 따르십시오. </li></ol> 급성 조각 2. 준비 <ol><li> ACSF, 절단 솔루션, 도구 (가위, 메스, 집게, 주걱, 파스퇴르 피펫), 한천 블록을 준비합니다. 참고 : 인공 뇌 - 척수 (ACSF)의 1 L 실험마다 필요하며, 이전에 16,23을 발표 한 두 번 증류 H 2 O에 화학 물질을 용해시켜 제조한다. 절단 용액을 2 M 황산 원액 0.87 ㎖로 ACSF 200 ㎖를 보충하여 제조된다. </li><li> 네이트 ACSF와 95 % O 2 5 % CO 2와 실험을 통해 절단 솔루션입니다. </li><li> 깊이 이소 플루 란을 이용하여 작은 동물 마취기 (산소 3 %)를 사용하여 마우스를 마취. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다. </li><li> 큰 가위를 사용하여 마우스를 목을 벨 즉시 진정얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리. </li><li> 꼬리에서 주동이와 하나의 중간 선 절개를 엽니 다 두개골 부드럽게 집게를 사용하여 측면에 두개골 조각을 밀어 넣습니다. 빠르게 부드럽게 작은 둥근 주걱을 사용하여 두개골 밖으로 들어 올려 머리를 제거합니다. 메스와 소뇌를 잘라. 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리를 놓습니다. </li><li> mPFC 주입 사이트 (mPFC 포함) 메스를 사용하여 뇌의 앞쪽 부분을 잘라 슬라이스 때까지 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 넣어. </li><li> 여과지로 과잉의 절단 용액을 제거하고 vibratome 스테이지 상 뇌의 후방 부를 접착제. </li><li> 기울어 진 편도 슬라이스를 들어, 35 ° 각도 (그림 1D, 중간)에 한천 블록 (4 %) 인하에 뇌 접착제. 관상 편도 조각, MGM / PIN 주입 사이트 및 mPFC 주입 사이트의 경우 (그림 1D가, 왼쪽 및 오른쪽) 무대에서 직접 뇌를 붙입니다. 슬라이스 동안 안정성을 위해 뇌 뒤에 추가 한천 블록을 배치합니다. </li><li> PLAC냉각 장치를 사용하여 39 ° C로 유지 빙냉 산소 절단 용액 챔버 절삭 E 단계. 사파이어 블레이드를 사용하여 편도체 (320 μm의)의 급성 슬라이스를 준비합니다. 실온에서 산소 ACSF와 함께 제공되는 인터페이스 챔버에서 슬라이스를 놓습니다. </li><li> 45 분 - 급성 편도 조각의 준비를 한 후, 35 조각을 복구하기 위해 36 ° C에서 수조의 인터페이스 챔버를 배치합니다. 이어서, RT에 인터페이스 챔버를 반환한다. 이 조각에서 녹화를 들어, 단계 3.2를 진행합니다. </li><li> 급성 편도 슬라이스 (- 2.9 2.8 단계)에 대해 전술 한 바와 같이 단계 2.10의 시작 동안, 주사 부위의 조각을 잘라. 수조에서 조각의 복구는 여기에 필요하지 않습니다. 선택 사항 : 빠르게 주사 부위의 위치를​​ 추정 형광등 적절한 필터 세트를 구비 입체경에 조각을 관찰. </li><li> 이 필터 서류 및 submer 사이를 끼워 혹 사후 분석을 위해 주사 부위를 포함하는 슬라이스를 수정PBS 용액에서 O / N의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 그들을 카. 주사 부위의 분석을 위해 단계 4.1를 진행합니다. </li></ol> 시냅스 섬유 3. 시각화 및 자극 <ol><li> 섬유와 세포의 optogenetic 활성화를위한 패치 현미경을 준비 : <ol><li> 빛 전달 경로 상에 장착 된 발광 다이오드 (LED)를 중심으로. </li><li> 후 초점면에서 470 nm의 적절한 파장을 선택하는 전력 측정기와 각 목적의 출력에서​​의 LED의 광 강도를 측정한다. </li><li> mW의 / mm 2의 빛의 세기를 계산하고 470 nm 파장에 대한 측정 값에 대한 각각의 목적에 대해 (광 출력 (MW / mm 2) 대 LED 강도 (%)) 검량선을 작성합니다. </li></ol></li><li> 형광 램프를 구비 한 수직 현미경에 장착 슬라이스 챔버 내의 인터페이스 챔버 장소에서 급성 편도선 슬라이스 검색. SLIC가 같은 조각의 위치를​​주의하십시오인터페이스 챔버 위로 향하게 E면은 상기 기록 챔버 내에서 위로 향하게된다. ~ 31 ° C의 온도에서 2 ㎖ / 분 - 1의 비율로 신선한 산소 ASCF와 슬라이스 관류. </li><li> 발현 특정 형광 단백질에 적합한 필터 세트와 함께 상기 형광 램프를 사용하여 슬라이스 내의 연접 섬유를 관찰한다. 개요 (그림 1E), 대상 지역 내의 섬유 밀도의 평가를위한 60 배 목표를 얻기 위해 5 배 목표를 사용합니다. GFP 및 YFP를 들어, 사용 필터는 지정된 mCherry는 &quot;빨간색&quot;(여진 40분의 560, 빔 스플리터 (585), 배출 70분의 630)를 설정 필터를 사용하기위한 &quot;녹색&quot;(여진 20분의 472, 빔 스플리터 (495), 배출 (490) LP)로 설정 : 참고 재료 / 장비 테이블입니다. </li><li> 열거 나 실험 (그림 2D)에 대해 원하는대로 현미경 빛의 경로에서 조리개를 제한 할 수 있습니다. </li><li> 패치 녹음을 얻으려면, 내부 솔루션 패치 피펫을 작성하고 난 마운트n 개의 전극 홀더. 패치 피펫에 긍정적 인 압력을 적용 천천히 미세 조작기를 사용하여 슬라이스로 시각적 통제하에 먼저 목욕 솔루션으로 다음을 낮 춥니 다. <ol><li> 측면과 상단에서 패치 피펫 관심의 신경 세포에 접근. 피펫 (세포 표면에 딤플 표시) 세포의 표면 상에있을 때 양의 압력을 해제하고 부압을 적용하여 &quot;기가 시일&quot;를 얻었다. </li><li> 전 세포 기록을 얻기 위해, 막 패치 파열 상기 흡입을 적용한다. 이어서, 셀의 전기 응답을 기록하는 동안 CHR (470 나노 미터)를 활성화시키기위한 적절한 파장을 사용하여 접속 된 LED 표지 섬유를 자극한다. </li><li> 시냅스 자극 낮은 LED 휘도 시작하여 원하는 시냅스 전류 진폭에 도달 할 때까지 증가한다. 상기 타이밍 펄스 길이를도에서 (예를 제어하기 위해 상기 데이터 수집 소프트웨어에 디지털 출력을 구성하여, LED 트리거3). 주의 : 다른 소프트웨어 및 / 또는 TTL 발생 장치는 LED 트리거 할 수있다. </li></ol></li><li> 및 / 또는 특정 약물의 존재 하에서 그 다음에 기록 된 셀에 대한 원하는 현미경 광 통로의 개방 또는 제한 개구 (단계 3.4)을 반복 자극. </li><li> 기록 후,이 필터 종이 사이를 사이에두고 4 % PFA O / N에서 그들을 잠수하여 혹 사후 분석을위한 슬라이스를 수정합니다. </li><li> 전기 생리 데이터를 분석 할 수 있습니다. 참고 : 사용하여 해당 소프트웨어는 각각의 자극 오프라인 기록 된 스윕 데이터를 시각화 할 수 있습니다. 약물의 효과를 분석 할 때, 모든 개별 스윕에 대한 시냅스 전류 진폭에 약물 효과의 시간 경과를 얻기 위해 피크 검출 루틴을 사용합니다. 약물의 효과는 정상 상태에 도달 할 때 결정합니다. 실험 조건 당 평균 ≥10 개별 스윕에 소프트웨어를 사용, 인물에 대한 대표적인 평균 응답을 준비하는 CF (그림 3B-D, FH, J 오른쪽 패널). 주 : 여러 대안적인 소프트웨어 패키지가 데이터 분석에 사용될 수있다. </li></ol> 사출 사이트 4. 사후 분석 <ol><li> 및 (재 이미징 단계 3.7에서, 원하는 경우) PBS에 세 번 사이트를 기록한다 (단계 2.12에서) 주사 부위의 조각을 씻으십시오. 이 반복을 10 분 동안 회전 진탕 기에서 신선한 PBS로 3 회 용액을 대체함으로써 수행된다. </li><li> PBS의 2 % 한천 솔루션을 준비하고 ~ 65 ° C로 냉각 할 수 있습니다. 작은 30mm 직경의 페트리 접시의 바닥에 평평하게 배치 조각, 한천 슬라이스를 포함하고 고체까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> vibratome의 무대에 내장 된 조각 또는 조각으로 한천 블록 접착제 및 PBS와 실을 절단 무대를 놓습니다. </li><li> 절제술 70 μm의 두께로 슬라이스를 포함. 옵션 : resectioning 후, 조각은 cytoarchitecture (그림 3A, C)를 공개 Neurotrace으로, 즉, 스테인드 할 수 및 / 또는 bYFP 또는 mCherry에 대한 y를 면역 형광 염색은 CHR 융합 단백질의 신호를 증폭한다. </li><li> 설치 미디어 슬라이드와 커버 슬립에 산 조각. 이미지 주사 부위와 원하는 경우, 형광 현미경 또는 공 초점 레이저 주사 현미경 (도 2A-C)를 이용하여 투영 영역에있는 섬유를 함유 또한 이미지 조각. </li></ol>

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C., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+marking+and+characterization+of+Tac2-expressing+neurons+in+the+central+and+peripheral+nervous+system.">Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system.</a> Mol Brain. 5, (2012).</li><li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission.">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> J Neurosci. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li><li>Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+modification+of+a+central+amygdala+fear+circuit.">Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 332-339 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li><li>Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLA+to+vHPC+inputs+modulate+anxiety-related+behaviors.">BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors.</a> Neuron. 79 (4), 658-664 (2013).</li><li>Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-specific+suppression+of+GABA+release+from+parvalbumin+interneurons+in+the+basolateral+amygdala+by+dopamine.">Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine.</a> J Neurosci. 32 (42), 14815-14820 (2012).</li><li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel.">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li><li>Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+behavioral+profile+of+multiple+glutamatergic+inputs+to+the+nucleus+accumbens.">Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens.</a> Neuron. 76 (4), 790-803 (2012).</li><li>Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity.">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li><li>Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+plasticity+in+amygdala+inputs+from+temporal+association+cortex+by+the+external+capsule.">Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule.</a> J Neurosci. 31 (1), 339-345 (2011).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364 (2003).</li><li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+transduction+efficiency,+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1,+2,+5,+6,+8,+and+9+in+the+mouse+brain.">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), (2013).</li><li>Salegio, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+of+adeno-associated+viral+vectors+is+serotype-dependent.">Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent.</a> Gene Ther. 20 (3), 348-352 (2013).</li><li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala.">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neurosci. 15, (2014).</li><li>McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+transduction+efficiency+of+recombinant+AAV+serotypes+1,+2,+5,+and+8+in+the+rat+nigrostriatal+system.">Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system.</a> J Neurochem. 109 (3), 838-845 (2009).</li><li>Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+channelrhodopsin-2+(ChR2)+expression+can+induce+abnormal+axonal+morphology+and+targeting+in+cerebral+cortex.">Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex.</a> Front Neural Circuits. 7, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 프로토콜은 모든 경우 쉽게, 가장에 구현 될 수있는 신경 회로와 지역 연결의 생체 optogenetic 조사하는 방법을 설명은 표면 형광 빛 포트에서 LED가 ~ 470 nm의 그들을 무장하여 수직 조각 패치 클램프 기록 설정. 조각의 축삭 돌기의 optogenetic 자극의 가장 큰 장점은 해당 섬유 책자는 알려져 있지 명확하게 정의되지 않은, 또는에서 보존되지 않은 있기 때문에, 특정 활성화 및 기존의 전기 자?...

시각화 및 뇌 영역 및 신경 세포의 특정 유형과 특정 연결의 동시 활성화를위한 정확한 도구는 기능 연결 기본 건강한 뇌 기능과 질병 상태를 이해하는 데 더 중요 해지고있다. 이상적으로,이 신경 세포 통신 확인되는 정확한 시냅스 속성의 생리 학적 조사를 수반한다. 이는 단일 급성 뇌 조각에 보존 할 수없는 뇌 영역 간의 연결에 특히 사실이다. 과거에는 주로 별도 실험에서 달성되었다. 한편, 신경 추적자 주입 생체 후속 광 또는 사전 및 시냅스 파트너 전자 현미경 분석과 함께 사용되어왔다. 원래 영역에서 섬유 책자가 보존되고, 슬라이스 조제에서 액세스하는 경우 한편, 전기 자극은 대상 영역의 세포와 시냅스 통신 메커니즘을 평가하기 위해 사용되어왔다. 자신의 시각화 및 사후 해부학 적 분석 1을 허용하면서 optogenetics의 출현으로, 같은 형광 단백질에 융합 Channelrhodopsins (CHRS)와 같은 빛 문이 양이온 채널의 대상으로 표현, 지금은 신경과 축삭 궤적의 활성화를 가능하게 4. 섬유 책자가 특정 궤도를 분리하지 않거나 때문에, 1) 기존의 전기 자극에 액세스 할 수 없다는 뇌 영역에서의 입력을 평가 : 부모 인 somata 5에서 절단 할 때 CHR 발현 축색 돌기도 자극 할 수 있기 때문에 뇌 조각에서 가능하다 불명이고; 2) 명백하게 가정하지만 불완전하게 이해하고 특정 입력에 대한 기원의 영역을 식별; 3) 로컬 및 장거리 예측에 정의 된 세포 유형 사이의 기능적 연결을 조사합니다. 이 때문에 다수의 장점의 뇌 슬라이스 회로 optogenetic이 매핑은 전체되었다LY은 지난 몇 년 동안 사용하고, 형광 태그 CHRS의 발현에 대한 바이러스 벡터의 다양한 상용 공급 업체에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 전기 자극은 또한 통로 또는 주변의 다른 세포와 똑같이 신속하고 일시적으로 정확한 자극의 섬유를 보충 할 수 있기 때문에 기존의 전기 자극을 통해 optogenetic 활성화의 일부 주요 장점으로 인해 자극 전극, 섬유 자극의 특이성의 배치로 조직에 손상이 없습니다. 또한, 바이러스 벡터의 정위 주사 용이 Cre 호텔 의존성 발현 및 / 또는 특이 적 프로모터 (7)을 이용하여 달성 될 수있는 특정 뇌 영역 (6) 조건 또는 세포 타입 특이 적 발현을 타겟팅 할 수있다. 여기,이 기술은 두려움 시스템에서 장거리의 매핑 및 로컬 회로에 적용된다. 편도체는 공포와 감정적 인 기억 8,9의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 외에도 이리저리편도을 해요, 내측 전두엽 피질 (mPFC)와 해마 (HC)는 왕복 편도에 연결되어있는 구조는, 공포와 멸종 메모리 10, 11의 수집, 통합 및 검색의 측면에 연루되어있다. mPFC의 하위 활동은 12, 13를 말한다 높고 낮은 두 두려움을 제어 이중 역할을 할 것으로 보인다. 이것은 부분적으로 편도체의 활동과 출력을 제어 할 편도체에 mPFC에서 직접 연결에 의해 매개 될 수있다. 따라서, 최근 몇 년 동안, 여러 연구에서 편도 14-17 mPFC 구심 특정 대상 세포와 시냅스 상호 작용을 조사하기 위해 생체 슬라이스 실험을 시작했다. 공포 학습하는 동안, 에어컨과 무조건 자극에 대한 감각 정보는 특정 시상과 대뇌 피질의 영역에서 전망을 통해 편도에 도달한다. basol의 측면 부분 (LA)에있는 뉴런이 입력의 소성ateral 편도체 (BLA)는 공포 조건화 9,18의 기초가 중요한 메커니즘이다. 증가 증거는 편도에 평행 플라스틱 프로세스가 공포 메모리 (19)를 제어 할 수 저해 요소를 포함 할 것을 제안합니다. 클러스터 억제 뉴런의 그룹은 GABA 성 중간 paracapsular 인터 셀 (mpITCs)하지만 자신의 정확한 연결 및 기능은 불완전 20-22을 알 수있다. 여기에, optogenetic 회로 매핑은 mpITCs가 시상과 대뇌 피질의 중계국 (23)에서 직접 감각 입력을받을 것으로 보여, 구 심성 및 원심성 이러한 세포의 연결 및 편도의 대상 신경 세포에 미치는 영향을 평가하는 데 사용됩니다. mpITCs 또는 BLA 뉴런에 CHR의 특이 적 발현을 효과적으로 BLA 활동을 제어하는​​ 새로운 피드 포워드와 피드백 억제 회로에 배치, mpITCs이 억제 것을 공개, 로컬 상호 작용의 매핑을 할 수 있습니다뿐만 아니라, 상호 BLA 교장 뉴런에 의해 활성화된다23.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td rowspan="2">can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-20938M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)&#160;</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-1-20298P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Recordings, light stimulation, and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>internal patch solutions</td>
			<td>for composition see references #16 and #23</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>P027.1</td>
			<td>prepare 2M stock solution in purified water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicer, Microm HM650V</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>920120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling unit for tissue slicer, CU65</td>
			<td>Fisher Scientific, Germany</td>
			<td>770180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sapphire blade</td>
			<td>Delaware Diamond Knives</td>
			<td></td>
			<td>custom order, inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)</td>
			<td>Lumen Dynamics Group, Canada</td>
			<td>2012-12699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch microscope, BX51WI</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiclamp 700B patch amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitdata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PClamp software, Version 10</td>
			<td>Molecular Devices, USA</td>
			<td></td>
			<td>used to control data acquisition and stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath temperature controler, TC05</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 500 0145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three axis micromanipulator Mini 25</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>210-100 000 0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator controller SM7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann, Germany</td>
			<td>200-100 900 7311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass capillaries for patch pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>GB150F-8P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber&#160;</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>13006--50----ACN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, CoolLED pE</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>244-1400</td>
			<td rowspan="4">CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolLED 100 Dual Adapt</td>
			<td>CoolLED, UK</td>
			<td>pE-ADAPTOR-50E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED unit, USL 70/470</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>L70-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual port adapter</td>
			<td>Rapp Optoelectronic</td>
			<td>inquire with company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set red (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F49-560</td>
			<td rowspan="3">Filters can be bought as set F46-008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F48-585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F47-630</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter set green (excitation)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F39-472</td>
			<td rowspan="3">Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (beamsplitter)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F43-495W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (emission)</td>
			<td>AHF, Germany</td>
			<td>F76-490</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserCheck, handheld power meter</td>
			<td>Coherent, USA</td>
			<td><a>1098293</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgorPro Software, Version 6</td>
			<td>Wavemetrics, USA</td>
			<td></td>
			<td rowspan="2">for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuromatic suite of macros for IgorPro</td>
			<td><a href="http://www.neuromatic.thinkrandom.com/">http://www.neuromatic.thinkrandom.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Post hoc analysis of injections and projections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0335.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar for embedding and resectioning</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5210.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 x 10 mm petri dishes for embedding</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides, Super Frost</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>61303802</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>R. Langenbrinck, Germany</td>
			<td>3000302</td>
			<td>alternatives can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vecta Shield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories, USA</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>alternative mounting media can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation</td>
			<td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td>
			<td>11406--25------N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices

Optogenetic 방법이 널리 빛에 의해 빛 활성화 단백질과 신경 활동의 후속 조작의 대상으로 표현을 결합하여 신경 인구 및 회로의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. Channelrhodopsins (CHRS)는 빛 문이 양이온 채널이며 형광 단백질에 융합 할 때 자신의 표현은 시각화 및 특정 세포 유형의 동시 활성화와 뇌의 정의 된 영역에서의 축삭 돌기 수 있습니다. 바이러스 벡터의 정위 주사 통해 CHR 융합 단백질을 구성 적 또는 조건 적으로 정의 된 뇌 영역의 특정 세포에서 발현 될 수 있고, 자신의 축삭 돌기이어서 뇌 조각의 생체 optogenetic 활성화를 통해 해부학 적 및 기능적으로 연구 될 수있다. 종래의 전기 자극 방법으로 해결 될 수없는 시냅스 연결의 특성을 이해하는 것을 목표로 할 때, 또는 새로운 원숭이를 식별하는데 특히 중요임대 및 이전에 제대로 이해하고 원심성 연결. 여기 몇 가지 예는이 기술이 편도체에 공포 관련 회로를 해명에 이러한 질문을 조사하기 위해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 편도체는 공포와 감정적 인 기억의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 증거의 많은 라인은 내측 전두엽 피질 (mPFC)이 두려움 수집 및 멸종의 다양한 측면에 참여하지만, 편도선과의 정확한 연결은 단지 이해되기 시작하는 것이 좋습니다. 생체 활성화 optogenetic 편도는 기저 (BLA)에 mPFC 구심과 목표 셀 간의 통신 시냅스의 양상을 연구하기 위해 사용하는 방법 먼저, 도시된다. 또한,이 생체 optogenetic 접근법 편도선에 GABA 성 뉴런의 그룹을 사용하여 신규 접속 패턴을 평가하기 위해 적용 할 수있는 방법을 도시하고, 예로서 paracapsular 인터 셀 클러스터 (mpITC).

이 섹션에서는 감각과 조절 성 BLA에 대한 장기 계획과 mpITC 신경 세포뿐만 아니라 mpITC와 BLA 사이의 로컬 연결의 속성의 생리 학적 특성을 조사하기 위해 체외 optogenetic 접근 방법과 다른 실험적인 전략에서 대표적인 결과의 워크 플로우를 보여줍니다. 마우스의 뇌에 원하는 좌표 선택된 바이러스 벡터의 정위 주사 후 <s...

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Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다.

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

15.8K 조회수.  University of Tuebingen.  Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다. 

비디오: Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

연구

신경과학

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

마우스 뇌 슬라이스에 장거리 입력의 광유전학 자극을 위한 Vivo intracerebral 입체 전착성 주사

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect distinct cellular and network components of these circuits remains unclear. Ex vivo brain slices provide a means by which investigators may probe discrete components of complex networks and disentangle potential mechanisms underlying the effects of volatile anesthetics on evoked responses. To isolate potential cell type- and pathway-specific drug effects in brain slices, investigators must be able to independently activate afferent fiber pathways, identify non-overlapping populations of cells, and apply volatile anesthetics to the tissue in aqueous solution. In this protocol, methods to measure optogenetically-evoked responses to two independent afferent pathways to neocortex in ex vivo brain slices are described. Extracellular responses are recorded to assay network activity and targeted whole-cell patch clamp recordings are conducted in somatostatin- and parvalbumin-positive interneurons. Delivery of physiologically relevant concentrations of isoflurane via artificial cerebral spinal fluid to modulate cellular and network responses is described.

Ex vivo brain slices can be used to study the effects of volatile anesthetics on evoked responses to afferent inputs. Optogenetics are employed to independently activate thalamocortical and corticocortical afferents to non-primary neocortex, and synaptic and network responses are modulated with isoflurane.

뇌 조각에서 구 심성 경로의 광유전 적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응의 조절

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice(편도체 뇌 절편에서 신경 경로의 시각화 및 매핑)

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

An Electrophysiological Study of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapses in Mouse Brain Slices

Source: Chen, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59680">Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function.</a> J. Vis. Exp. (2019).
The video describes the electrophysiological recording of retinogeniculate and corticogeniculate synapses in mouse brain slices. The slices containing the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) are placed in a recording chamber. A stimulating pipette is positioned on either the optic tract to stimulate retinal ganglion cells (RGCs) and investigate retinogeniculate synapses or the nucleus reticularis thalami to stimulate cortical neurons and investigate corticogeniculate synapses. Upon stimulation, the RGCs and cortical neurons release excitatory neurotransmitters, which produce synaptic currents in the LGN relay neurons. These currents are recorded using a patch-clamp recording pipette.

쥐 뇌 절편에서 Retinogeniculate 및 Corticogeniculate 시냅스에 대한 전기생리학적 연구

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Solutions

	Dissection solution
	
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Electrophysiology Techniques

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

Source:&#160; Murphy, C. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61333">Optogenetic activation of afferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

뇌 절편에 있는 신경 세포의 동시 광학 및 전기 생리학적 모니터링

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;
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Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

쥐의 뇌에서 기울어진 편도체 조각의 생성

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

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