Name: a magnetic microbead occlusion model to induce ocular hypertension-dependent glaucoma in mice
Uploaded: 2016-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice at JoVE.com

The authors wish to thank Drs. David Calkins (Vanderbilt University) and James Morgan (Cardiff University) for sharing their expertise and for helpful advice towards developing this procedure. This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (A.D.P.). Y.A.I. and N.B. are the recipients of postdoctoral fellowships from the Fonds de recherche du Qu&#233;bec-Sant&#233; (FRQS). N.B. was awarded a H.H. Jasper scholarship from the Groupe de Recherche sur le Syst&#232;me Nerveux Central (GRSNC). A.D.P. is a Chercheur Boursier National FRQS.

Aşağıdaki yordam Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Görme ve Oftalmoloji (ARVO) Araştırma Derneği&#39;nden Oftalmik Hayvanların Kullanımı ve Görsel Araştırma Tablosu Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Anterior İntrakameral Enjeksiyon için Mikroiğnenin 1. Hazırlık <ol><li> Bir çektirmesi ile bir borosilikat cam kapiller bir microneedle oluşturmak </li><li> Mikroskop altında, dikkatle Mikroiğnenin ucunda bir açılış oluşturmak için keskin bir bıçak kullanın. Elde edilen açıklık, sırasıyla, yaklaşık olarak 190 um ve 70 um arasında bir majör ve minör ekseni çapa sahip bir elips şeklinde olması gerekir. görüntü analiz yazılımı kullanılarak ölçümü takiben mikroskop altında yerleştirilen bir cetvel ile ilk satın görüntüleri hazırlanmış microneedle açılış alanını ölçün. </li><li> Mikropipet pah sisteminde, 20 Degre de microneedle yerleştirinağzı açma plakasına e açısı göreli microneedle açılış plaka dokunmadan böylece. Konik kenarları kadar yaklaşık 10 dk düz ve pürüzsüz için. sürecine yardımcı olmak için damıtılmış su bir kaç damla ekleyin. </li><li> ucu keskin kadar açıklığı çevreleyen iki kenarları konik microneedle döndürün. </li><li> bir aerosol silgi kullanarak microneedle ucu açıklığı Temiz tüm enkaz ve su. </li><li> Dikkatle mikroskop altında bitmiş microneedle inceleyin. kırıklı atın microneedles ameliyat sırasında microneedle kırılma riskini en aza indirmek için. </li><li> daha sonra steril dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) ile, etanol ile, birinci durulama ile mikroiğne sterilize edin. </li></ol> Manyetik microbead Çözüm 2. Hazırlık Not: Bu çalışmada kullanılan manyetik mikro-epoksi gruplar ile kaplanır. Bu tür boncuk topaklanma ve istenmeyen moleküler etkileşimler gibi herhangi bir olumsuz etkileri önlemek için, bu epoksi grupları gerekirİlk enjeksiyon cerrahi ile devam etmeden önce mikro-çıkarılmalıdır. <ol><li> Manyetik boncuklardan Epoksi grupların uzaklaştırılması <ol><li> 10x Tris tamponu 0.02 M sodyum hidroksit (NaOH, MW 39,997 g / mol) ihtiva eden bir çözelti (MW 121.14 g / mol) hazırlayın. </li><li> Yavaşça manyetik mikroboncuk çözeltisi stoku vorteks (4.5 mikron çapında, 4 x 10 8 boncuk / mi) boncuk eşit çözeltisi içinde süspansiyon haline kadar devam eder. </li><li> Hızlı bir şekilde 10 x Tris tamponu, 0.02 M NaOH, 50 ml manyetik boncuk çözeltisi 1 mL pipet. </li><li> boncuklardan epoksi gruplarını kaldırmak için oda sıcaklığında 24 saat boyunca döndürün. </li><li> tüpün dibine bir mıknatıs güvence boncuk toplayın. tüm boncuklar mıknatıs çekici olmasını sağlamak için yatay tüp yönlendirmek. Oda sıcaklığında ilave bir 4 saat çevirin. </li><li> Bir mikropipet ile dikkatlice boncuk pelet bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Yavaşça 10x T 50 ml pelet vorteksboncuklar iyi askıya alınır kadar ris tampon. </li><li> Tekrarlayın 2.1.6 için 2.1.4 adımları. </li></ol></li><li> Konsantrasyon ve steril Dengeli Tuz Çözeltisi içinde manyetik mikro boncuklar tabanda </li></ol> Not: 2.4 x 10 6 boncuklar ön odasına enjekte edilir, böylece 1.6 x 10 6 boncuk / ul nihai konsantrasyona ulaşmak için, steril dengelenmiş tuz çözeltisi (BSS) &#39;de manyetik boncuk çözeltisi stoku konsantre için gerekli olan küçük fare göz için uygun olan 1.5 ul, son hacmi. <ol><li> yavaşça, 2 dakika girdap oluşturarak ultra saf laboratuvar sınıfı 5 ml su boncuklar yıkayın. </li><li> Bir mıknatıs ile tüpün dibine onları çekerek boncuk toplayın. </li><li> Bir mikropipet ile dikkatlice boncuk pelet bozmadan su çıkarmak. </li><li> Tekrarlayın 2.2.1 2.2.3 için üç kez daha yineleyin. </li><li> bir laminar akış başlığı içinde, pipettin tarafından BSS 500 ul boncuk yıkayınyukarı ve aşağı g. Laminer akış başlığı içinde steril koşullar altında, bu bölümde kalan adımları. </li><li> Bir mıknatıs ile tüpün dibine onları çekerek boncuk toplayın. </li><li> Bir mikropipet ile dikkatlice boncuk pelet bozmadan BSS çıkarın. </li><li> Tekrarlayın 2.2.5 2.2.7 için üç kez daha yineleyin. </li><li> yukarı ve aşağı BSS 250 ul boncuk pipet ile tekrar süspansiyon. </li><li> boncuk çözüm de homojenize olduğundan emin olun. Daha sonra, hızlı bir şekilde, steril 0.5 ml&#39;lik tüplere süspansiyon 25 ul tablet. Hazır boncuk çözeltisi nihai konsantrasyon 1.6 x 10 6 boncuk / ml. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Oküler Hipertansiyon 3. İndüksiyon Not: Bölüm 3 iki kişilik bir işlemdir. Belirli bir işlem, belirli bir kişi tarafından yapılması gereken bir durumda, uygun bir kişi olarak tanımlanır. Kişi 2 r ise genel olarak, Kişi 1 mikroskop altında fare kollarımikroenjektör pompa işlenmesi için esponsible. cerrahi işlem toplam süresi en az 10 dakika olmalıdır (3.17 ile 3.9 adımlar). <ol><li> yetişkin C57BL / 6 farelerde prosedürleri uygulayın. Yiyecek ve su ad libitum erişimi olan standart bir ortamda Ev fareleri. Bu yazıda, yaş 3 ve 4.5 ay arasında dişi C57BL / 6 fareler kullanın. Bununla birlikte, bu protokol transgenik ve nakavt fareler de dahil olmak üzere erkek ve farklı yaşlardaki farelerde, hem de diğer fare suşları, adapte edilebilir. </li><li> kalibre toparlanma tonometresi kullanılarak önceden anestezi ve microbead enjeksiyon uyanık farelerde bazal göz içi basıncı ölçün. kornea üzerinde proparacaine hidroklorür bir damla uygulayın. <ol><li> Yavaşça kulak arasındaki deriyi tutarak fareyi dizginlemek. hayvan rahat ve gözleri erişilebilir, böylece benchtop fare yerleştirin. kornea yüzeyine dik tonometresi tutun ve bir elde etmek için göze başına on ardışık okumanın en az üç set çekmekGİB&#39;in ortalama. Uyanık farelerde GİB ölçüm GİB üzerine anesteziye bağlı etkileri atlamak için tercih edilir. Seçenek olarak ise, IOP adım 3.4 sonrası Narkoz farelerde ölçülebilir. </li></ol></li><li> 20 mg / ml ketamin, 2 mg / ml ksilazin ve 0.4 mg / ml asepromazin oluşan bir stok fare kokteyli anestezi karışım hazırlayın. </li><li> Kokteyl karışımı (vücut ağırlığının 1 ul / g) periton içine fare anestezi neden. Hayvan bir inhalasyon maskesi bağlı değil olarak fare kafasını işlerken bu esneklik sağlar, çünkü bir enjektabl anestezi kokteyl kullanımı (örneğin, izofluran) gaz anestezikler tercih edilir. Buna ek olarak, bir enjektabl anestezi ile gerekli uzun iyileşme dönemi microbeads ön kamaraya geri yerinden oynatmamaya olmadan iridokorneal açıda yerleşmek sağlar. </li><li> buprenorfin subkutan vücut ağırlığının her kilogramı için 0.05 mg yönetme. </li><li> Bir tropikamid ey ile göz tedavisie öğrenci dilatasyon ikna etmek için bırakın. Nedeniyle fare ön kamaraya küçük boyutu, öğrenci kolayca enjeksiyon sırasında Mikroiğnenin konumlandırma ve ilerleme görselleştirmek için dilate edilmelidir. </li><li> İşlem sırasında korneanın kurumasını önlemek için kontralateral göz (un-işletilen) topikal merhem sürün. </li><li> mikroenjektör pompa enjeksiyon düzeneğine temiz bir microneedle takın. Çapraz hayvan bulaşmayı önlemek için her operasyondan sonra microneedle değiştirin. </li><li> 1. Kişi: işletim platformu için anesteziye fare aktarın. Mikroskop altında, öğrenci tam dilate olduğu ve hiçbir göz hareketi olduğunu bu yüzden göz kaslar gevşer emin olun. göz hareketlerinin yokluğu enjeksiyonu sırasında kararlılığı sağlar. Yavaşça emici bezlerden kullanarak gözünden tropikamid göz damla silin. </li><li> Kişi 2: yukarı ve aşağı pipetleme manyetik microbead çözüm karıştırın. </li><li> mikroenjektör pompası kullanarak hemen MICR yükoneedle homojenize manyetik microbead solüsyonu (2.4 x 10 6 boncuk) 1.5 ul (bölüm 1 hazırlanan). Bu hava kabarcıkları Mikroiğnenin ucundaki yok olduğundan emin olun. Microneedle yüklendikten sonra, yürütmek manyetik microbead çözüm homojen bir süspansiyon içinde kalacak şekilde mümkün olduğunca hızlı 3.12 3.13 için yineleyin. </li><li> limbusa öne göreceli yerleştirilen bir 45 ° &#39;lik açıyla yüklenen microneedle, yerleştirin. 1. Kişi: plastik forseps kullanarak göz destekler. Mikroiğnenin ve plastik forseps arasındaki açı yaklaşık 90 ° olduğundan emin olun. </li><li> Kişi 2: Mikroiğnenin ucu ön odasına girer ve böylece yüklenen microneedle ile hafifçe kornea delinme. Yüklenen Microneedle ponksiyon sırasında limbus bir 45 ° açıda kalmasını sağlamak. lens veya iris ile herhangi bir temastan kaçının. Microneedle arka odasına girmediğinden emin olun. Kişi 1: göz desteklemeye devamplastik forseps kullanarak. </li><li> Kişi 1: Fare hareketli kafa olmaksızın, ön odacık içine manyetik boncuklar çekmek ve kornea iç yüzeyi ile tanelerin temas en aza indirmek için, karşı mikroiğne ucu, göz yanında mıknatıs yerleştirin. Kişi 2: mikroenjektör pompası kullanılarak, ön kamaraya manyetik boncuk çözeltisi 1.5 ul enjekte edilir. mikroboncuk çözelti, 15 ila 30 saniye arasında bir süre boyunca enjekte edilir. 1. Kişi: enjeksiyon tüm süresi boyunca microneedle ucu mıknatıs karşısında tutmaya devam edin. </li><li> Kişi 2: boncuk dolu hacmi enjekte edildikten sonra, yavaş yavaş gözden microneedle çıkarın. Kişi 1: mikro-geri akışını önlemek için, ek bir 30 ila 60 saniye boyunca aşağıdaki göz mıknatıs tutarak ön odanın karşı manyetik boncuklar çekmek için devam etmektedir. </li><li> Kişi 1: mıknatıs kullanarak iridokorneal açıya boncuklar çekmek. Boncuklar bir eşit olarak dağıtılmış bir halka oluşturur emin olunön kamara çevresi. Bu adım sırasında, bu temas üzerine korneanın iç yüzeyine yapışma eğilimi olarak korneada boncukların çeken önlemek. </li><li> enfeksiyon riskini en aza indirmek için bir antibiyotik göz damlası ile çalışan göz davranın. </li><li> Fare (~ 3-4 saat) tamamen uyanık kadar ısı pad üzerinde kurtarmak için izin verin. ameliyat göz yukarı bakacak şekilde fare yerleştirin. Bu konumlandırma çekimi korneanın iç yüzeyine enjekte tanelerin birikmesi önleyecektir. Buna ek olarak, bu konum ameliyat göz bir yatak ve / veya kafes içinde mevcut olabilecek diğer malzemeler ile temas olmayacak şekilde enfeksiyon potansiyelini azaltır. gerektiği gibi bir hayvan sıkıntı belirtisi gösteren durumunda, buprenorfin ek dozları yönetmek. </li><li> Fareler GİB ölçümü almadan önce en az 2 gün prosedürü kurtarmak için izin verin. 3.2 açıklandığı gibi göz içi basıncı ölçün. Monitor GİB&#39;in en az haftada bir kez ya da gerektiği gibi daha sık, ve günün aynı saatinde sirkadiyen ilgili dalgalanmaları en aza indirmek için. </li><li> GİB, bir iç kontrol olarak işletilen fare kontralateral göz kullanın. Alternatif olarak, bozulmamış, olmayan çalışan veya sahte çalışan fareler olarak naif kontrollerden ölçümleri kullanın. </li></ol> 4. Değerlendirme Retina Ganglion Hücre Soma ve Akson Survival <ol><li> Hemen buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit (PFA), ardından 0.1 M fosfat tampon çözeltisi (PBS) intrakardiyak enjeksiyonu ile göz hipertansiyonu tabi fareler serpmek. </li><li> 4.1 anlatıldığı gibi sağlam olmayan çalışan fareler serpmek ve yaralanmamış kontroller olarak kullanın. Ameliyat farelerden kontralateral göz kullanımı yaralanmasını takiben kontralateral göz değişiklikler 15,16 bildirilmiştir ve veri yorumlanmasına neden olabilir, çünkü RGC yaşam değerlendirmek için tavsiye edilmez. Alternatif olarak, kullanım sham operasyonu gözleri 1 ile enjektekontrol grubu olarak BSS 0,5 ul. </li><li> microscissors kullanarak, dikkatli bir şekilde göz soketten izole etmek gözün çevresinde bağ dokusu kesti. optik sinir başının seviyesinde keserek göz optik sinir ayırın. </li><li> 30 G iğne kullanılarak göz içine fiksatif çözüm penetrasyonunu sağlamak için korneada bir delik açın. % 4 PFA göz yerleştirin ve ek tespit için 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> (MW: 214 g / mol),% 2 PFA ve 0.1 M sodyum kakodilat içinde% 2.5 glutaraldehit ihtiva eden bir çözelti içinde, optik sinir yerleştirin ve ek tespit için 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li></ol> 5. RGC Soma Yoğunluk Niceleme Flat monte Retinaları . Aşağıdaki prosedür, Nadal-Nicolas ve ark 17 ile bir protokol uyarlanmıştır ve retina düz bağlar beyin ozel homeoboks / pou domain proteini 3A (Brn3a) karşı bir antikor kullanılarak RGCs miktarının özetlenmektedir: edin. alternatif metEtiketleme RGCs için ODS Fluorogold ya DII ile birden çok ekleme (RBPMS) ya da geriye doğru etiketi ile RNA bağlayıcı proteine ​​karşı bir antikor ile imünohistokimya dahil kullanılabilir. <ol><li> bir mikroskop altında, kornea kolayca ayrılana kadar tüm limbusta boyunca bir kesi yaparak gözün ön kısmını kaldırın. kornea ve lensi çıkarın. Dikkatle ora serrata ve optik sinir boyunca kesim yaparak göz retina ayırın. </li><li> açıkça dört retina kadran tanımlamak için optik sinir doğru retina çevresinden dört küçük eşit kesiler yaparak retina düz montaj hazırlayın. küçük bir fırça kullanarak, yavaşça retina kalan vitrözü çıkarın. mümkün olduğunca vitreus çıkarılması ve temiz bir güçlü bir immünohistokimyasal sinyal elde edilmesi için çok önemlidir. </li><li> Retina, böylece dikkatle PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ihtiva eden bir 48-gözenekli düz tabanlı kültür plakasının retina aktarınserbest yüzen. ganglion hücre tabakası yukarı baktığından emin olun. </li><li> 15 dakika boyunca -70 ° C &#39;de kültür plakasına yerleştirin. PBS taze% 2 Triton X-100 içinde iki kez yıkanarak retina, daha geçirgenliği çözündükten sonra. </li><li> PBS,% 2 Triton X-100 ve% 2 normal eşek serumu içeren 0.5 ml ug / - 0.3 Brn3a antikor seyreltilir. yavaşça 4 ° C&#39;de O / N çalkalanarak Brn3a birincil antibodi çözeltisinin içine retina inkübe edin. retinalar her zaman tamamen çözelti 150 ile 200 ul içinde daldırılmalıdır. </li><li> PBS,% 2 Triton X-100 içeren ml 2 ug / eşek anti-keçi IgG sekonder antikor seyreltilir ve hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 2 saat boyunca bu çözelti içinde retina inkübe edin. Retina tam olarak her zaman bir antikor çözeltisine batırılmış olmalıdır. photobleaching önlemek için kalan adımlar için alüminyum folyo ile kültür plaka örtün. </li><li> Doku pos gibi düz duracak şekilde bir fırça kullanarak, dikkatli bir slayt retina aktarmaksible. 10 dakika boyunca hava kuru. anti-solmaya montaj orta kullanarak monte edin. </li><li> Bir floresan mikroskop altında retina düz bağlar inceleyin. Açıklandığı gibi retina kadran başına üç örtüşmeyen alanlarda Brn3a pozitif RGCs sayısını ölçmek. 18 </li></ol> Optik Sinir Çapraz Bölümleri üzerinde RGC Aksonlar 6. sayısallaştırılması <ol><li> Aşama 4.5 optik disk toplamak ve 2 saat boyunca 2% ozmiyum tetroksit (OSO 4, MW 254,23 g / Mol) inkübe edilir. Dikkat: Yüksek toksisite nedeniyle, osmiyum tetroksit uygun laboratuvar kıyafetleri ile bir davlumbaz ele alınmalıdır. </li><li> Her biri 15 dakika için (% 50,% 70,% 90,% 95 ve% 100) etanol içinde artan konsantrasyonlarda batırılarak optik sinir kurutmak. </li><li> Aşağıdaki tarifi kullanarak epoksi reçine hazırlayın: 15.72 ml Sitene Ekle-812, süksinik anhidrit dodesenil 6.45 ml, 7.83 ml nadik metil anhidrit, 0.45 ml DMP-30. </li><li> Sıralı oluşan çözümlerde optik sinir inkübe0: 1, 1: 1, 0.75: 0.25 ve 1: Aşağıdaki propilen oksit, epoksi reçinesinin oranları (MW 58.08 g / mol) 0. Optik sinir bir O / N süreyle oda sıcaklığında, her çözelti içinde inkübe edilir. </li><li> Ek bir 48 saat boyunca 60 ° C&#39;de% 100 epoksi reçinesi (6.4 son safha) gömülü optik sinirler inkübe edin. </li><li> Bir mikrotom kullanılarak yarı-ince optik sinir kesitleri (0.75 mikron) oluşturun. </li><li> % 1 toluidin mavisi ile optik sinir kesitleri Leke. </li><li> Açıklanan 19 olarak her optik sinir bölümünün beş örtüşmeyen alanlarda RGC aksonlar ölçmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020.">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90, 262-267 (2006).</li><li>Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+glaucoma.">Animal models of glaucoma.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).</li><li>Morrison, J. C., Cepurna Ying Guo, W. O., Johnson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+human+glaucomatous+optic+nerve+damage:+insights+from+rodent+models+of+glaucoma.">Pathophysiology of human glaucomatous optic nerve damage: insights from rodent models of glaucoma.</a> Exp Eye Res. 93, 156-164 (2011).</li><li>Bunker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+glaucoma+induced+by+ocular+injection+of+magnetic+microspheres.">Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+to+experimental+glaucoma+among+3+mouse+strains+using+bead+and+viscoelastic+injection.">Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection.</a> Exp Eye Res. 91, 415-424 (2010).</li><li>Cone, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+anesthesia,+mouse+strain+and+age+on+intraocular+pressure+and+an+improved+murine+model+of+experimental+glaucoma.">The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma.</a> Exp Eye Res. 99, 27-35 (2012).</li><li>El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+patterns+of+dendritic+remodeling+in+early-stage+glaucoma:+evidence+from+genetically+identified+retinal+ganglion+cell+types.">Characteristic patterns of dendritic remodeling in early-stage glaucoma: evidence from genetically identified retinal ganglion cell types.</a> Neuroscience. 35, 2329-2343 (2015).</li><li>Ngumah, Q. C., Buchthal, S. D., Dacheux, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+non-invasive+proton+NMR+spectroscopy+measurement+of+vitreous+lactate+in+a+rabbit+model+of+ocular+hypertension.">Longitudinal non-invasive proton NMR spectroscopy measurement of vitreous lactate in a rabbit model of ocular hypertension.</a> Exp Eye Res. 83, 390-400 (2006).</li><li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres.">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 1671-1675 (2011).</li><li>Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbead+occlusion+model:+a+paradigm+for+induced+ocular+hypertension+in+rats+and+mice.">The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 207-216 (2010).</li><li>Urcola, J. H., Hernandez, M., Vecino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+experimental+glaucoma+models+in+rats:+comparison+of+the+effects+of+intraocular+pressure+elevation+on+retinal+ganglion+cell+size+and+death.">Three experimental glaucoma models in rats: comparison of the effects of intraocular pressure elevation on retinal ganglion cell size and death.</a> Exp Eye Res. 83, 429-437 (2006).</li><li>Weber, A. J., Zelenak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+glaucoma+in+the+primate+induced+by+latex+microspheres.">Experimental glaucoma in the primate induced by latex microspheres.</a> J neuroscience meth. 111, 39-48 (2001).</li><li>Ho, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+aqueous+humor+dynamics+upon+chronic+ocular+hypertension+and+hypotensive+drug+treatment+using+gadolinium-enhanced+MRI.">In vivo assessment of aqueous humor dynamics upon chronic ocular hypertension and hypotensive drug treatment using gadolinium-enhanced MRI.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 3747-3757 (2014).</li><li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbead-induced+ocular+hypertensive+mouse+model+for+screening+and+testing+of+aqueous+production+suppressants+for+glaucoma.">Microbead-induced ocular hypertensive mouse model for screening and testing of aqueous production suppressants for glaucoma.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3733-3741 (2012).</li><li>Gallego, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IOP+induces+upregulation+of+GFAP+and+MHC-II+and+microglia+reactivity+in+mice+retina+contralateral+to+experimental+glaucoma.">IOP induces upregulation of GFAP and MHC-II and microglia reactivity in mice retina contralateral to experimental glaucoma.</a> J neuroinflammation. 9, 92 (2012).</li><li>Rojas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+mouse+retina+contralateral+to+experimental+glaucoma+exhibit+multiple+signs+of+activation+in+all+retinal+layers.">Microglia in mouse retina contralateral to experimental glaucoma exhibit multiple signs of activation in all retinal layers.</a> J neuroinflammation. 11, 133 (2014).</li><li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3860-3868 (2009).</li><li>Morquette, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDD2-mediated+inhibition+of+mTOR+promotes+dendrite+retraction+induced+by+axonal+injury.">REDD2-mediated inhibition of mTOR promotes dendrite retraction induced by axonal injury.</a> Cell Death Differ. 22, 612-625 (2015).</li><li>Almasieh, M., Zhou, Y., Kelly, M. E., Casanova, C., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+neuroprotection+in+glaucoma:+role+of+galantamine-mediated+activation+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">Structural and functional neuroprotection in glaucoma: role of galantamine-mediated activation of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Cell Death Dis. 1, 27 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada sunulan video teknikler etkin ve üretken farelerde GİB yükselmesi ikna etmek için manyetik mikro-boncuk intrakamaral enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği hakkında ayrıntılı adım adım yönergeler sağlar. Ek enjeksiyon gerektirir ve oküler hipertansiyon induction.Elevated GİB ilk 3 hafta içinde saptanabilir RGC soma ve akson kaybı teşvik değil sürekli GİB&#39;in artış Bu prosedür sonuçları, insanlarda glokom gelişimi için önemli bir risk faktörüdür. Bu nedenle, bu geniş bir uygulama aralığı için bir potansiyele sahip değerli murin oküler hipertansiyon bağımlı glokom modelidir. ön odaya mikro-enjeksiyonu ile bağlantılı ortak bir dezavantajı iğnesi geri çekildiğinde, genellikle sulu bir çıkış ve artan değişkenlik ancak kısmen tıkanması ile sonuçlanan, enjeksiyon yeri üzerinden geri akış boncuk ile ilgilidir. Bu sorunu gidermek için, birçok önemli değişiklikler hayata geçirilmiştir. Firs<html> T, bir yontulmuş konik bir temiz ve keskin bir cam Mikroiğnenin dikkatli bir hazırlık mikroboncuk başarılı bir enjeksiyon için gereklidir. Bir düzgün hazırlanmış microneedle narin göz yüzeyine basınç minimal uygulama ile korneanın kontrollü ve düzgün penetrasyonunu sağlar. küçük korneal delinme mikro boncuklar geri akmasını önler. Buna ek olarak, ince microneedle olmayan hastalık ile ilgili inflamasyona neden olabilir örneğin iris ve lens olarak zarar yakındaki yapıların, riskini azaltır. İkincisi, sırasında ve enjeksiyondan sonra stratejik göz alanlarına el mıknatıs uygulaması bu tekniğin bir başka önemli yönüdür. Enjeksiyon sırasında, manyetik mikroiğne geri çekildiğinde mikroboncuk ön kamara önlenmesi geri akış manyetik mikro-boncuklar çekmek için kullanılır. Enjeksiyondan sonra, mıknatıs sonra sulu humor çıkışı engellemek için iridokorneal açıya mikroboncukları yönlendirmek için kullanılır. çadır &quot;&gt; genellikle microbead tıkanıklığı modellerinde karşılaşılan bir başka sorun, tekrarlanan boncuk enjeksiyonları genellikle GİB artışı 10,11. Bu ile zaman. iridokorneal açıdan bir el mıknatıs kombinasyonunu yerinden oynatmamaya mikro boncuklar sonucu olabilir sürekli başarmayı için gerekli olmasıdır yukarıda açıklanan ve fare konumlandırma sonrası operasyon büyük ölçüde sonucu artırır. esneklik uzun bir post-operatif iyileşme sürecini işlemi sırasında kafa taşımak ve ihtiyaç için izin enjektabl anestezik kullanımını olarak, tercih edilir. Yerleştirme ve ameliyat göz ameliyatından sonra birkaç saat için yukarı bakacak şekilde fare iridokorneal açıda mikro-çözümüne katkıda bulunur ve ön kamaraya geri yerinden oynatmamaya riskini azaltır. Enjekte boncuk sayısının nispeten tutarlı sağlanması arası hayvan varyasyonları en aza indirmek için bir başka önemli adımdır. mikroboncuklarının b yerleşmek beriottom borunun, tamamen mikroboncuk çözelti homojen hale getirmek ve zamanında mikroiğne, uygun hacim çekmek için gereklidir. ön kamaraya az boncuk Enjeksiyon kötü veya değişken GİB yol açması muhtemel olan sulu mizah drenaj yapılarının eksik tıkanma, neden olabilir. microbead enjeksiyon nihai amacı göz içi basıncını yükseltmek için olmasına rağmen uyanık farelerden alınan GİB ölçümleri bu çalışmada (~ 25 mmHg) bildirilen tepe değerlerinden daha yüksek olduğunda notun, dikkatli alınmalıdır. Son derece yüksek GİB iskemik hasar riskini arttırır ve aynı zamanda hayvana ağrıya neden olabilir. GİB yükselmesi cerrahinin başarısını değerlendirmek için birçok faktörlerden biri olarak kabul edilmelidir. Bu nedenle, işlemin sonucu GİB artışı, RGC soma ölüm ve akson kaybı dahil olmak üzere birçok parametrelere dayalı teraziye alınmalıdır. Burada açıklanan protokol çoğu microbeads başarılı sonuçlanır rağmenly açıda yerleşen, bu modelin bir potansiyel sınırlama ön kamarada yüzen kalır o boncuk kornea aracılığıyla canlı retina görüntüleme yanı sıra ışığın etkin geçişini gerektiren elektrofizyolojik veya davranışsal deneyleri etkileyebilir olmasıdır. Bu microbead tıkanıklığı modeli kullanan GİB artışı ve sonraki RGC dejenerasyon ölçüde işletilen fare [4] yaş ve genetik arka plan ile değişir olduğunda diğer önemli yönü dikkate. Bu nedenle, GİB yükselmesinin kapsamı ve RGC dejenerasyon zaman çizelgesi her spesifik transgenik fare hattı ve / veya yaş aralığı için tespit edilmesi gerekir. Bu modelin bir özelliği microbead enjeksiyonu ve önemli RGC ölümünden sonra ilk üç haftasında RGC ölüm kademeli kaybı yüksek GİB&#39;in sonuçları işlemden sonra 3 hafta tespit olmasıdır. Bu nedenle, bu model, bu D meydana erken ve / veya hafif değişiklikleri inceleme sağlarhastalığı bulunanlarda, önceki RGC soma ve akson kaybı ile belirgin. RGC ölüm önemli bir artış oküler hipertansiyon indüksiyondan sonra 3 ve 6 hafta arasında gözlenmemiştir. Başarılı rağmen 3 ila 6 hafta arasında% 25 ve bu zaman noktalarında GİB yükselmesi sürekli - Aslında, RGC soma ve akson kaybı ~ 22 sabit kaldı. Sürekli IOP daha uzun süre C57BL Diğer fare suşlarının göre RGC hasara karşı daha dayanıklı olduğu görülmektedir / 6 fareleri, oluşacak ek RGC kaybı için gerekli olabilir. 5 ek değişiklikler burada sunulan protokol, boncuk büyüklüğü ayarlama dahil olmak üzere ve ilave enjeksiyonlar, daha sonra zaman noktalarında RGC kaybı incelemek için gerekli olabilir. Bu nedenle, bizim protokol insan glokom başlangıcı ve erken ilerlemesi alakalı mütevazı RGC nörodejenerasyon ile ilişkili erken patofizyolojik değişikliklere odaklanan çalışmalar için idealdir.

Glokom 2020 1 dünya çapında tahminen 80 milyon insanı etkileyecek ilerici ve geri dönüşümsüz kör bir durumdur. Glokomlu hastalarda, görme kaybı, retina ganglion hücrelerinin (RGCs), görsel bilgi iletimi çıktı nöronları seçici ölüm nedeni beyne retina. Glokom en yaygın yüksek göziçi basıncı (GİB) olduğu birçok risk faktörüne sahip bir yaşa bağlı nörodejeneratif bir hastalıktır. glokom ve güncel tedaviler göz tansiyonu yönetmeye odaklanmak Gerçekten de, GİB&#39;in tek değiştirilebilir risk faktörüdür. Ancak, çoklu genetik hücresel ve çevresel faktörler bu hastalığın başlamasını ve ilerlemesini etkiler. Bu nedenle, nihai olarak, nöronal ölüme katkıda bulunan çeşitli mekanizmaların anlaşılması glokom için etkili bir tedavi geliştirmek için gereklidir. glokom Hayvan modelleri hastalık patofizyolojisini incelemek ve tespit ve test için gerekli olanumut verici terapötik. genetik olarak kodlanmış floresan izleyiciler taşıyan koşullu nakavt suşları ve fareler de dahil olmak üzere transgenik fare hatları artan kullanılabilirliği uyarılabilir fare glokom modelleri için ihtiyaç sürüklemiştir. Glokomun Birkaç kemirgen modelleri (2,3 gözden) yıl boyunca geliştirilmiştir. Bu modellerin birçoğunda, glokom IOP yükselme ile sonuçlanır, sulu humor dinamiklerini bozarak indüklenir. Mikro-ya da diğer maddeler, sulu bir boşalmayı bloke gözün ön odasına enjekte edildiği oklüzyon modelleri, kısmen IOP 4-14 geliştirmek için göreceli kolaylığı için son yıllarda popülerlik kazanmıştır. İlk primatlarda 12&#39;de gerçekleştirilen glokom microbead tıkanması modeli, tavşan 8 ve sıçanlar 4,9,11, farelerde 5,6,10 kullanım için adapte edilmiştir. Bu çalışmalarda, polistiren mikro-boncuk intrakameral enjeksiyon tek başına veyaviskoelastik malzeme ile birlikte, daha sonra RGC ölüm 6,10 giden IOP yükselmesi ile sonuçlanmıştır. Ancak, iğne iridokorneal açıdan mikro-boncuk göz ve çıkartılmasından çekilir geri akış işlemi sırasında ortaya çıkan ortak bir sorun vardır. Bu dezavantajları minimuma indirmek için, mıknatısların göz 4,9 arasında iridokorneal açısına manyetik mikro-boncuklar çekmek için kullanılmaktadır. Burada açıklanan protokol manyetik mikro-boncuklar ve fare göz için uyarlanmış bir el mıknatıs (Şekil 1) kullanan önceki çalışmalar 9,10 göre modifiye edilmiş bir işlemdir. Birkaç önemli değişiklikler farelerde etkili ve tekrarlanabilir GİB artışına sağlamak için protokol girmiştir. İlk olarak, mikro-enjeksiyon bir yontulmuş konik bir özenle hazırlanmış cam microneedle kullanılarak yapılır. Mikroiğnenin Elde edilen düzgün yüzeyler yanı sıra keskin ucu az hasar sağlaro korneayı deler olarak verdirdiler. Microneedle ucu böylece bu iris ve lens olarak zarar yakındaki yapıların riskini azaltır, ön kamara girdiğinde bu cam Mikroiğnenin kullanımı da artan kontrolü ile sonuçlanır. Buna ek olarak, küçük enjeksiyon lezyon kornea kendini onarım kolaylaştırır ve istenmeyen yaralanma ile ilgili etkilerini azaltır. İkinci olarak, manyetik mikro-enjeksiyon ve bir el mıknatıs kullanımı hassas kontrol küçük fare gözünde iridokorneal açıya boncuk çekmek için izin verir. Bu microbead boyutu hazırlanan microneedle açılış tıkayabilir ve önemlisi, bir kez enjekte etmedi çünkü çapı 4,5 mikron kullanılan manyetik mikroboncuklarının, bu microbeads etkin bir sulu mizah drenaj engelledi. Bu yaklaşım, sadece enjekte mikro-geri akışını azaltır, aynı zamanda mikro-maksimum sayısı etkin aköz hümör boşalmayı bloke hedef alan birikir sağlar. furthermore bu strateji aynı zamanda, arka kamara iris ve mercek ve önlenmesi kanalı gibi diğer yapılar ile temas kaçınarak ön kamara yüzen tanelerin sayısını azaltır. Toplu olarak, bu değişiklikler, mikroboncuk enjeksiyon cerrahi göreli kolaylıkla ve farelerde oküler hipertansiyon yüksek, yeniden üretilebilir, etkili ve sürekli bir indüksiyon ile sonuçlanan bir zamanında gerçekleştirilir olduğundan emin olun.

<table><tbody><tr><td>Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Capillary has an outer diameter of 1.5 mm and inner diameter of 1.12 mm</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Zeiss</td><td>MZ9.5</td><td>Zoom factor range of 2.5 to 6.0. Microscope used for needle-making and the micro-bead injection surgery.</td></tr><tr><td>Footswitch</td><td>Linemaster</td><td>T-91-SE</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Blade</td><td>Feather</td><td>No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Science Products</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Duster</td><td>Fisher</td><td>23-022-523</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-450 Epoxy</td><td>Life Technologies</td><td>14011</td><td>Magnetic beads are 4.5 &amp;micro;m in diameter. Stock solution is at a concentration of 4 x 10&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt; beads/ml. Store at 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Mini-Tube Rotators</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td></td></tr><tr><td>3 Handheld Magnets</td><td>Geomag</td><td></td><td>0.45 Tesla. Magnet used for microbead preparation and microbead injection surgery.</td></tr><tr><td>25 ml serological pipet</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Biological Containment Hood</td><td>Biostad</td><td>377355</td><td></td></tr><tr><td>Balanced salt solution (BSS)</td><td>Alcon</td><td>0065-0800-25</td><td></td></tr><tr><td>P1,000 Micropipet</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Microtube 1.5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>P200 Micropipet</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR tube</td><td>Sarstedt</td><td>72737.002</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td></td><td></td><td>Controlled substance</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Vetoquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-100 Insulin Syringe</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Ohaus</td><td>CS 200</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td>Controlled substance</td></tr><tr><td>Tropicamide ophthalmic solution</td><td>Alcon</td><td>0998-0355-15</td><td>1% Mydriacyl</td></tr><tr><td>Manual Microsyringe Pump with Digital Display</td><td>World Precision Instruments</td><td>DMP</td><td></td></tr><tr><td>Manual Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Platform</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-673-52</td><td>8 x 8 inch</td></tr><tr><td>Absorbent swabs</td><td>Kettenbach</td><td>30601</td><td></td></tr><tr><td>P20 Micropipet</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Plastic forcep</td><td>Euroband</td><td>1001</td><td>Ensure forcep is plastic and has a flat surface to avoid damaging the eye</td></tr><tr><td>Fluoroquinolone ophthalmic solution</td><td>Alcon</td><td></td><td>Vigamox</td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-834</td><td></td></tr><tr><td>Tonometer</td><td>iCare</td><td>TV02</td><td>TONOLAB rebound tonometer&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, Para</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small brush</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate, tryhydrate</td><td>Canemco and Marivec</td><td>124-65-2</td><td></td></tr><tr><td>Brn-3a antibody (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-31984</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plate, 48 well</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Slow fade Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5E</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide 2% aqueous solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>3294949</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenyl succinic anhydride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>Nadic methyl anhydride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Embedding mold-Dykstra</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Porter-Blum ultra-microtome</td><td>Sorvall</td><td>MT-2</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blue O (Certified Biological Stain)</td><td>Fisher-Scientific</td><td>T161-25</td><td></td></tr></tbody></table>

a magnetic microbead occlusion model to induce ocular hypertension-dependent glaucoma in mice

glokom kemirgen modellerinde kullanılması bu çok faktörlü nörodejeneratif hastalıkların patofizyolojisinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için gerekli olmuştur. çok sayıda transgenik fare hatları ile birlikte, oküler hipertansiyon uyanlabilir murin modellerinde artan bir ilgi vardır. Burada, bir yontulmuş konik olarak değiştirilmiş bir mikroiğne ile gözün ön odasına manyetik mikro boncuklar enjeksiyonu göre glokom bir tıkayıcı bir model sunmaktadır. Manyetik mikroboncuklarının ön kamaraya sulu mizah drenaj engellemek için bir el mıknatıs kullanarak iridokorneal açısına çekti. İnsan glokom hastalarında gözlendiği gibi sonradan, retina ganglion hücrelerinin kaybına yol açar göz içi basıncı, sürekli bir yükselme sulu dinamikleri sonuçlarında Bu bozulma. Bu yazıda sunulan microbead oklüzyon modeli aynı zamanda son derece diğer uyarılabilir glokomun modelleri ve basit karşılaştırıldığındaetkili ve yeniden üretilebilir. Önemlisi, burada sunulan değişiklikler genellikle tıkanıklığı modellerinde ortaya çıkan yaygın sorunları en aza indirmek. İlk olarak, kesik cam Mikroiğnenin kullanımı mikro-boncuk geri akışını engeller ve en az bir hasar, böylece yaralanmaya bağlı etkilerinin azaltılması, enjeksiyon sırasında korneaya oluşmasını temin eder. İkinci olarak, manyetik mikro boncuklar kullanımı etkili diğer yapılarla temas kaçınarak ön kamara yüzen boncuklar (örneğin., Iris, lens) sayısının azaltılması, iridokorneal açısı en boncuklar çekmek yeteneği sağlamaktadır. etkin bir şekilde, manyetik mikro-boncuklar yönlendirmek ve mikroiğne geri çekildiğinde göz mikro-küçük geri akış yok olduğundan emin olmak için küçük bir fare göz tutarken Son olarak, bir el mıknatıs kullanılması esneklik sağlar. Özetle, burada sunulan microbead tıkanıklığı fare modeli Glau başlangıcı ve ilerlemesi sırasında meydana gelen nörodejeneratif değişiklikleri incelemek için güçlü bir araştırmacı bir araçtırkoma.

Bu protokol açıklanan erişkin farelerin ön kamaraya manyetik mikro-enjeksiyon GİB sağlam ve tekrarlanabilir yükselmesi ile sonuçlanmıştır. *** P &lt;0.001; Bir hafta işleminden sonra, GİB&#39;in Student t-testi (hipertansif gözünde 19, 10 ± 0.6 mm Hg (ortalama ± SEM), kontralateral gözlerde ortalama başlangıç ​​GİB den ± 0.5 mm Hg artış n = 12, Tablo 1, Şekil 2). IOP bundan sonra kararlı ve en az 6 hafta, bu çalışmada incelenen en uzun zaman noktası için 20 mm Hg ortalama yüksek kaldı. ameliyat sonrası 2, 3 ve 6 hafta sonra mikroboncuk enjekte gözlerde ortalama zirve IOP 25 mm Hg. Tedavi edilen farelerin büyük çoğunluğu bu nedenle bu protokol mikro boncuklar bir ikinci enjeksiyon gerektirmez, sürekli yüksek göz içi basıncı geliştirdi. Bu modelde RGC kaybı zaman seyrini değerlendirmek için, RGC soma vardıİlk Brn3a, bir RGC özgü işaret 17 ile immün sayılabilir. Brn3a-pozitif hücre sayısı, oküler hipertansiyon indüksiyonundan sonra, 1, 2, 3 ve 6 hafta sonra, düz monte retina üzerinde nicelleştirilmiştir. Önemli bir GİB yükselmesi gibi erken 1 olarak hafta microbead enjeksiyonundan sonra tespit edildi rağmen, RGC soma anlamlı kaybı prosedürü (Şekil 3) ilk 2 hafta içinde gözlenmiştir. Önemli RGC ölümü (% 22), ancak, (ortalama 2,430 ± 67 RGCs / mm2 ortalama ± SEM, n = 12) 3 hafta açıktı ve 6 hafta (2.350 ± 74 RGCs / mm2, n = 10) sonrası un çalışan farelerin (3141 ± 49 RGCs / mm2, n = 23) (ANOVA, p &lt;0.001) bozulmamış kontrol gözlere kıyasla oküler hipertansiyon indüksiyon,. RGC akson disfonksiyon ve dejenerasyon glokom bir kardinal özelliğidir. Bu nedenle, aksonal kayıp mikroboncuk enjeksiyonla sonra 3. ve 6. haftalarda incelenmiştirtoluidin mavisi (Şekil 4) ile boyanmış, optik sinir kesitleri RGC akson ölçümü. RGC akson önemli bir zararı (% 25) 3 hafta gözlenmiştir (ortalama ± SEM 28.401 ± 702 aksonlar / sinir, s = 5) ve 6 hafta (29.426 ± 948 aksonlar / sinir, n = 6) mikro-enjekte edildikten sonra (39467 ± 137 akson / sinir n = 4) un çalışan gözlerden sağlam optik sinirlere oranla (ANOVA, p &lt;0.001). Topluca, bu veriler fare ön kamaraya manyetik mikro-enjeksiyon tekrarlanabilir yol açar ve RGC soma ve akson dejenerasyonu ile sonuçlanır GİB yükselmesi sürekli olduğunu göstermektedir. <table><tbody><tr><td colspan="2"> OHT ameliyat sonrası zaman </td><td> N </td><td colspan="3"> GİB&#39;in (mmHg) ortalama ± SEM </td><td colspan="2"> Pik GİB (mmHg) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Karşı </td><td> glakom </td><td> difference </td><td> Karşı </td><td> glakom </td></tr><tr><td colspan="2"> 1 hafta </td><td> 12 </td><td> 10 ± 0.4 </td><td> 19 ± 0.5 </td><td> 9 ± 0.6 </td><td> 12 ± 0.4 </td><td> 22 ± 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 hafta </td><td> 13 </td><td> 11 ± 0.5 </td><td> 20 ± 0.8 </td><td> 9 ± 0.5 </td><td> 12 ± 0.9 </td><td> 25 ± 0.7 </td></tr><tr><td colspan="2"> 3 hafta </td><td> 10 </td><td> 11 ± 0.8 </td><td> 20 ± 0.7 </td><td> 10 ± 0.9 </td><td> 13 ± 0.2 </td><td> 25 ± 0.9 </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 hafta </td><td> 12 </td><td> 12 ± 0.5 </td><td> 20 ± 0.6 </td><td> 9 ± 0.7 </td><td> 13 ± 0.5 </td><td> 24 ± 0.6 </td></tr></tbody></table> Fare Manyetik microbead Occlusi Göz İçi Basıncı Tablo 1. YükseklikModeli. uyanık Kadınlarda C57 BL / 6 fareler, GİB&#39;in kalibre toparlanma tonometresi kullanılarak ölçüldü. Kumandalı gözleri işlemden sonra en az altı hafta boyunca yüksek kaldı bir hafta sonrası cerrahi tespit GİB artış göstermiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig1.jpg" /> Glokom Fare Manyetik microbead Oklüzyon Modeli ilgilendim adımlar Şekil 1. İş Akışı. Öncesinde, sırasında gerçekleştirilen tüm prosedürlerin adım adım anahat ve ameliyat sonrası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53731/53731fig2.jpg" /> Fare Manyetik microbead Oklüzyon Modeli Göz İçi Basıncı Şekil 2. artış. Uyanık olarakdişi C57 BL / 6 fareleri, IOP kalibre edilmiş TONOMETRENİN kullanılarak ölçülmüştür. microbead enjekte gözlerin GİB belirgin bir hafta sonrası cerrahi (ANOVA, p &lt;0.001) yüksek bulundu. IOP önemli ölçüde en az 6 hafta (ANOVA, p &lt;0.001) enjekte edilmiş farelerin diğer göz göreli yüksek kaldı. (Bozulmamış: n = 12; 1 hafta: n = 12, 2 hafta: n = 13, 3 hafta: n = 10, 6 hafta: n = 12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53731/53731fig3.jpg" /> Murin Manyetik microbead occlusion modelde. RGCs Şekil 3. retinal ganglion hücresi ölümü başlatmak için microbead enjeksiyon sonrası 3. ve 6. haftalarda tam kontrol retinaları (A) ve glokomatöz retinalarında Brn3a kullanarak düz monte retina immün ile görselleştirilmiştir(OHT) (B, C). Ölçek çubukları: 20 mikron. (D) Kantitatif analiz prosedürü kontrol gözlere kıyasla sonra microbead enjeksiyon 3 ve 6. haftalarda önemli RGC soma kaybına yol açtığını doğruladı. bozulmamış, glokom dışı C57 / BL6 farelerinde RGC soma yoğunluğu referans (beyaz barlar,% 100 hayatta kalma) olarak gösterilmiştir. 2 gün boyunca, n = 6: n = 6, 3 hafta: n = 12, 6 hafta, n = 10, ANOVA, *** p &lt;;: Değerler SEM (Bozulmamış ± ortalamasıdır 1 hafta, n = 23 0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53731/53731fig4.jpg" /> Fare Manyetik microbead Oklüzyon Modeli. RGC akson Şekil 4. Aksonal Dejenerasyon toluidin mavisi ile optik sinir kesitleri boyanması ile görüntülendimikroboncuk enjeksiyon sonrası 3. ve 6. haftalarda tam kontrol (A) ve glokomatöz retinaları (OHT) (B, C) ​​ikna etmek için. Ölçek çubukları: 10 mikron. (D) Kantitatif analiz prosedürü kontrol gözlere kıyasla sonra microbead enjeksiyon 3 ve 6. haftalarda önemli RGC akson kaybı ile sonuçlanan doğruladı. bozulmamış, glokom dışı C57 / BL6 farelerinde RGC akson yoğunluğu referans (beyaz barlar,% 100 hayatta kalma) olarak gösterilmiştir. Değerler ortalama ± SEM olarak ifade edilir (Bozulmamış: n = 4; 3 hafta: n = 5, 6 hafta: n = 6, ANOVA, *** p &lt;0.001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53731/53731fig4large.jpg" target="_blank">Tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için .</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice at JoVE.com

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

Bir Manyetik microbead Oklüzyon Modeli Farelerde Glokom Oküler Hipertansiyon Bağımlı tetikleyebilecek

Burada, glokom görüldüğü gibi, retinal ganglion hücre kaybına neden murin göz oküler hipertansiyon uyarılması için bir protokol mevcut. Manyetik mikroboncuklarının ön kamaraya enjekte ve sulu mizah çıkışı engellemek için bir mıknatıs kullanarak iridokorneal açı çekti.

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

a-magnetic-microbead-occlusion-model-to-induce-ocular-hypertension

Research

JoVE Journal

Medicine

19.3K Görüntüleme.  CRCHUM and University of Montreal.  Burada, glokom görüldüğü gibi, retinal ganglion hücre kaybına neden murin göz oküler hipertansiyon uyarılması için bir protokol mevcut. Manyetik mikroboncuklarının ön kamaraya enjekte ve sulu mizah çıkışı engellemek için bir mıknatıs kullanarak iridokorneal açı çekti. 

Video: A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are very limited. To meet the need for novel therapeutic approaches, experimental stroke research frequently employs rodent models of focal cerebral ischaemia. Most researchers use permanent or transient occlusion of the middle cerebral artery (MCA) in mice or rats.
Proximal occlusion of the middle cerebral artery (MCA) via the intraluminal suture technique (so called filament or suture model) is probably the most frequently used model in experimental stroke research. The intraluminal MCAO model offers the advantage of inducing reproducible transient or permanent ischaemia of the MCA territory in a relatively non-invasive manner. Intraluminal approaches interrupt the blood flow of the entire territory of this artery. Filament occlusion thus arrests flow proximal to the lenticulo-striate arteries, which supply the basal ganglia. Filament occlusion of the MCA results in reproducible lesions in the cortex and striatum and can be either permanent or transient. In contrast, models inducing distal (to the branching of the lenticulo-striate arteries) MCA occlusion typically spare the striatum and primarily involve the neocortex. In addition these models do require craniectomy. In the model demonstrated in this article, a silicon coated filament is introduced into the common carotid artery and advanced along the internal carotid artery into the Circle of Willis, where it blocks the origin of the middle cerebral artery. In patients, occlusions of the middle cerebral artery are among the most common causes of ischaemic stroke. Since varying ischemic intervals can be chosen freely in this model depending on the time point of reperfusion, ischaemic lesions with varying degrees of severity can be produced. Reperfusion by removal of the occluding filament at least partially models the restoration of blood flow after spontaneous or therapeutic (tPA) lysis of a thromboembolic clot in humans.
In this video we will present the basic technique as well as the major pitfalls and confounders which may limit the predictive value of this model.

Filamentous occlusion of the Middle cerebral artery is a common model for studying ischemic stroke in mice.

Fare Modelleme İnme - Filament Model Orta Serebral Arter Tıkanıklığı

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Tıp

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Görme Kusurları karakterize Kronik Oküler Hipertansiyon bir Lazer-kaynaklı Fare Modeli

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present here a protocol for elevating intraocular pressure (IOP) in the rat, by injecting magnetic microspheres into the anterior chamber of the eye. The use of magnetic particles allows the user to manipulate the beads into the iridocorneal angle, thus providing a very effective blockade of fluid outflow from the trabecular meshwork. This leads to long-lasting IOP rises, and eventually neuronal death in the ganglion cell layer (GCL) as well as optic nerve pathology, as seen in patients with the disease. This method is simple to perform, as it does not require machinery, specialist surgical skills, or many hours of practice to perfect. Furthermore, the pressure elevations are very robust, and reinjection of the magnetic microspheres is not usually required unlike in some other models using plastic beads. Additionally, we believe this method is suitable for adaptation for the mouse eye.

We present a method for inducing elevated intraocular pressure (IOP), by injecting magnetic microspheres into the rat eye, to model glaucoma. This leads to strong pressure rises, and extensive neuronal death. This protocol is easy to perform, does not require repeat injections, and produces stable long-lasting IOP rises.

Deneysel Glokom Manyetik Mikrokürelerin Göz Enjeksiyon Bağlı

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Manken Circumlimbal dikiş sıçanlar ve fareler tarafından indüklenen glokom

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

A Reversible Silicon Oil-Induced Ocular Hypertension Model in Mice

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing stable IOP elevation in mice that mimics the post-operative complication of using silicone oil (SO) as a tamponade agent in human vitreoretinal surgery. In this protocol, SO is injected into the anterior chamber of the mouse eye to block the pupil and prevent inflow of aqueous humor. The posterior chamber accumulates aqueous humor and this in turn increases the IOP of the posterior segment. A single SO injection produces reliable, sufficient, and stable IOP elevation, which induces significant glaucomatous neurodegeneration. This model is a true replicate of secondary glaucoma in the eye clinic. To further mimic the clinical setting, SO can be removed from the anterior chamber to reopen the drainage pathway and allow inflow of aqueous humor, which is drained through the trabecular meshwork (TM) at the angle of the anterior chamber. Because IOP quickly returns to normal, the model can be used to test the effect of lowering IOP on glaucomatous retinal ganglion cells. This method is straightforward, does not require special equipment or repeat procedures, closely simulates clinical situations, and may be applicable to diverse animal species. However, minor modifications may be required.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse eyes by intracameral injection of silicone oil and the procedure for silicone oil removal from the anterior chamber to return elevated intraocular pressure to normal.

Farelerde Geri Dönüşümlü Silikon YağA Bağlı Oküler Hipertansiyon Modeli

Elevated intraocular pressure (IOP) is a well-documented risk factor for glaucoma. Here we describe a novel, effective method for consistently inducing ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Nörobilim

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Lazer yakalama mikrodiseksiyon son derece saf trabeküler Meshwork gen ifade analizi için fare gözlerinden

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Biyoloji

Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction In a Mouse Model

Source: Bunker, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52400">Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized rat undergoes an ocular procedure where magnetic beads are injected into the anterior chamber under a magnetic field to block the iridocorneal angle. This blockage obstructs the trabecular meshwork, preventing aqueous humor drainage and leading to increased intraocular pressure, damaging the retinal ganglion cells and optic nerve. This develops a glaucoma-like condition.

Source: Bunker, S., et al. Experimental glaucoma induced by ocular injection of magnetic microspheres. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, an anesthetized ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Inducing Experimental Glaucoma Induction via Iridocorneal Angle Obstruction with Magnetic Beads

After anesthetizing the rats, apply ocular ointment to the unoperated contralateral eye to keep it moist during anesthesia. Apply 0.5% pro procaine hydrochloride local anesthetic to the operative eye. Next, wash this eye with 5% povidone iodine in water. After 5 minutes, wick off the povidone iodine and wash the eye with 0.9% sterile saline solution.
Keep the eye moist during anesthesia with regular application of sterile saline. Now, place a toroidal magnet around the eye. To minimize the risk of iris trauma and minimize bead loss, orient the needle tangential to the corneal surface as parallel to the iris as possible. Proceed to inject 25 microliters of 30 milligrams per millimeter gamma irradiated magnetic microspheres into the anterior chamber.
Leave the needle in place for one minute post-injection, to ensure that beads settle into the iridocorneal angle to impede aqueous drainage from the trabecular meshwork. Slightly angle the needle a few seconds after the beads have initially settled to allow some leakage of aqueous, and to minimize transient increases in intraocular pressure.
To ensure continued use of the needle in separate procedures, flush the needle with PBS, then 70% ethanol, followed by distilled water. At this stage, if necessary, remove the magnet and use it to draw beads into areas of incomplete coverage. Leave the magnet in place around the eye for a further 10 minutes post-injection, to ensure beads settle well into the iridocorneal angle.