This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

Aşağıdaki protokol, erken endotelyal hücre göçü araştırılması için teknikleri açıklar. vasküler endotelyal hücrelerin uygun bir kültür endotelyal fenotipin uygun çoğalması ve bakım sağlamak için jelatin ile hücre kültürü şişelerinde ön-kaplama gerektirir. Hücre kültürü şişeleri 1. Ön kaplama <ol><li> % 0.1 bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M PBS içinde jelatin çözülür. </li><li> (Ayrıntılar belli otoklav talimatlara bakın) sıvı otoklav için parametreleri ile çözüm otoklavlayın. </li><li> Steril hücre kültürü şişesine (a T25 hücre kültürü şişesine örneğin, en azından 5 mi) otoklava jelatin solüsyonu yeterli hacim. </li><li> Bir inkübatör içine şişeler aktarın (37 ° C,% 5 CO2 gerekli değildir ancak müdahale etmez), en az 30 dakika karıştırıldı. </li><li> Kalan jelatin çözüm çıkarın. Daha sonra önceden kaplanmış şişeler kullanın (bkz hücre ekimi) ya da skullanılıncaya kadar steril şartlar altında yırtıldı. </li></ol> Erken Endotel hücrelerinin 2. Hücre Yetiştiriciliği Not: daha önce tarif edildiği gibi 10,11 Embriyonik kök hücre kaynaklı erken endotel hücreleri (EEC) PECAM-1 pozitif hücre fraksiyonunun, manyetik aktive edilen hücre sınıflandırma ile farklılaşmış fare embriyoid gövdelerinden elde edilmiştir. <ol><li> DMEM jelatin kaplı hücre kültür çanakları üzerinde Kültür EEC% 15 FCS, 50 U / ml penisilin, 50 u ile takviye / ml streptomisin, 200 uM L-glutamin, 100 uM beta-merkaptoetanol ve% 1 temel olmayan amino asitler yer alır. Steril koşullar altında hücrelerin taşıyınız. 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile hücreleri yetiştirmek ve% 95 nem alt izdiham (maks.% 80) kadar. </li><li> 5 oranında: alt izdiham, 1 hücreleri bölmek. Not: endotelyal hücrelerin Müfreze kritik bir adımdır. <ol><li> RT Accutase ile hücreleri Hasat. Ortamı çıkarın PBS ile yıkayın ve 25 cm başına Accutase 1 ml ekleyin <sup&gt; 2. </li><li> Hücreler müstakil kadar 2-10 dakika boyunca oda sıcaklığında balon inkübe edin. Hücreleri Dağılın ve istenen uygulama aktarabilirsiniz. Not: Accutase kimyasal nötralizasyon serpilmiş hücreleri, 37 ° C&#39;de inkübatör içinde depolanan zaman gerçekleşir olarak gerekli değildir. Ancak, Accutase aktivite de DMEM içeren FCS ekleyerek azaltılabilir. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Odası Not: Boyden haznesi Testler 8 um gözenek büyüklüğüne sahip ışık geçirmeyen, polietilen tereftalat ekleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. <ol><li> Ön kaplama, en az 30 dakika boyunca 0.1 M PBS içinde çözülmüş,% 0.1 jelatin, 500 ul ilave edilerek filtre ekler (böylece bir Boyden haznesi oluşturmak hücre kültürü kuyu içinde bu uyum). </li><li> Hücreler toksik kimyasallara maruz kalması ise, hücre hasat öncesi spesifik deneysel tasarım göre maruz kalmaktadır. Not: Hücreler / ml DMEM 12.5 mikrogram chlorambucil maruz bırakıldı24 saat karıştırıldı. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir. </li><li> Hasat EEC bir sayma hücre odasını kullanarak hücre sayısını belirlemek ve. Not: Otomatik sayım cihazları kullanılabilir, ancak dikkatli kullanılmalıdır: manuel hücre sayımı daha doğru ve şiddetle tavsiye edilir. </li><li> Boyden odasının alt bölmesi bölmesine 500 ul hücre kültür ortamı. </li><li> Üst bölme bölmesindeki filtre elemanının 500 ul hücre kültür ortamı içinde tam olarak 10 4 EEC ekleyin. Kabarcıklar ortadan kaldırın. </li><li> Tam 8 saat boyunca inkübatör filtre ekler inkübe. </li><li> Bir kez PBS ile yıkayın ve hücre tespiti için 25 dakika süre ile, her iki bölme içinde 0.5 ml% 4 paraformaldehit ile orta yerine. Yoğun filtre yıkayın, ancak 0.1 M PBS ile en az 3 kez. </li><li> Bir neşter ile membranlar tüketim. </li><li> Nükleer lekelenme için DAPI içeren montaj ortamı ile iki cam kapak fişleri arasında membran monteörn. Yönlendirmeye dikkat edin. Zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş tek hücreler sayılır emin olun. </li><li> 400X büyütmede bir floresan mikroskop ile zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş hücreleri saymak. Göç hücreleri (Şekil 1A, 1B) ile membran gözenekleri karıştırmayın. Biyolojik çoğaltır makul sayıda (koşul başına en az 3 biyolojik çoğaltır) araştırın. </li></ol> 4. Yara İyileşme Testi <ol><li> DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin. Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir. </li><li> Canlı hücre görüntüleme için uygun hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, 4 cm&#39;lik cam alt petri uygun)% 80 izdiham kadar. Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek yoktur. </li><li> Steril 10 ul pipet uçları ile mono tabakaları Scratch. Çanak yüzeye çok fazla baskı olmadan hafifçe ucu itin ve müstakil hücreleri çıkarmak için 0.1 M PBS ile hücreler iki kez other.Wash bir taraftan sorunsuz bir çizgide hareket ettirin. </li><li> Kültür çanak orta yeterli hacim ekleyin. Varsa, soruşturulması gerektiğini bileşikler ekleyin. Not: ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik ortam 15 ng / ml a linolenik asit ilave edildi. </li><li> Canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir mikroskop altında kültür çanak monte edin. CO2% 5, 37 ° C ve nemlendirilmiş bir atmosfer sağlamak. Not: Nemlendirme orta buharlaşmayı önlemek için özellikle önemlidir. </li><li> 10 dakika aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. Büyük dosya boyutları için planlayın. Not: 512 x 512 piksel çözünürlük genellikle yeterlidir; Ancak, en az 1,024 x 1,0 görüntülerini kullanmanızı öneririz24. </li><li> Açık kaynak yazılım (örn ImageJ) mikroskop birlikte verilen yazılımın uzunluğu aracını kullanarak = 24 saat t = 0 saatte ve t boşluk genişliğini ölçün veya kullanmayın. Not: Genel spesifik görüntü toplama ve analiz yazılımında üreticisi tarafından sağlanır. Bu nedenle, yazılımın kullanımı ile ilgili teknik detaylar için, kılavuza bakınız. </li></ol> 5. Hücre Takibi <ol><li> DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin. Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir. </li><li> Uygun bir hücre kültürü cihazında takviye edilmiş DMEM içinde 5 x 10 4 EEC Tohum (örneğin, 24-çok-yuvalı plaka) 37 ° C ve 1-2 gün süreyle% 95 nemde% 5 CO2 ile hücrelerin kültive edilmesi. </li><li> Hücreler 80 büyüdü zaman% Izdiham, ilgili test maddelerinin varlığında medya ve kültür, yeni medya ile hücreleri çıkarmak (örneğin, 12.5 mikrogram klorambusil / ml DMEM). Her zaman (bireysel deney sistemine bağlı olarak 24 saat), belli bir süre için, 37 ° C &#39;de (çözücü, örneğin, etanol ile muamele edilmiş), kontrol hücreleri içerir. </li><li> Canlı hücre görüntüleme (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) edebilen bir mikroskop altında bir kültür çanağı monte edin. Önceden tanımlanmış aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. 10 dakika aralıklarla görüntüleri edinin. </li><li> ImageJ eklentisi MTrackJ kullanılarak elle AET izleme yapın. Görüş alanından rastgele 10 hücreleri seçin ve MTrackJ komutasını &quot;Add&quot; seçeneğini kullanarak zaman içinde noktası başına bir veri noktası ekleyerek onların hareketlerini izlemek. </li></ol> [. Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;] MTrackJ ücretsiz olarak mevcuttur ve ImageJ availab: Not[Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;] at le. MTrackJ eklenti hakkında detaylı manuel &quot;http://www.imagescience.org&quot; mevcuttur. 6. Canlı Hücre Görüntüleme / Mitokondriyal Membran Değerlendirilmesi Potansiyeli <ol><li> Uygun bir hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, canlı hücre görüntüleme için uygun 4 cm&#39;lik cam alt petri)% 80 izdiham kadar. Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek etmeyin. </li><li> Varsa, kimyasallara maruz hücreleri. Not: Hücreler, 24 saat boyunca 12.5 ug / ml klorambusil maruz bırakılmıştır. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir. </li><li> Tetrametilrodamin DMSO (TMRM) içindeki bir 10 mM stok çözelti hazırlayın. Işıktan koruyunuz. Not: Stok solüsyonu -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> (: 1000 sulandırma 1), 10 uM&#39;lik bir konsantrasyon ile bir çalışma çözeltisine hücre kültür ortamı içinde stok çözeltisi ile seyreltilir. Işıktan koruyunuzve mümkün olduğu kadar kısa zamanda kullanılır. Not: çalışma çözeltisi bir süre (&gt; 1 saat) oda sıcaklığında muhafaza edilebilir, bununla birlikte, yeni bir çalışma çözeltisinin hazırlanması önerilir. </li><li> 1 ml taze hücre kültürü ortamı (yükleme çözeltisi) çalışma çözeltisinin 2 ul ekleyin. </li><li> Yükleme çözümü ile hücre kültür ortamı değiştirerek hücreleri yükleyin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve nemlendirilmiş bir atmosfer (kuluçka makinesinde) 15 dakika için kuluçkalayın. Dikkat: Hemen hemen tüm floresan göstergeleri zamanla canlı hücreler tarafından ihraç edilmektedir; Bu nedenle, uzun süreli yükleme veya gecikmeli analizi kaçının. </li><li> Yıkama olmadan canlı hücre görüntüleme için uygun olan bir mikroskop altında çanak yerleştirin. Önemli: floresan göstergeleri, bu nedenle, gereksiz ışık maruziyeti önlemek, ışığa karşı oldukça duyarlıdır. </li><li> Farklı görüntüler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak iktisap parametrelerini değiştirmeden görüntüleri edinin. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis,+vasculogenesis,+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds.">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li><li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li><li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+1:+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds.">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li><li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+progenitor+cell+mobilization,+and+diabetic+wound+healing.">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li><li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing.">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li><li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering.">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+mustard+(Chlorambucil)+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development.">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation.">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorambucil+(nitrogen+mustard)+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine.">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis.">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li><li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+separations.">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species.">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture.">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Zehirli kimyasallara dermal maruziyet sık sık şiddetli yara iyileşmesi bozukluğu ile sonuçlanır. altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Yara iyileşmesi farklı aşamalardan (hemostaz, inflamasyon, proliferasyon ve yeniden şekillenme) oluşan karmaşık bir süreçtir. Hücre göçü, ancak, bu granülasyon dokusunun oluşması için büyük önem taşımaktadır, her aşamada yer almaktadır. Burada, yeni kan damarlarının anjiyo- veya vaskülojenez yoluyla oluşturulur. <p class="jove_con...

Hücre göçü deri hasarı sonrasında gelişme, çeşitli hastalıklar ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde önemlidir. Cilt hasarı takiben iltihap hasarlı veya nekrotik doku ve granülasyon sürücüleri ön yara kapanması kaldırır ve vaskülojenez yoluyla yeni kılcal bir ağ oluşumunu (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut veziküllerin filizlenme) 1-3 verir. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin göçünü gerektirir. kan damarlarının artan ağ nihai olarak keratinizasyon tabi keratinositlerin çoğalan oksijen ve besin taşımak için gerekli olan, yeni bir epitel oluşturur ve yara kapanmasını sağlar. Endotel hücrelerinin Engelliler göç bozukluğu 4,5 yara iyileşmesi altta yatan nedenidir. Erken endotelyal hücrelerin Dolayısıyla, yöntem değerlendirmek için geçiş pathophysiol keşfetmek için gerekli olanhücre göçü bozukluklarının ogy ve terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek için. Alkile edici maddeler (örneğin, kükürt ve azot hardalları) dermal maruz bozukluğu 6 yara iyileşme neden olur. Bu tür bileşikler nedeniyle siyasi istikrarsız bölgeler ve nispeten basit sentez mevcut stokları güçlü endişe nedeni, 20. yüzyılda çeşitli çatışmalarda kimyasal savaş maddeleri olarak kullanılan ve devam edildi. Sülfür, hardal, ilk 1822 sentezlendi rağmen, SM maruz moleküler ve klinik patoloji detaylı olarak anlaşılamamıştır SM maruz kalma bir antidot saptanmıştır. Pek çok çalışma, anlamak ve SM maruz kaldıktan sonra bozuk yara iyileşmesi model ve bu etki ayırma yeteneğine potansiyel aday bileşikler test etmek için gerçekleştirilmiştir. Schmidt ve ark. (2009), klorambusil etkisini MM SM benzer özelliklere sahip bir alkilleme bileşiği testse embriyoid vücut modelleri ve damar oluşumunda 7 dramatik, bazen% 99&#39;dan fazla azalma bulundu. Bu olumsuz etki, en, fizyolojik koşullar altında, proliferasyon ve vasküler endotel öncü hücrelerin göç hakim olduğu bir gelişme aşamasında belirgindir. Bu nedenle, bu hücreler, alkile edici maddeler, özellikle duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Steinritz ve ark., (2010), fare embriyoit vücut modellerinde ve özellikle SM toksisitesini azaltmak için yetenekleri açısından özellikle, N-asetilsistein (NAC), ve alfa linolenik asit (ALA), reaktif oksijen türlerinin (ROS), temizleyicileridir test damar oluşumunu 8 geri yükleme. Geçici koruyucu etkilerinin aşırı ROS oluşumu yara iyileşmesi üzerine SM olumsuz etkilerine katkıda muhtemel olduğunu belirten gözlendi. Bu etkiler kalıcı değildir ve iki aday bileşikler, uzun vadede 8 damar oluşumu ve yara iyileşmesini geri yeteneğine sahip olmayabilir. However, bu deneyler, hücre göçü soruşturma izin vermedi karmaşık bir 3D modelinde yürütülmüştür. Böylece, sonradan damar oluşumu 9 sürecinde önemli bir role sahip EEC hücre göçü üzerindeki yararlı etkileri NAC ve ALA test edilmiştir. Ayrıca, hücre kutup hücre göçü için gerekli olduğunu kanıtlar vardır. ROS oluşumuna yol açan Mitokondriyal işlev bozukluğu, hücre polarite bozduğu gösterilmiştir ve bu nedenle olumsuz hücre göçü etkileyebilir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyon açısından canlı hücre görüntüleme uygulandı ve ROS temizleyicilerin etkileri incelenmiştir. Aşağıdaki protokol EEC, Boyden odasının deneyi, hücre izleme analizleri ayrıntılı olarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için TMRM kullanımı dahil olmak üzere deney yara iyileşmesi kültivasyonu için genel şartları tarif eder. AET ekimi ve göç için deneysel protokollerin önemli yönleri vurgulanır.

<table><tbody><tr><td>Boyden Chamber&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &amp;micro;m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &amp;micro;m</td><td>Life Sciences</td><td>#351152</td><td></td></tr><tr><td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wound&amp;nbsp; healing assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Assessment of mitochondrial potential</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Linolenic acid</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td>&amp;nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td><td># 23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

(Kükürt ve azot hardalları gibi alkilleyici kimyasal savaş ajanları dahil) kimyasal maddelere maruz kalma yara iyileşmesi bozukluğu gibi klinik belirtiler bir bolluk neden olur. Yara iyileşmesinin fizyolojik süreç oldukça karmaşıktır. Ya vaskülojenez yoluyla (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut gemilerin filizlenmesi) - granülasyon dokusu oluşumu bir ön yara kapanması ile sonuçlanan ve yeni kılcal kan damarlarının ağını sağlayan bu süreçte önemli bir adımdır. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin fonksiyonel yönelik geçiş gerektirmektedir. Böylece, erken endotel hücre (AET) göç soruşturma potansiyel terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek bozuklukları şifa kimyasal kaynaklı yara patofizyolojisi anlamak ve önemlidir. Biz ajan poz alkilleyici sonra bozulmuş yara iyileşmesi değerlendirildi ve tr için potansiyel aday bileşikler testeatment. Bu protokolde belirtilen tekniklerin bir dizi kullanılabilir. Modifiye Boyden odası kantitatif AET&#39;nin kemokinezinin açıklanmıştır araştırmak. Ayrıca, niteliksel göç değerlendirmek için iz analizi ile birlikte tahlil yara iyileşmesi kullanımı gösterilmiştir. Son olarak, biz rahatsız hücre göçünün altında yatan mekanizmaları belirlemek için mitokondriyal membran potansiyelinin araştırılması için floresan boya TMRM kullanımını göstermek. Aşağıdaki protokol AET soruşturma için adapte edilmiş temel teknikleri anlatılmaktadır.

Alkilleyici ajanlara dermal maruziyet eritem, blister oluşumu ve yara iyileştirici bozukluğu ile ilişkili dermal ülserasyon kışkırtır. Yara iyileşmesi endotel hücrelerinin göçü dayalı anjio ve vaskülogenezis gerektirir. Kantitatif geçiş Boyden odasının deneyinin kullanımı ile değerlendirilebilir. Alkilleyici ajan klorambüsil için AET Şekil 1C maruz gösterildiği gibi hücre migrasyonu 9 önemli bir azalmaya neden olmuştur. Doğrudan 24 saat chlorambucil maruz kald?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals at JoVE.com

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K Görüntüleme.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Video: Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Kanser Araştırmaları

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Biyomühendislik

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Nörobilim

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Biyoloji

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Cost Effective and Adaptable Scratch Migration Assay

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as development and mounting an immune response. When a defect or alteration occurs with the cell migration process, it can have detrimental outcomes (i.e., cancer metastasis, wound healing, and scar formation). Due to the importance of cell migration, it is necessary to have access to a cell migration assay that is affordable, adaptable, and repeatable. Utilizing the common scratch migration assay, we have developed a new approach to analyzing cell migration that uses general laboratory equipment. The method described uses visual markers that allow for recapturing specific areas of interest without the use of time-lapse microscopy. In addition, it provides flexibility in the experimental design, ranging from altering the migration matrix substrate to the addition of pharmacological modifiers. Furthermore, this protocol outlines a way to account for the area of cell migration, which is not considered by several methods when examining cell migration. This new approach offers a scratch migration assay to a larger audience and will provide greater opportunity for researchers to examine the physiological and pathophysiological impact of cell migration.

We present a cost-effective method to the scratch migration assay that provides a new approach for determining cell migration without the use of equipment-intensive methods. While fibroblasts were used in this protocol, it can be adapted and utilized to study additional cell types and influences on cell migration.

Maliyet Etkin ve Uyarlanabilir Çizilme Göçü Tsası

Cell migration is a key component in both physiological and pathological events. Normal cell migration is required for essential functions such as ...

An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues and organs during development, but on the other hand, the same mechanisms are used by tumor cells to move and spread in a process known as cancer metastasis. One of the primary cellular machineries that make cell movement possible is an intracellular network of myosin and actin molecules, together known as &#8220;actomyosin&#8221;, which creates a contractile force to pull a cell in different directions.In this video, JoVE presents a historical overview of the field of cell migration, noting how early work on muscle contraction led to the discovery of the actomyosin apparatus. We then explore some of the questions researchers are still asking about cell motility, and review techniques used to study different aspects of this phenomenon. Finally, we look at how researchers are currently studying cell migration, for example, to better understand metastasis.

Cell Motility and Migration, Cell Invasion and Chemo-attraction

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...