Name: epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration
Uploaded: 2016-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration at JoVE.com

EMS Sağlık (NIH) National Institutes of hibe ile desteklenmiştir [hibe sayısı R01HL120919]; Amerikan Kalp Derneği [hibe sayısı 10SDG4350046]; NIH [hibe sayısı UL1 TR000042] Rochester CTSA ödülü Üniversitesi; ve Aab CVRI gelen başlangıç ​​fonları. MAT Howard Hughes Tıp Enstitüsü Med-içine-Grad Girişimi&#39;nden Tıp ve Diş Hekimliği Rochester Okulu Üniversitesi hibe kısmen desteklenmiştir; ve NIH [hibe sayısı GM068411] bir Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü.

NOT: fare ile tüm deney Rochester Üniversitesi Hayvan Kaynakları Üniversitesi Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi (Şekil 1A) <ol><li> hazırlıklar <ol><li> % 5 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (pen / strep) ile Medium 199 (M199) ilave birincil epikardiyal hücre izolasyonu için 5 mi ortam bir hazırlayın. </li><li> karışımı önceden sıcak ve 100 mi, 37 ° C su banyosu içinde Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS). </li><li> kollajen kaplı bölmeli lamlar 30 dakika süreyle oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. </li><li> slaytı her bir kuyu için 100 ul ortam bir ekleyin ve yavaşça eşit şekilde kaplamak kolajen yüzeyine döner. 8-12 Kuyular için tekrarlayın. Kaplama odaları sonra ortamı çıkarın. </li><li> Kısım 50 mi HBSS her biri iki adet 10 cm2&#39;lik plakalara HBSS önceden ısıtılmıştır. </li></ol></li><li> 11.5 Gün Post Coitum (DPC) Gebe Barajı&#39;ndan Embriyonik Kalpler izole edin.30 <ol><li> intraperitonal enjeksiyon ile 13 mg / ml ketamin / 0.88 mg / 1 x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde mi ksilazin kokteyl, 0.5 ml fare anestezisi. Bir ayak tutam testi kullanılarak uygun anesthetization onaylayın. Nazik tutam fare duyarlı olup olmadığını belirlemek için yeterlidir. Herhangi bir hareket veya pençe çekme hayvan yeterince ameliyat yapmak anestezi olmadığını gösterir. servikal dislokasyon ile euthanize. </li><li> yukarı ventral tarafına bakan fare Lay ve saç kirlenmesini azaltmak için% 70 etanol ile karın püskürtün. </li><li> forseps ile cilt sıkın ve cerrahi makas ile karın bir yan kesi kesti. sıkıca cildi tutun ve sonra baş ve kuyruk doğru yön karşıt olarak ayrı çekin. </li><li> forseps ile periton sıkın ve karın boşluğuna maruz makasla kesti. </li><li> Dikkatle mesometrium boyunca keserek desidua kaldırın. disseke desidua aktarın ilk HBSS önceden ısıtılmış10 cm 2 tabak. </li><li> embriyoları arasında keserek desidua ayırın. </li><li> Bir mikroskop altında önceden ısıtılmış HBSS ile ikinci 10 cm2 plakasına, bir embriyo transfer. Dikkatle sonra embriyoyu başını kesmek, extraembryonic doku ve yumurta sarısı kesesi çıkarın. </li><li> forseps ile göğüs duvarı çimdik ve göğüs boşluğunu açığa orta hatta ayrı doku gözyaşı. </li><li> kalp arkasında forseps yerleştirin. çıkış yolunu tutun ve embriyodan kalbini çekin. hala bağlı ise, kalpten akciğer yolu ve akciğerleri ayırın. </li></ol></li><li> Kollajen kaplı slayt tek bir kuyu kalp aktarın ve (Şekil 1B) o dorsal yüzü aşağıya bakacak şekilde yerleştirin. Her embriyo için adımları tekrarlayın 1.2.7-1.3. </li><li> Bir kez tüm kalpler, tek tek oyuklara transfer edildi, 37 ° C &#39;de 30 dakika boyunca odası slayt inkübe,% 5 CO2 kollajen matris için yeterli yapışmayı sağlamak için. </li><li> dikkatle eklemekHer kalbin etrafında önceden ısıtılmış eksplant orta A 20-50 ul. Önemli: çok hızlı ya da kalp üzerinde bir düzeye orta katmayın aksi kalpler kollajen substrat ayırmak olabilir. </li><li> Kültür yaklaşık 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 de kalpler epikardiyal büyümesine izin verilir. Not: çıkıntılar kültür gibi erken 3-4 olarak hr (Şekil 1C) gözlenen ve öncelikle en az mezenkimal hücre kontaminasyonu (Şekil 1D, E) Cobblestoned morfoloji, görüntüleme mezotel hücrelerden oluşur edilebilir. Temsilcisi sonuçları bir kamera ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak elde edildi. </li></ol> Epikardiyal çıkıntılar 2. Genetik Ablasyon ve EMT indüksiyonu Dikkat: onaylı biyogüvenlik kurallarına göre özenle adenovirüsler tutun. <ol><li> 15 ml ortam B Hazırlama bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar ön-sıcak ve (M199,% 1 FBS ve% 1 Pen / Strep ile takviye edilmiş). </li><li> çıkarılmasınınfloxed allel, Cre recombinase ifade adenovirüs 2.5 x 10 4 pfu / ml (Ad / Cre) veya kontrol virüsü ile desteklenmiş eksplant orta B hazırlar. Not: aday genlerin adenoviral aracılı aşırı ifadesi aynı zamanda fonksiyon fenotipleri kazancını değerlendirmek için yapılabilir. Virüs titrleri, son kullanıcı tarafından belirlenmelidir. </li><li> Dikkatle forseps kullanarak akıbet kültürlerden gelen epicardium tükenmiş kalpleri kaldırın. Daha sonra RNA izolasyonu ve gen ekspresyon analizi için -80 ° C&#39;de 1.5 mi, 800 ul Trizol tüpler ve mağaza transfer kalpler. </li><li> kan hücreleri ve aşırı selüler artığın ayrılması için DPBS de her bir yıkama. </li><li> Her bir sonucudur kültürüne 500 ul adenovirüs (ler) ile takviye edilmiş eksplant ortam B ekleyin ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde 24 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> EMT indüksiyonu için, ortamını çıkarın ve yeniden birleştirici transforme edici büyüme faktörü (TGF) ile desteklenmiş 37 ° C eksplant ortamı B -β1 [10 ng / ml] ya da taşıyıcı (4 mm H ile doldurmakydrochloric asit (HCl) içeren 1 mg / ml sığır serumu albümini (BSA)). 37 ° C&#39;de ilave bir 24 saat boyunca kültür eksplantlar,% 5 CO2. Gen / ifadesi analizleri protein ya da daha sonraki protokollerde ayrıntılı olarak immünsitokimya ile devam edin. Not: epikardiyal EMT indüksiyonu 0.5 ng / ml arasında değişen, TGF-ß1 çeşitli konsantrasyonları ile stimüle edilmiş - 10 ng / ml 26,31-33. Ligand daha yüksek konsantrasyonları, TGF-β reseptörlerine spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanabilir. TGF-ß1 konsantrasyonu spesifik deneysel hedefleri yansıtmalıdır. </li></ol> Epikardiyal çıkıntılar 3. Gen İfadesi Analizi <ol><li> Daha önce Trizol (2.2) saklanan Çözülme epicardium tükenmiş kalpler. </li><li> EPDC kültürlerden aspire medya ve DPBS ile iki kez yıkayın. </li><li> kültürleri eksplant 800 ul oda sıcaklığı Trizol ekleyin. </li><li> Oda temperatu 5 dakika boyunca Trizol içinde epicardium-tükenmiş kalpleri ve EPDC kültürleri inkübe<html> yeniden. yukarı pipet ve on kat aşağı parçalanmış örnek homojenize etmek. Not: Kalpler tamamen homojenize için daha fazla pipetleme gerektirebilir. </li><li> 1.5 ml tüplere lizatları aktarın ve üreticinin talimatlarına göre toplam RNA izolasyonu ile devam edin. RNA verimi artırmak için önce yağış 10 ug glikojen ekleyin. Belirli bir eksplant yaklaşık 0.5-1.0 ug RNA verecektir. </li><li> DNaz I ile kirletici DNA çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre 0.5 mikrogram mRNA yazıya ters. </li><li> Yeşil SYBR ve gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) için Tablo 1. Normale mRNA seviyelerini tarif belirteçleri kullanarak epikardiyal eksplantlar ve / veya kantitatif ters transkripsiyon ile EMT indüksiyonu saflığını (qRT) -PCR 34 doğrulayıp kullanarak göreceli ifade hesaplanması 2 - ΔΔCt yöntemi 35. Tipik sonuçlar Şekil 2A&#39;da gösterilmiştir. </li></ol>Epikardiyal çıkıntılar başlığı &quot;&gt; 4. Protein Analizi <ol><li> EPDC kültürlerden aspire medya ve DPBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 10 ul buz soğukluğunda bir protein lizis tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM sodyum klorür, 1 mM etilendiamintetraasetik asit pH 8.0,% 1 Triton X-100, 1 x proteaz inhibitör kokteyli) her bölmeye ekleyin ve odasına slayt yer buz. P200 pipet yaklaşık alt ¼ kesti ve slayt kapalı hücreleri kazımak için kalan parçasını kullanın. Pipet yukarı ve lize epikardiyal hücreleri ve 1.5 ml tüp transfer aşağı. </li><li> 30 saniye ve KAPALI döngüsü ile bir buzlu su banyosu içinde 5 dakika için düşük (160 W) ile lize eksplantlar sonikasyon. </li><li> 10,000 x, 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle santrifüj lizatları. Bir tüpe süpernatantı aktarın ve bir protein tahlili 36 kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Not: Belirli eksplant kadar 1.5 ug toplam protein verecektir. Biz bulduk iki kalpleri havuzu eksplantlar biroyuk başına D Yükleme 2 ug protein düz kas α-aktin (ACTA2) ve GAPDH 9 tespit etmek için yeterlidir. Diğer hedef proteinlerin tespiti, son kullanıcı tarafından belirlenen çok eksplant örnekleri havuzu gerektirebilir. </li></ol> Epikardiyal çıkıntılar 5. İmmünositokimya <ol><li> eksplant kültürlerden ortamı çıkarın ve DPBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Yavaşça sırasıyla o C -20 ° C&#39;de, oda sıcaklığında 5 dakika ya da 10 dakika için eksplantlar her kuyuya% 4 (hacim / hacim) paraformaldehid ve buz soğukluğunda metanol 500 ul ekleyin ve düzeltin. üretici tarafından tavsiye edildiği gibi antikor şartnamesine uygun sabitleyin. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez Fiksatif çıkarın ve DPBS ile de her durulama. </li><li> 5 dakika boyunca DPBS&#39;de% 0.1 500 ul (hac / hac) Triton X-100 hücreleri geçirgenliği. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez geçirimli hale çözeltisi çıkarın ve DPBS ile durulayın. </li><li> Oda temperatu 30 dakika boyunca DPBS içinde% 10 serum ile bloke ediliryeniden. </li><li> üreticinin tavsiyelerine ve son kullanıcı tarafından belirlenen optimum koşullarda başına birincil antikor boyama ile devam edin. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez antikor çözüm çıkarın ve DPBS ile durulayın. </li><li> Uygun bir nükleer boya ile üreticinin talimatlarına ve karşıt başına sekonder antikoru uygulayın. </li><li> 5 dakika boyunca üç kez antikor çözüm çıkarın ve DPBS ile durulayın. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bölme slayt duvarları kaldırmak ve hücrelere doğrudan sulu montaj orta ekleyin. hücreler üzerinde lamel yerleştirin ve tırnak cilası ile mühür. Ters konfokal tarama mikroskobu kullanarak 2D - Tipik sonuçları Şekil 2B gösterilmiştir. </li></ol> 6. ex vivo kültür deneyi (Şekil 3A) <ol><li> hazırlıklar <ol><li> Hazırlama 12 mi EX kullanılarak kültür ortamı in vivo: Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) (1 1) karışımı: M199,% 10 ile takviye edilmişFBS ve% 1 Pen / Strep. </li><li> 37 ° C su banyosu içinde ön-sıcak ex vivo kültür ortamı ve 100 ml HBSS. </li><li> Kısım 1 mi 24 plaka 8-12 kuyu içine orta ısıtılmış ön. </li><li> Başına 50 mi, her biri, iki adet 10 cm2&#39;lik plakalara HBSS önceden ısıtılmıştır. </li></ol></li><li> 12.5 DPC&#39;de hamile barajlardan (1.2 anlatıldığı gibi) HBSS fare embriyonik kalpleri izole edin. </li><li> Ex vivo kültür ortamı içeren 24 çukurlu bir levhanın tek bir kuyusuna Her kalp aktarın. 37 ° C&#39;de, hafif bir el sallanan ve yapışmasını engellemek için bir sallanan platform kullanılarak,% 5 CO2 inkübe plakası. Hemen 7.1 adıma geçin. </li></ol> 7. Ex Vivo Kültürleri Epikardiyal Etiketleme ve EMT İndüksiyon <ol><li> , Epikardiyumu etiket Reklam / GFP 3.0 x 10 6 pfu / ml ile desteklenmiş 37 ° C ex vivo kültür ortamı 12 ml hazırlamak. floxed alellerin hedeflenen ablasyon, A transferi 6 ml içind / GFP yeni bir 15 ml konik tüp kültür ortamı desteklenmiştir. Reklam / Cre ekleme veya 1.5 x 10 6 pfu / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar adenovirüs kontrol eder. Not: fonksiyon kazancı, aynı zamanda, uygun bir adenoviral aracılığıyla gen teslimi ile gerçekleştirilebilir analizleri. </li><li> Dikkatlice P1,000 pipet kullanılarak 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna kültür ortamının çıkarın. </li><li> Yavaşça her oyuğa adenovirüs (ES) ile takviye edilmiş kültür ortamı ilave edin. </li><li> Hafifçe çalkalanarak 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe plakası. </li><li> EMT indüksiyonu için, 37 ° C, ex vivo 10 ng / ml TGF-ß1 ve 20 ng / ml trombosit türevi büyüme faktörü (PDGF) -BB veya aracına ihtiva eden kültür ortamı (4 mM HCI ihtiva eden 1 mg / ml BSA 12 mi hazırlanması ). </li><li> Dikkatlice P1,000 pipet kullanılarak 24 çukurlu bir levhanın her çukuruna kültür ortamının çıkarın. Yavaşça 1 ml DPBS kalpleri durulayın. </li><li> DPBS kaldırmak ve ex vivo kültür kalpleri doldurmak banaTGF-ß1 ve PDGF-BB veya araç içeren dium. </li><li> Hafifçe çalkalanarak 37 ° C&#39;de 24 saat,% 5 CO2 inkübe edin. </li></ol> 8. Soğukta Saklama ve İmmünohistokimya Ex Vivo Kültürlerin <ol><li> Kiropresarvasyon için Kalpler hazırlayın. <ol><li> Kültür Ortamı çıkarın ve buz-soğuğu DPBS ile iki kez kalpleri yıkayın. </li><li> Her bir kalp% 4 (hacim / hacim) paraformaldehit 1 ml ilave edilir ve hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de 2 saat süre ile düzeltin. </li><li> Fiksatif çıkarın ve DPBS ile iki kez kalpleri yıkayın. 1 mi,% 10 DPBS hazırlandı (ağırlık / hacim) sukroz ile taze oyuklara kalpleri aktarın. hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de bir gece boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> Dikkatle% 18 DPBS hazırlandı (ağırlık / hacim) sukroz ile yeni kuyu kalpleri aktarın. hafifçe çalkalanarak 4 ^ &#39;de bir gece boyunca inkübasyona bırakılır. </li><li> Doku donma orta içeren bir cryomold her kalbi aktarın. Hemen -80 &amp; # sıvı azot ve mağaza kullanarak blokları dondurmak176 ° C. </li></ol></li><li> Pozitif yüklü mikroskop lamı üzerine Kriyostaz ve yer doku bölümleri kullanılarak 5 mikron de bölüm kalpler. Mağaza boyama kadar -80 ° C &#39;de kayar. </li><li> alt epikardiyal bazal membran tespiti için bölümlerinde immünohistokimya gerçekleştirin. <ol><li> Oda sıcaklığında, en az 30 dakika boyunca slaytlar çözülme. </li><li> hafifçe çalkalanarak 5 dakika boyunca DPBS içinde iki kez yıkanarak bölümleri rehidrate. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 (h / h) Triton X-100 ile birlikte Permeabilize bölümü. </li><li> hafifçe çalkalanarak 5 dakika boyunca DPBS içinde iki kez slaytlar yıkayın. </li><li> Fazla DPBS kapalı leke ve bir hidrofobik etiketleme kalemle boyama bölgeyi tanımlamak. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DPBS içinde% 10 serum ile blok bölümleri. </li><li> blok içinde seyreltilmiş kolajen tip IV antikoru (200 ColIV, 1) blok çıkarın ve uygulanır. nem kontrollü bir odacıkta 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilir. </li><li> için DPBS slaytlar üç kez yıkayınhafifçe çalkalanarak 5 dak. </li><li> DPBS ve slaytlar için geçerlidir: ve DAPI (5.000: 1) floresan konjuge sekonder antikor (500 1) seyreltin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. GFP farklı emisyon ve uyarım dalga boyu ile uygun bir ikincil antikor seçin. </li><li> hafifçe çalkalanarak 5 dakika boyunca PBS içinde kayan üç kez yıkayın. Montaj orta montaj slaytlar. </li></ol></li></ol> 9. Görüntüleme ve Niceleme Ex Vivo Kültürlerin <ol><li> bir kör kullanıcı imaja sahip ve lekeli bölümleri ölçmek. epikardiyumun (kalbin kenar) 40X büyütme floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak boyunca 4-5 keyfi yerlerde belirli bir kalp Image en az beş ardışık olmayan doku bölümleri. Tipik sonuçlar ters konfokal tarama mikroskobu kullanılarak Şekil 3B gösterilmiştir. </li><li> El ile belirli bir görüntüde GFP pozitif hücrelerin toplam sayısını. GFP po olarak EPDC göç tespitiçinde veya ColIV subepikardiyal bazal membran dışında bulunan, pozitif hücreler. GFP, belirli bir görüntüde GFP pozitif hücrelerin toplam sayısı üzerinden GFP pozitif hücrelerin göç sayısı gibi hücrelerin göç yüzde belirleyin. Tipik sonuçlar ters konfokal tarama mikroskobu kullanarak Şekil 3C-D gösterilmiştir. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada akıbet birincil epikardiyal hücreyi izole etmek ve ex vivo kalp kültürlerinde EPDC göç izlemek için ayrıntılı yöntemler özetlemektedir. akıbet kültürler için, epicardium tükenmiş kalp kaldırmak için uygun zaman deneyler arasında biraz değişir. bir gecede inkübasyon sonrasında eksplant periyodik izleme epikardiyal akıbet kapsamını ölçmek için ve fibroblastlar görünmeden önce kalbini çıkarmak için tavsiye edilir. saflık sağlamak için, kalpleri olmayan epikardiyal soy...

epicardium mezotel hücreleri tek bir tabaka olduğunu çizgiler kalp ve etkileri kalp gelişme, olgunlaşma ve onarım. Parakrin sinyaller son derece koordineli alışverişi yoluyla, myokard ve endokard arasındaki yakın diyalog kalp büyümesi ve non-miyosit kalp soy 1 oluşumu için vazgeçilmezdir. Epikardiyal türetilmiş hücreler (EPDC) epitelyal-to-mezenkimal geçiş (EMT) 2 ile epikardiyal hücrelerinin bir alt kümesi ile ilgili ortaya, subepikardiyal alanı ve temel miyokard işgal, ve büyük ölçüde, koroner vasküler duvar hücreleri ve kalp fibroblastlannın içine ayırt, ve a daha az bir ölçüde, endotelyal hücreler ve kardiyomiyositlerde 3-9. Epikardiyal EMT ve EPDC istilası düzenleyen mekanizmaların salgı 10-13 hücre yüzeyi reseptörlerinin ve yapışma moleküllerinin 14,15, dede de dahil olmak üzere, çeşitli moleküllerin koordine hareket bağlanmıştırapikal-bazal polarite 16,17, küçük GTPases 18,19 ve transkripsiyon lators 2,20,21 faktörleri. EPDC göç moleküler efektör birçok tanımlanmış olmasına rağmen, stratejilerin gelişimini hızlandırmak olabilir embriyoda EPDC seferberlik teşvik fizyolojik sinyallerin daha iyi anlaşılması gelişmiş kardiyak onarım için yetişkin bu süreci manipüle etmek. EPDC seferberlik yeni regülatörleri tespit etmeyi amaçlayan çalışmalar bu hücre popülasyonunun saflaştırılması veya bireysel epikardiyal hücrelerin göçünü izleme güveniyor. Bir veya WT1, Tcf21, Tbx18 ve / veya Aldh1a2 içeren işaretçi genler, bir arada, yaygın olarak fetal epikardiyumu 1 tanımlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu markerlerin kullanımı epikardiyal hücreleri transdif getirildiğinde epikardiyal markerlerin sentezlenmesi kalp gelişimi boyunca azalıyor ve genellikle kaybedilir EPDC optimal değildir göç izlemekmezenkimal hücreler içine ferentiation. Cre / loxP sisteminin uygulanması, soy-izleme muhabirleri ile birlikte, kalıcı kalp gelişimi sırasında epikardiyumu ve kökenini etiketleme ve yetişkin 7,22,23 iskemik yaralanma aşağıdaki yararlı olmuştur. Çeşitli epikardiyal kısıtlı Cre hatları üretildiğini ve yaygın EPDC etiket ve koşullu gen silme stratejileri 1 için kullanılır. Bu çalışmalar çeşitli epikardiyal soylarının karakterizasyonu ve EPDC motilite ve farklılaşmasının önemli aracılar belirlenmesine yol açmıştır. Ancak, biriken kanıtlar da epicardium progenitör hücrelerin 4,24,25 heterojen bir nüfusu olduğunu göstermektedir. Böylece, epikardiyal hücrelerin sadece bir alt kümesi verilen Cre sürücüsü kullanılarak hedef olacaktır. ne olursa olsun Cre özgüllük tüm epikardiyumu etiketlemek için, laboratuvarların sayısı akıbet cul kullanmış olmasıTure sistemleri veya ex vivo organ kültürü yöntemleri sadakatle izole veya 26-28 işaretleme kalemler genetik soy ifadesi bağlı olmaksızın epikardiyal hücreleri etiketlemek için. Ex vivo olarak taşıma çalışmaları için, oluşum safhasındaki kalpler epikardiyal EMT önce ve yeşil flüoresan proteini (GFP) -expressing adenovirüs (Ad / GFP) 9,18 ile takviye edilmiş ortam içinde kültürlendi izole edilir. Bu yaklaşım verimli, tüm epikardiyumun etiketleme ziyade Cre-aracılı rekombinasyon ile hücrelerin bir alt kümesi için izin verir. Kalp kültürler sonradan EPDC 28,29 seferber uyardığı EMT bilinen indükleyicileri maruz kalmaktadır. Ex vivo ve in vivo analizler EPDC göç sürüş detaylı mekanizmaları keşfetmek için özellikle yararlı bir yaklaşım olan in vitro epikardiyal eksplant kültürler tarafından tamamlanmaktadır. Burada, epicardi in vitro çalışmalar için, birincil epikardiyal hücrelerin izole edilmesine yönelik yöntemleri tarif ederal EMT, hem de ex vivo olarak bir organ kültür sisteminde EPDC motilite analiz eder. Biz son zamanlarda genetik EPDC 9 aktin tabanlı göç işlemek için eksen sinyal myocardin ilgili transkripsiyon faktörü (MRTF) / serum yanıt faktörü (BAV) modülasyonu ile bu yöntemin yararını ve sağlamlığı olduğunu göstermiştir. Bulgularımız EPDC taşıma düzenleyen için gerekli bir sinyal yolunu vurgulamak da, bu yöntemler kolektif EPDC göç ve farklılaşma orkestra mekanizmaları çözülmesi için uygundur. Ayrıca, eksplant ve ex vivo kültür sistemleri kalp rejenerasyon terapötik uygulamalar için EPDC harekete yeni düzenleyici ortaya koymak için fonksiyonel ekranlarında uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Hyclone&amp;nbsp;</td><td>SH3002201</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution</td><td>Hyclone</td><td>SH3003102</td><td>HBSS</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Hyclone</td><td>SH3025301</td><td>M199</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3002802</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gemini&amp;nbsp;</td><td>100-106</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Solution</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td><td>Corning</td><td>354557</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24-well plates</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Equipped with Leica KL300 LED might source</td></tr><tr><td>Confocal miscroscope</td><td>Olympus</td><td>1X81</td><td>Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagenode&amp;nbsp;</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Transforming growth factor beta 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>100-B-001</td><td>TGF-&amp;beta;1</td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor BB</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>220-BB-010</td><td>PDGF-BB</td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Applied Biosystems</td><td>15596-026</td><td>Caution, hazardous material</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>DNaseI</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycogen</td><td>Life Technologies</td><td>10814-010</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>BioRad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibtor cocktail tablets</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Goat-anti-rabbit 488</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-rabbit 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Goat anti-mouse 594</td><td>Life Technologies</td><td>A-11005</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td>monoclonal antibody, clone 1A4</td></tr><tr><td>Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td><td>Life Technologies</td><td>MA1-46028</td><td>monoclonal antibody, clone 6F-H2</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO1</td><td>Life Technologies</td><td>40-2200</td><td>polyclonal antibody</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Collagen Type 4</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>polyclonal antibody</td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Fluorescent mounting medium&amp;nbsp;</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-B</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Disposable mictrotome blades&amp;nbsp;</td><td>Sakura Finetek</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Globe Scientific</td><td>1358W</td><td>positively charged, 25 mm x 75 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Cryostat&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Disposable base molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NADA 139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

epikardiyal hücreleri hatları bir tek katmanlı kalp, kardiyomiyosit çoğalmasını teşvik parakrin faktörler sağlanması ve gelişiminin doğrudan ve hastalık sırasında kardiyovasküler atalarıdır katkıda bulunmaktadır. bir dizi faktör epicardium-kaynaklı hücre (EPDC) harekete karışmış olsa da, bunların daha sonraki göç ve farklılaşmayı düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, EPDC motilite ve farklılaşma çalışma vitro ve ex vivo stratejileri sunuyoruz. İlk olarak, embriyonik fare kalp sonucudur kültürü birincil epikardiyal hücreleri elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bir organ kültür sisteminde etiketli EPDC, üç boyutlu taşıma değerlendirmek için detaylı bir protokol getirmektedir. Biz epicardium içinde myocardin ilgili transkripsiyon faktörlerinin genetik silme EPDC göç zayıflatan bu teknikleri kullanarak kanıtlar sunmaktadır. Bu yaklaşım EPDC aday değiştiricileri değerlendirmek için bir platform olarak hizmet vermektedirbiyoloji ve kardiyak onarım için yararlı olabilir EPDC harekete yeni düzenleyici belirlemek için genetik veya kimyasal ekranlar geliştirmek için kullanılabilir.

epicardium verimli onun dış konumu yararlanarak ve gelişimsel plastisite ve EPDC içsel göç davranışı istismar ederek bir sonucudur kültür testi kullanılarak izole edilebilir. Fare embriyonik kalpleri önce aşağı kollajen kaplı odasına slaytlar epikardiyal EMT ve kültürlü dorsal tarafına E11.5 izole edilmiştir 26 (Şekil 1A, B). Eksplante kalpleri sözleşme devam edecek; Ancak, epicardium kollajen matriks uymak ve kültür 24 saat <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration at JoVE.com

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

epicardial-outgrowth-culture-assay-ex-vivo-assessment-epicardial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K Görüntüleme.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

Video: Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Gelişim Biyolojisi

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Mühendislik

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Biyoloji

Fare Kalplerinde Kardiyak Hücrelerin Elektroporasyona Dayalı Transgenezi

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Yazar Spotlight: Hızlı Gen Taraması için Kardiyak Hücre Transgenezi

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Fare Embriyonik From The Heart Epikardiyal Hücrelerinin Vitro Kültür

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması

Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı