EMS Sağlık (NIH) National Institutes of hibe ile desteklenmiştir [hibe sayısı R01HL120919]; Amerikan Kalp Derneği [hibe sayısı 10SDG4350046]; NIH [hibe sayısı UL1 TR000042] Rochester CTSA ödülü Üniversitesi; ve Aab CVRI gelen başlangıç ​​fonları. MAT Howard Hughes Tıp Enstitüsü Med-içine-Grad Girişimi&#39;nden Tıp ve Diş Hekimliği Rochester Okulu Üniversitesi hibe kısmen desteklenmiştir; ve NIH [hibe sayısı GM068411] bir Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü.

NOT: fare ile tüm deney Rochester Üniversitesi Hayvan Kaynakları Üniversitesi Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi (Şekil 1A) <ol><li> hazırlıklar <ol><li> % 5 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (pen / strep) ile Medium 199 (M199) ilave birincil epikardiyal hücre izolasyonu için 5 mi ortam bir hazırlayın. </li><li> karışımı önceden sıcak ve 100 mi, 37 ° C su banyosu içinde Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS). </li><li> kollajen kaplı bölmeli lamlar 30 dakika süreyle oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. </li><li> slaytı her bir kuyu için 100 ul ortam bir ekleyin ve yavaşça eşit şekilde kaplamak kolajen yüzeyine döner. 8-12 Kuyular için tekrarlayın. Kaplama odaları sonra ortamı çıkarın. </li><li> Kısım 50 mi HBSS her biri iki adet 10 cm2&#39;lik plakalara HBSS önceden ısıtılmıştır. </li></ol></li><li> 11.5 Gün Post Coitum (DPC) Gebe Barajı&#39;ndan Embriyonik Kalpler izole edin.30 <ol><li> intraperitonal enjeksiyon ile 13 mg / ml ketamin / 0.88 mg / 1 x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde mi ksilazin kokteyl, 0.5 ml fare anestezisi. Bir ayak tutam testi kullanılarak uygun anesthetization onaylayın. Nazik tutam fare duyarlı olup olmadığını belirlemek için yeterlidir. Herhangi bir hareket veya pençe çekme hayvan yeterince ameliyat yapmak anestezi olmadığını gösterir. servikal dislokasyon ile euthanize. </li><li> yukarı ventral tarafına bakan fare Lay ve saç kirlenmesini azaltmak için% 70 etanol ile karın püskürtün. </li><li> forseps ile cilt sıkın ve cerrahi makas ile karın bir yan kesi kesti. sıkıca cildi tutun ve sonra baş ve kuyruk doğru yön karşıt olarak ayrı çekin. </li><li> forseps ile periton sıkın ve karın boşluğuna maruz makasla kesti. </li><li> Dikkatle mesometrium boyunca keserek desidua kaldırın. disseke desidua aktarın ilk HBSS önceden ısıtılmış10 cm 2 tabak. </li><li> embriyoları arasında keserek desidua ayırın. </li><li> Bir mikroskop altında önceden ısıtılmış HBSS ile ikinci 10 cm2 plakasına, bir embriyo transfer. Dikkatle sonra embriyoyu başını kesmek, extraembryonic doku ve yumurta sarısı kesesi çıkarın. </li><li> forseps ile göğüs duvarı çimdik ve göğüs boşluğunu açığa orta hatta ayrı doku gözyaşı. </li><li> kalp arkasında forseps yerleştirin. çıkış yolunu tutun ve embriyodan kalbini çekin. hala bağlı ise, kalpten akciğer yolu ve akciğerleri ayırın. </li></ol></li><li> Kollajen kaplı slayt tek bir kuyu kalp aktarın ve (Şekil 1B) o dorsal yüzü aşağıya bakacak şekilde yerleştirin. Her embriyo için adımları tekrarlayın 1.2.7-1.3. </li><li> Bir kez tüm kalpler, tek tek oyuklara transfer edildi, 37 ° C &#39;de 30 dakika boyunca odası slayt inkübe,% 5 CO2 kollajen matris için yeterli yapışmayı sağlamak için. </li><li> dikkatle eklemekHer kalbin etrafında önceden ısıtılmış eksplant orta A 20-50 ul. Önemli: çok hızlı ya da kalp üzerinde bir düzeye orta katmayın aksi kalpler kollajen substrat ayırmak olabilir. </li><li> Kültür yaklaşık 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de kalpler epikardiyal büyümesine izin verilir. Not: çıkıntılar kültür gibi erken 3-4 olarak hr (Şekil 1C) gözlenen ve öncelikle en az mezenkimal hücre kontaminasyonu (Şekil 1D, E) Cobblestoned morfoloji, görüntüleme mezotel hücrelerden oluşur edilebilir. Temsilcisi sonuçları bir kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak elde edildi. </li></ol> Epikardiyal çıkıntılar 2. Genetik Ablasyon ve EMT indüksiyonu Dikkat: onaylı biyogüvenlik kurallarına göre özenle adenovirüsler tutun. <ol><li> 15 ml ortam B Hazırlama bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar ön-sıcak ve (M199,% 1 FBS ve% 1 Pen / Strep ile takviye edilmiş). </li><li> çıkarılmasınınfloxed allel, Cre recombinase ifade adenovirüs 2.5 x 10 4 pfu / ml (Ad / Cre) veya kontrol virüsü ile desteklenmiş eksplant orta B hazırlar. Not: aday genlerin adenoviral aracılı aşırı ifadesi aynı zamanda fonksiyon fenotipleri kazancını değerlendirmek için yapılabilir. Virüs titrleri, son kullanıcı tarafından belirlenmelidir. </li><li> Dikkatle forseps kullanarak akıbet kültürlerden gelen epicardium tükenmiş kalpleri kaldırın. Daha sonra RNA izolasyonu ve gen ekspresyon analizi için -80 ° C&#39;de 1.5 mi, 800 ul Trizol tüpler ve mağaza transfer kalpler. </li><li> kan hücreleri ve aşırı selüler artığın ayrılması için DPBS de her bir yıkama. </li><li> Her bir sonucudur kültürüne 500 ul adenovirüs (ler) ile takviye edilmiş eksplant ortam B ekleyin ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde 24 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> EMT indüksiyonu için, ortamını çıkarın ve yeniden birleştirici transforme edici büyüme faktörü (TGF) ile desteklenmiş 37 ° C eksplant ortamı B -β1 [10 ng / ml] ya da taşıyıcı (4 mm H ile doldurmakydrochloric asit (HCl) içeren 1 mg / ml sığır serumu albümini (BSA)). 37 ° C&#39;de ilave bir 24 saat boyunca kültür eksplantlar,% 5 CO2. Gen / ifadesi analizleri protein ya da daha sonraki protokollerde ayrıntılı olarak immünsitokimya ile devam edin. Not: epikardiyal EMT indüksiyonu 0.5 ng / ml arasında değişen, TGF-ß1 çeşitli konsantrasyonları ile stimüle edilmiş - 10 ng / ml 26,31-33. Ligand daha yüksek konsantrasyonları, TGF-β reseptörlerine spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanabilir. TGF-ß1 konsantrasyonu spesifik deneysel hedefleri yansıtmalıdır. </li></ol> Epikardiyal çıkıntılar 3. Gen İfadesi Analizi <ol><li> Daha önce Trizol (2.2) saklanan Çözülme epicardium tükenmiş kalpler. </li><li> EPDC kültürlerden aspire medya ve DPBS ile iki kez yıkayın. </li><li> kültürleri eksplant 800 ul oda sıcaklığı Trizol ekleyin. </li><li> Oda temperatu 5 dakika boyunca Trizol içinde epicardium-tükenmiş kalpleri ve EPDC kültürleri inkübe<html> yeniden. yukarı pipet ve on kat aşağı parçalanmış örnek homojenize etmek. Not: Kalpler tamamen homojenize için daha fazla pipetleme gerektirebilir. </li><li> 1.5 ml tüplere lizatları aktarın ve üreticinin talimatlarına göre toplam RNA izolasyonu ile devam edin. RNA verimi artırmak için önce yağış 10 ug glikojen ekleyin. Belirli bir eksplant yaklaşık 0.5-1.0 ug RNA verecektir. </li><li> DNaz I ile kirletici DNA çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre 0.5 mikrogram mRNA yazıya ters. </li><li> Yeşil SYBR ve gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) için Tablo 1. Normale mRNA seviyelerini tarif belirteçleri kullanarak epikardiyal eksplantlar ve / veya kantitatif ters transkripsiyon ile EMT indüksiyonu saflığını (qRT) -PCR 34 doğrulayıp kullanarak göreceli ifade hesaplanması 2 - ΔΔCt yöntemi 35. Tipik sonuçlar Şekil 2A&#39;da gösterilmiştir. </li></ol>Epikardiyal çıkıntılar başlığı &quot;&gt; 4. Protein Analizi <ol><li> EPDC kültürlerden aspire medya ve DPBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 10 ul buz soğukluğunda bir protein lizis tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM sodyum klorür, 1 mM etilendiamintetraasetik asit pH 8.0,% 1 Triton X-100, 1 x proteaz inhibitör kokteyli) her bölmeye ekleyin ve odasına slayt yer buz. P200 pipet yaklaşık alt ¼ kesti ve slayt kapalı hücreleri kazımak için kalan parçasını kullanın. Pipet yukarı ve lize epikardiyal hücreleri ve 1.5 ml tüp transfer aşağı. </li><li> 30 saniye ve KAPALI döngüsü ile bir buzlu su banyosu içinde 5 dakika için düşük (160 W) ile lize eksplantlar sonikasyon. </li><li> 10,000 x, 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle santrifüj lizatları. Bir tüpe süpernatantı aktarın ve bir protein tahlili 36 kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Not: Belirli eksplant kadar 1.5 ug toplam protein verecektir. Biz bulduk iki kalpleri havuzu eksplantlar biroyuk başına D Yükleme 2 ug protein düz kas α-aktin (ACTA2) ve GAPDH 9 tespit etmek için yeterlidir. Diğer hedef proteinlerin tespiti, son kullanıcı tarafından belirlenen çok eksplant örnekleri havuzu gerektirebilir. </li></ol> Epikardiyal çıkıntılar 5. İmmünositokimya <ol><li> eksplant kültürlerden ortamı çıkarın ve DPBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Yavaşça sırasıyla o C -20 ° C&#39;de, oda sıcaklığında 5 dakika ya da 10 dakika için eksplantlar her kuyuya% 4 (hacim / hacim) paraformaldehid ve buz soğukluğunda metanol 500 ul ekleyin ve düzeltin. üretici tarafından tavsiye edildiği gibi antikor şartnamesine uygun sabitleyin. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez Fiksatif çıkarın ve DPBS ile de her durulama. </li><li> 5 dakika boyunca DPBS&#39;de% 0.1 500 ul (hac / hac) Triton X-100 hücreleri geçirgenliği. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez geçirimli hale çözeltisi çıkarın ve DPBS ile durulayın. </li><li> Oda temperatu 30 dakika boyunca DPBS içinde% 10 serum ile bloke ediliryeniden. </li><li> üreticinin tavsiyelerine ve son kullanıcı tarafından belirlenen optimum koşullarda başına birincil antikor boyama ile devam edin. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez antikor çözüm çıkarın ve DPBS ile durulayın. </li><li> Uygun bir nükleer boya ile üreticinin talimatlarına ve karşıt başına sekonder antikoru uygulayın. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez antikor çözüm çıkarın ve DPBS ile durulayın. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bölme slayt duvarları kaldırmak ve hücrelere doğrudan sulu montaj orta ekleyin. hücreler üzerinde lamel yerleştirin ve tırnak cilası ile mühür. Ters konfokal tarama mikroskobu kullanarak 2D - Tipik sonuçları Şekil 2B gösterilmiştir. </li></ol> 6. ex vivo kültür deneyi (Şekil 3A) <ol><li> hazırlıklar <ol><li> Hazırlama 12 mi EX kullanılarak kültür ortamı in vivo: Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) (1 1) karışımı: M199,% 10 ile takviye edilmişFBS ve% 1 Pen / Strep. </li><li> 37 ° C su banyosu içinde ön-sıcak ex vivo kültür ortamı ve 100 ml HBSS. </li><li> Kısım 1 mi 24 plaka 8-12 kuyu içine orta ısıtılmış ön. </li><li> Başına 50 mi, her biri, iki adet 10 cm2&#39;lik plakalara HBSS önceden ısıtılmıştır. </li></ol></li><li> 12.5 DPC&#39;de hamile barajlardan (1.2 anlatıldığı gibi) HBSS fare embriyonik kalpleri izole edin. </li><li> Ex vivo kültür ortamı içeren 24 çukurlu bir levhanın tek bir kuyusuna Her kalp aktarın. 37 ° C&#39;de, hafif bir el sallanan ve yapışmasını engellemek için bir sallanan platform kullanılarak,% 5 CO2 inkübe plakası. Hemen 7.1 adıma geçin. </li></ol> 7. Ex Vivo Kültürleri Epikardiyal Etiketleme ve EMT İndüksiyon <ol><li> , Epikardiyumu etiket Reklam / GFP 3.0 x 10 6 pfu / ml ile desteklenmiş 37 ° C ex vivo kültür ortamı 12 ml hazırlamak. floxed alellerin hedeflenen ablasyon, A transferi 6 ml içind / GFP yeni bir 15 ml konik tüp kültür ortamı desteklenmiştir. Reklam / Cre ekleme veya 1.5 x 10 6 pfu / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar adenovirüs kontrol eder. Not: fonksiyon kazancı, aynı zamanda, uygun bir adenoviral aracılığıyla gen teslimi ile gerçekleştirilebilir analizleri. </li><li> Dikkatlice P1,000 pipet kullanılarak 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna kültür ortamının çıkarın. </li><li> Yavaşça her oyuğa adenovirüs (ES) ile takviye edilmiş kültür ortamı ilave edin. </li><li> Hafifçe çalkalanarak 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe plakası. </li><li> EMT indüksiyonu için, 37 ° C, ex vivo 10 ng / ml TGF-ß1 ve 20 ng / ml trombosit türevi büyüme faktörü (PDGF) -BB veya aracına ihtiva eden kültür ortamı (4 mM HCI ihtiva eden 1 mg / ml BSA 12 mi hazırlanması ). </li><li> Dikkatlice P1,000 pipet kullanılarak 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna kültür ortamının çıkarın. Yavaşça 1 ml DPBS kalpleri durulayın. </li><li> DPBS kaldırmak ve ex vivo kültür kalpleri doldurmak banaTGF-ß1 ve PDGF-BB veya araç içeren dium. </li><li> Hafifçe çalkalanarak 37 ° C&#39;de 24 saat,% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> 8. Soğukta Saklama ve İmmünohistokimya Ex Vivo Kültürlerin <ol><li> Kiropresarvasyon için Kalpler hazırlayın. <ol><li> Kültür Ortamı çıkarın ve buz-soğuğu DPBS ile iki kez kalpleri yıkayın. </li><li> Her bir kalp% 4 (hacim / hacim) paraformaldehit 1 ml ilave edilir ve hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de 2 saat süre ile düzeltin. </li><li> Fiksatif çıkarın ve DPBS ile iki kez kalpleri yıkayın. 1 mi,% 10 DPBS hazırlandı (ağırlık / hacim) sukroz ile taze oyuklara kalpleri aktarın. hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de bir gece boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> Dikkatle% 18 DPBS hazırlandı (ağırlık / hacim) sukroz ile yeni kuyu kalpleri aktarın. hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de bir gece boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> Doku donma orta içeren bir cryomold her kalbi aktarın. Hemen -80 &amp; # sıvı azot ve mağaza kullanarak blokları dondurmak176 ° C. </li></ol></li><li> Pozitif yüklü mikroskop lamı üzerine Kriyostaz ve yer doku bölümleri kullanılarak 5 mikron de bölüm kalpler. Mağaza boyama kadar -80 ° C &#39;de kayar. </li><li> alt epikardiyal bazal membran tespiti için bölümlerinde immünohistokimya gerçekleştirin. <ol><li> Oda sıcaklığında, en az 30 dakika boyunca slaytlar çözülme. </li><li> hafifçe çalkalanarak 5 dakika boyunca DPBS içinde iki kez yıkanarak bölümleri rehidrate. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 (h / h) Triton X-100 ile birlikte Permeabilize bölümü. </li><li> hafifçe çalkalanarak 5 dakika boyunca DPBS içinde iki kez slaytlar yıkayın. </li><li> Fazla DPBS kapalı leke ve bir hidrofobik etiketleme kalemle boyama bölgeyi tanımlamak. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DPBS içinde% 10 serum ile blok bölümleri. </li><li> blok içinde seyreltilmiş kolajen tip IV antikoru (200 ColIV, 1) blok çıkarın ve uygulanır. nem kontrollü bir odacıkta 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> için DPBS slaytlar üç kez yıkayınhafifçe çalkalanarak 5 dak. </li><li> DPBS ve slaytlar için geçerlidir: ve DAPI (5.000: 1) floresan konjuge sekonder antikor (500 1) seyreltin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. GFP farklı emisyon ve uyarım dalga boyu ile uygun bir ikincil antikor seçin. </li><li> hafifçe çalkalanarak 5 dakika boyunca PBS içinde kayan üç kez yıkayın. Montaj orta montaj slaytlar. </li></ol></li></ol> 9. Görüntüleme ve Niceleme Ex Vivo Kültürlerin <ol><li> bir kör kullanıcı imaja sahip ve lekeli bölümleri ölçmek. epikardiyumun (kalbin kenar) 40X büyütme floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak boyunca 4-5 keyfi yerlerde belirli bir kalp Image en az beş ardışık olmayan doku bölümleri. Tipik sonuçlar ters konfokal tarama mikroskobu kullanılarak Şekil 3B gösterilmiştir. </li><li> El ile belirli bir görüntüde GFP pozitif hücrelerin toplam sayısını. GFP po olarak EPDC göç tespitiçinde veya ColIV subepikardiyal bazal membran dışında bulunan, pozitif hücreler. GFP, belirli bir görüntüde GFP pozitif hücrelerin toplam sayısı üzerinden GFP pozitif hücrelerin göç sayısı gibi hücrelerin göç yüzde belirleyin. Tipik sonuçlar ters konfokal tarama mikroskobu kullanarak Şekil 3C-D gösterilmiştir. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada akıbet birincil epikardiyal hücreyi izole etmek ve ex vivo kalp kültürlerinde EPDC göç izlemek için ayrıntılı yöntemler özetlemektedir. akıbet kültürler için, epicardium tükenmiş kalp kaldırmak için uygun zaman deneyler arasında biraz değişir. bir gecede inkübasyon sonrasında eksplant periyodik izleme epikardiyal akıbet kapsamını ölçmek için ve fibroblastlar görünmeden önce kalbini çıkarmak için tavsiye edilir. saflık sağlamak için, kalpleri olmayan epikardiyal soy...

epicardium mezotel hücreleri tek bir tabaka olduğunu çizgiler kalp ve etkileri kalp gelişme, olgunlaşma ve onarım. Parakrin sinyaller son derece koordineli alışverişi yoluyla, myokard ve endokard arasındaki yakın diyalog kalp büyümesi ve non-miyosit kalp soy 1 oluşumu için vazgeçilmezdir. Epikardiyal türetilmiş hücreler (EPDC) epitelyal-to-mezenkimal geçiş (EMT) 2 ile epikardiyal hücrelerinin bir alt kümesi ile ilgili ortaya, subepikardiyal alanı ve temel miyokard işgal, ve büyük ölçüde, koroner vasküler duvar hücreleri ve kalp fibroblastlannın içine ayırt, ve a daha az bir ölçüde, endotelyal hücreler ve kardiyomiyositlerde 3-9. Epikardiyal EMT ve EPDC istilası düzenleyen mekanizmaların salgı 10-13 hücre yüzeyi reseptörlerinin ve yapışma moleküllerinin 14,15, dede de dahil olmak üzere, çeşitli moleküllerin koordine hareket bağlanmıştırapikal-bazal polarite 16,17, küçük GTPases 18,19 ve transkripsiyon lators 2,20,21 faktörleri. EPDC göç moleküler efektör birçok tanımlanmış olmasına rağmen, stratejilerin gelişimini hızlandırmak olabilir embriyoda EPDC seferberlik teşvik fizyolojik sinyallerin daha iyi anlaşılması gelişmiş kardiyak onarım için yetişkin bu süreci manipüle etmek. EPDC seferberlik yeni regülatörleri tespit etmeyi amaçlayan çalışmalar bu hücre popülasyonunun saflaştırılması veya bireysel epikardiyal hücrelerin göçünü izleme güveniyor. Bir veya WT1, Tcf21, Tbx18 ve / veya Aldh1a2 içeren işaretçi genler, bir arada, yaygın olarak fetal epikardiyumu 1 tanımlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu markerlerin kullanımı epikardiyal hücreleri transdif getirildiğinde epikardiyal markerlerin sentezlenmesi kalp gelişimi boyunca azalıyor ve genellikle kaybedilir EPDC optimal değildir göç izlemekmezenkimal hücreler içine ferentiation. Cre / loxP sisteminin uygulanması, soy-izleme muhabirleri ile birlikte, kalıcı kalp gelişimi sırasında epikardiyumu ve kökenini etiketleme ve yetişkin 7,22,23 iskemik yaralanma aşağıdaki yararlı olmuştur. Çeşitli epikardiyal kısıtlı Cre hatları üretildiğini ve yaygın EPDC etiket ve koşullu gen silme stratejileri 1 için kullanılır. Bu çalışmalar çeşitli epikardiyal soylarının karakterizasyonu ve EPDC motilite ve farklılaşmasının önemli aracılar belirlenmesine yol açmıştır. Ancak, biriken kanıtlar da epicardium progenitör hücrelerin 4,24,25 heterojen bir nüfusu olduğunu göstermektedir. Böylece, epikardiyal hücrelerin sadece bir alt kümesi verilen Cre sürücüsü kullanılarak hedef olacaktır. ne olursa olsun Cre özgüllük tüm epikardiyumu etiketlemek için, laboratuvarların sayısı akıbet cul kullanmış olmasıTure sistemleri veya ex vivo organ kültürü yöntemleri sadakatle izole veya 26-28 işaretleme kalemler genetik soy ifadesi bağlı olmaksızın epikardiyal hücreleri etiketlemek için. Ex vivo olarak taşıma çalışmaları için, oluşum safhasındaki kalpler epikardiyal EMT önce ve yeşil flüoresan proteini (GFP) -expressing adenovirüs (Ad / GFP) 9,18 ile takviye edilmiş ortam içinde kültürlendi izole edilir. Bu yaklaşım verimli, tüm epikardiyumun etiketleme ziyade Cre-aracılı rekombinasyon ile hücrelerin bir alt kümesi için izin verir. Kalp kültürler sonradan EPDC 28,29 seferber uyardığı EMT bilinen indükleyicileri maruz kalmaktadır. Ex vivo ve in vivo analizler EPDC göç sürüş detaylı mekanizmaları keşfetmek için özellikle yararlı bir yaklaşım olan in vitro epikardiyal eksplant kültürler tarafından tamamlanmaktadır. Burada, epicardi in vitro çalışmalar için, birincil epikardiyal hücrelerin izole edilmesine yönelik yöntemleri tarif ederal EMT, hem de ex vivo olarak bir organ kültür sisteminde EPDC motilite analiz eder. Biz son zamanlarda genetik EPDC 9 aktin tabanlı göç işlemek için eksen sinyal myocardin ilgili transkripsiyon faktörü (MRTF) / serum yanıt faktörü (BAV) modülasyonu ile bu yöntemin yararını ve sağlamlığı olduğunu göstermiştir. Bulgularımız EPDC taşıma düzenleyen için gerekli bir sinyal yolunu vurgulamak da, bu yöntemler kolektif EPDC göç ve farklılaşma orkestra mekanizmaları çözülmesi için uygundur. Ayrıca, eksplant ve ex vivo kültür sistemleri kalp rejenerasyon terapötik uygulamalar için EPDC harekete yeni düzenleyici ortaya koymak için fonksiyonel ekranlarında uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone&#160;</td>
			<td style="width:141px;">SH3002201</td>
			<td style="width:203px;">DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3003102</td>
			<td style="width:203px;">HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Medium 199</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3025301</td>
			<td style="width:203px;">M199</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3002802</td>
			<td style="width:203px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gemini&#160;</td>
			<td style="width:141px;">100-106</td>
			<td style="width:203px;">FBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SV30010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:141px;">354557</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Multiwell 24-well plates</td>
			<td style="width:163px;">Falcon</td>
			<td style="width:141px;">08-772-1</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">M50</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with Leica KL300 LED might source</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:244px;">Confocal miscroscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">1X81</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bioruptor</td>
			<td style="width:163px;">Diagenode&#160;</td>
			<td style="width:141px;">UCD-200</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Transforming growth factor beta 1</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">100-B-001</td>
			<td style="width:203px;">TGF-&#946;1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Platelet-derived growth factor BB</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">220-BB-010</td>
			<td style="width:203px;">PDGF-BB</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Trizol Reagent</td>
			<td style="width:163px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:141px;">15596-026</td>
			<td style="width:203px;">Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">AM1907</td>
			<td style="width:203px;">DNaseI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">1708891</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">10814-010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">170-8880</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protease inhibtor cocktail tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:141px;">11836170001</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat-anti-rabbit 488</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A11008</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-rabbit 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11012</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-mouse 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11005</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">C6198</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>MA1-46028</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 6F-H2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-ZO1</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>40-2200</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-Collagen Type 4</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB756P</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">D1306</td>
			<td style="width:203px;">DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fluorescent mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S3023</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">16% Paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:163px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">15710</td>
			<td style="width:203px;">PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">S0389</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:163px;">Triangle Biomedical Sciences</td>
			<td style="width:141px;">TFM-B</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Pap pen</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S2002</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable mictrotome blades&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:141px;">4689</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:163px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:141px;">1358W</td>
			<td style="width:203px;">positively charged, 25 x 75 x 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">CM1950</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Forceps</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">11295-00</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable base molds</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">22-363-553</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ketamine</td>
			<td style="width:163px;">Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Xylazine</td>
			<td style="width:163px;">Akorn</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

epikardiyal hücreleri hatları bir tek katmanlı kalp, kardiyomiyosit çoğalmasını teşvik parakrin faktörler sağlanması ve gelişiminin doğrudan ve hastalık sırasında kardiyovasküler atalarıdır katkıda bulunmaktadır. bir dizi faktör epicardium-kaynaklı hücre (EPDC) harekete karışmış olsa da, bunların daha sonraki göç ve farklılaşmayı düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, EPDC motilite ve farklılaşma çalışma vitro ve ex vivo stratejileri sunuyoruz. İlk olarak, embriyonik fare kalp sonucudur kültürü birincil epikardiyal hücreleri elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bir organ kültür sisteminde etiketli EPDC, üç boyutlu taşıma değerlendirmek için detaylı bir protokol getirmektedir. Biz epicardium içinde myocardin ilgili transkripsiyon faktörlerinin genetik silme EPDC göç zayıflatan bu teknikleri kullanarak kanıtlar sunmaktadır. Bu yaklaşım EPDC aday değiştiricileri değerlendirmek için bir platform olarak hizmet vermektedirbiyoloji ve kardiyak onarım için yararlı olabilir EPDC harekete yeni düzenleyici belirlemek için genetik veya kimyasal ekranlar geliştirmek için kullanılabilir.

epicardium verimli onun dış konumu yararlanarak ve gelişimsel plastisite ve EPDC içsel göç davranışı istismar ederek bir sonucudur kültür testi kullanılarak izole edilebilir. Fare embriyonik kalpleri önce aşağı kollajen kaplı odasına slaytlar epikardiyal EMT ve kültürlü dorsal tarafına E11.5 izole edilmiştir 26 (Şekil 1A, B). Eksplante kalpleri sözleşme devam edecek; Ancak, epicardium kollajen matriks uymak ve kültür 24 saat <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration at JoVE.com

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

epicardial-outgrowth-culture-assay-ex-vivo-assessment-epicardial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K Görüntüleme.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

Video: Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Gelişim Biyolojisi

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Bir Klinik İlgili kurulması<em&gt; Ex Vivo</emYerli mikroçevresinin Epitelyal Yara Tamir incelenmesi için&gt; Mock Katarakt Cerrahisi Modeli

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Rodent placenta 'nın ex vivo perfüzyon

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...