This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

Aşağıdaki protokol, erken endotelyal hücre göçü araştırılması için teknikleri açıklar. vasküler endotelyal hücrelerin uygun bir kültür endotelyal fenotipin uygun çoğalması ve bakım sağlamak için jelatin ile hücre kültürü şişelerinde ön-kaplama gerektirir. Hücre kültürü şişeleri 1. Ön kaplama <ol><li> % 0.1 bir son konsantrasyona kadar, 0.1 M PBS içinde jelatin çözülür. </li><li> (Ayrıntılar belli otoklav talimatlara bakın) sıvı otoklav için parametreleri ile çözüm otoklavlayın. </li><li> Steril hücre kültürü şişesine (a T25 hücre kültürü şişesine örneğin, en azından 5 mi) otoklava jelatin solüsyonu yeterli hacim. </li><li> Bir inkübatör içine şişeler aktarın (37 ° C,% 5 CO2 gerekli değildir ancak müdahale etmez), en az 30 dakika karıştırıldı. </li><li> Kalan jelatin çözüm çıkarın. Daha sonra önceden kaplanmış şişeler kullanın (bkz hücre ekimi) ya da skullanılıncaya kadar steril şartlar altında yırtıldı. </li></ol> Erken Endotel hücrelerinin 2. Hücre Yetiştiriciliği Not: daha önce tarif edildiği gibi 10,11 Embriyonik kök hücre kaynaklı erken endotel hücreleri (EEC) PECAM-1 pozitif hücre fraksiyonunun, manyetik aktive edilen hücre sınıflandırma ile farklılaşmış fare embriyoid gövdelerinden elde edilmiştir. <ol><li> DMEM jelatin kaplı hücre kültür çanakları üzerinde Kültür EEC% 15 FCS, 50 U / ml penisilin, 50 u ile takviye / ml streptomisin, 200 uM L-glutamin, 100 uM beta-merkaptoetanol ve% 1 temel olmayan amino asitler yer alır. Steril koşullar altında hücrelerin taşıyınız. 37 ° C&#39;de% 5 CO2 ile hücreleri yetiştirmek ve% 95 nem alt izdiham (maks.% 80) kadar. </li><li> 5 oranında: alt izdiham, 1 hücreleri bölmek. Not: endotelyal hücrelerin Müfreze kritik bir adımdır. <ol><li> RT Accutase ile hücreleri Hasat. Ortamı çıkarın PBS ile yıkayın ve 25 cm başına Accutase 1 ml ekleyin <sup&gt; 2. </li><li> Hücreler müstakil kadar 2-10 dakika boyunca oda sıcaklığında balon inkübe edin. Hücreleri Dağılın ve istenen uygulama aktarabilirsiniz. Not: Accutase kimyasal nötralizasyon serpilmiş hücreleri, 37 ° C&#39;de inkübatör içinde depolanan zaman gerçekleşir olarak gerekli değildir. Ancak, Accutase aktivite de DMEM içeren FCS ekleyerek azaltılabilir. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Odası Not: Boyden haznesi Testler 8 um gözenek büyüklüğüne sahip ışık geçirmeyen, polietilen tereftalat ekleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. <ol><li> Ön kaplama, en az 30 dakika boyunca 0.1 M PBS içinde çözülmüş,% 0.1 jelatin, 500 ul ilave edilerek filtre ekler (böylece bir Boyden haznesi oluşturmak hücre kültürü kuyu içinde bu uyum). </li><li> Hücreler toksik kimyasallara maruz kalması ise, hücre hasat öncesi spesifik deneysel tasarım göre maruz kalmaktadır. Not: Hücreler / ml DMEM 12.5 mikrogram chlorambucil maruz bırakıldı24 saat karıştırıldı. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir. </li><li> Hasat EEC bir sayma hücre odasını kullanarak hücre sayısını belirlemek ve. Not: Otomatik sayım cihazları kullanılabilir, ancak dikkatli kullanılmalıdır: manuel hücre sayımı daha doğru ve şiddetle tavsiye edilir. </li><li> Boyden odasının alt bölmesi bölmesine 500 ul hücre kültür ortamı. </li><li> Üst bölme bölmesindeki filtre elemanının 500 ul hücre kültür ortamı içinde tam olarak 10 4 EEC ekleyin. Kabarcıklar ortadan kaldırın. </li><li> Tam 8 saat boyunca inkübatör filtre ekler inkübe. </li><li> Bir kez PBS ile yıkayın ve hücre tespiti için 25 dakika süre ile, her iki bölme içinde 0.5 ml% 4 paraformaldehit ile orta yerine. Yoğun filtre yıkayın, ancak 0.1 M PBS ile en az 3 kez. </li><li> Bir neşter ile membranlar tüketim. </li><li> Nükleer lekelenme için DAPI içeren montaj ortamı ile iki cam kapak fişleri arasında membran monteörn. Yönlendirmeye dikkat edin. Zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş tek hücreler sayılır emin olun. </li><li> 400X büyütmede bir floresan mikroskop ile zarın alt bölme tarafına doğru göç etmiş hücreleri saymak. Göç hücreleri (Şekil 1A, 1B) ile membran gözenekleri karıştırmayın. Biyolojik çoğaltır makul sayıda (koşul başına en az 3 biyolojik çoğaltır) araştırın. </li></ol> 4. Yara İyileşme Testi <ol><li> DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin. Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir. </li><li> Canlı hücre görüntüleme için uygun hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, 4 cm&#39;lik cam alt petri uygun)% 80 izdiham kadar. Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek yoktur. </li><li> Steril 10 ul pipet uçları ile mono tabakaları Scratch. Çanak yüzeye çok fazla baskı olmadan hafifçe ucu itin ve müstakil hücreleri çıkarmak için 0.1 M PBS ile hücreler iki kez other.Wash bir taraftan sorunsuz bir çizgide hareket ettirin. </li><li> Kültür çanak orta yeterli hacim ekleyin. Varsa, soruşturulması gerektiğini bileşikler ekleyin. Not: ihtiva eden 1.5 ml&#39;lik ortam 15 ng / ml a linolenik asit ilave edildi. </li><li> Canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir mikroskop altında kültür çanak monte edin. CO2% 5, 37 ° C ve nemlendirilmiş bir atmosfer sağlamak. Not: Nemlendirme orta buharlaşmayı önlemek için özellikle önemlidir. </li><li> 10 dakika aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. Büyük dosya boyutları için planlayın. Not: 512 x 512 piksel çözünürlük genellikle yeterlidir; Ancak, en az 1,024 x 1,0 görüntülerini kullanmanızı öneririz24. </li><li> Açık kaynak yazılım (örn ImageJ) mikroskop birlikte verilen yazılımın uzunluğu aracını kullanarak = 24 saat t = 0 saatte ve t boşluk genişliğini ölçün veya kullanmayın. Not: Genel spesifik görüntü toplama ve analiz yazılımında üreticisi tarafından sağlanır. Bu nedenle, yazılımın kullanımı ile ilgili teknik detaylar için, kılavuza bakınız. </li></ol> 5. Hücre Takibi <ol><li> DIC mikroskopi kullanılarak, plastik yüzey tabanlı kültür kaplarına veya kuyu plakaları önlemek yerine cam tabanlı cihazlar kullanın: Mevcut donanımına bağlı olarak, dikkatli bir hücre kültürü yemekleri veya plakaları seçin. Not: faz kontrast mikroskopisi kullanılarak durumunda, plastik esaslı yemekler de kullanılabilir. </li><li> Uygun bir hücre kültürü cihazında takviye edilmiş DMEM içinde 5 x 10 4 EEC Tohum (örneğin, 24-çok-yuvalı plaka) 37 ° C ve 1-2 gün süreyle% 95 nemde% 5 CO2 ile hücrelerin kültive edilmesi. </li><li> Hücreler 80 büyüdü zaman% Izdiham, ilgili test maddelerinin varlığında medya ve kültür, yeni medya ile hücreleri çıkarmak (örneğin, 12.5 mikrogram klorambusil / ml DMEM). Her zaman (bireysel deney sistemine bağlı olarak 24 saat), belli bir süre için, 37 ° C &#39;de (çözücü, örneğin, etanol ile muamele edilmiş), kontrol hücreleri içerir. </li><li> Canlı hücre görüntüleme (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) edebilen bir mikroskop altında bir kültür çanağı monte edin. Önceden tanımlanmış aralıklarla 24 saat boyunca zaman atlamalı görüntüler elde. 10 dakika aralıklarla görüntüleri edinin. </li><li> ImageJ eklentisi MTrackJ kullanılarak elle AET izleme yapın. Görüş alanından rastgele 10 hücreleri seçin ve MTrackJ komutasını &quot;Add&quot; seçeneğini kullanarak zaman içinde noktası başına bir veri noktası ekleyerek onların hareketlerini izlemek. </li></ol> [. Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;] MTrackJ ücretsiz olarak mevcuttur ve ImageJ availab: Not[Rasband, ImageJ. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;] at le. MTrackJ eklenti hakkında detaylı manuel &quot;http://www.imagescience.org&quot; mevcuttur. 6. Canlı Hücre Görüntüleme / Mitokondriyal Membran Değerlendirilmesi Potansiyeli <ol><li> Uygun bir hücre kültürü cihazında AET Yetiştirmek (örneğin, canlı hücre görüntüleme için uygun 4 cm&#39;lik cam alt petri)% 80 izdiham kadar. Önemli: izdiham tamamlamak için hücreleri yetiştirmek etmeyin. </li><li> Varsa, kimyasallara maruz hücreleri. Not: Hücreler, 24 saat boyunca 12.5 ug / ml klorambusil maruz bırakılmıştır. Belirli bir deney tasarımı ile ilgili olarak, kullanım talimatları değişebilir. </li><li> Tetrametilrodamin DMSO (TMRM) içindeki bir 10 mM stok çözelti hazırlayın. Işıktan koruyunuz. Not: Stok solüsyonu -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> (: 1000 sulandırma 1), 10 uM&#39;lik bir konsantrasyon ile bir çalışma çözeltisine hücre kültür ortamı içinde stok çözeltisi ile seyreltilir. Işıktan koruyunuzve mümkün olduğu kadar kısa zamanda kullanılır. Not: çalışma çözeltisi bir süre (&gt; 1 saat) oda sıcaklığında muhafaza edilebilir, bununla birlikte, yeni bir çalışma çözeltisinin hazırlanması önerilir. </li><li> 1 ml taze hücre kültürü ortamı (yükleme çözeltisi) çalışma çözeltisinin 2 ul ekleyin. </li><li> Yükleme çözümü ile hücre kültür ortamı değiştirerek hücreleri yükleyin. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve nemlendirilmiş bir atmosfer (kuluçka makinesinde) 15 dakika için kuluçkalayın. Dikkat: Hemen hemen tüm floresan göstergeleri zamanla canlı hücreler tarafından ihraç edilmektedir; Bu nedenle, uzun süreli yükleme veya gecikmeli analizi kaçının. </li><li> Yıkama olmadan canlı hücre görüntüleme için uygun olan bir mikroskop altında çanak yerleştirin. Önemli: floresan göstergeleri, bu nedenle, gereksiz ışık maruziyeti önlemek, ışığa karşı oldukça duyarlıdır. </li><li> Farklı görüntüler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak iktisap parametrelerini değiştirmeden görüntüleri edinin. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis,+vasculogenesis,+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds.">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li><li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li><li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation.+1:+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds.">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li><li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=endothelial+progenitor+cell+mobilization,+and+diabetic+wound+healing.">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li><li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing.">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li><li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering.">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+mustard+(Chlorambucil)+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development.">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation.">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li><li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorambucil+(nitrogen+mustard)+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine.">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis.">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li><li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cell+separations.">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species.">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness.">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue &amp; Cell. 30, 525-530 (1998).</li><li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture.">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Zehirli kimyasallara dermal maruziyet sık sık şiddetli yara iyileşmesi bozukluğu ile sonuçlanır. altında yatan mekanizmalar tam olarak bilinmemektedir. Yara iyileşmesi farklı aşamalardan (hemostaz, inflamasyon, proliferasyon ve yeniden şekillenme) oluşan karmaşık bir süreçtir. Hücre göçü, ancak, bu granülasyon dokusunun oluşması için büyük önem taşımaktadır, her aşamada yer almaktadır. Burada, yeni kan damarlarının anjiyo- veya vaskülojenez yoluyla oluşturulur. <p class="jove_con...

Hücre göçü deri hasarı sonrasında gelişme, çeşitli hastalıklar ve yara iyileşmesi dahil olmak üzere, pek çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde önemlidir. Cilt hasarı takiben iltihap hasarlı veya nekrotik doku ve granülasyon sürücüleri ön yara kapanması kaldırır ve vaskülojenez yoluyla yeni kılcal bir ağ oluşumunu (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut veziküllerin filizlenme) 1-3 verir. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin göçünü gerektirir. kan damarlarının artan ağ nihai olarak keratinizasyon tabi keratinositlerin çoğalan oksijen ve besin taşımak için gerekli olan, yeni bir epitel oluşturur ve yara kapanmasını sağlar. Endotel hücrelerinin Engelliler göç bozukluğu 4,5 yara iyileşmesi altta yatan nedenidir. Erken endotelyal hücrelerin Dolayısıyla, yöntem değerlendirmek için geçiş pathophysiol keşfetmek için gerekli olanhücre göçü bozukluklarının ogy ve terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek için. Alkile edici maddeler (örneğin, kükürt ve azot hardalları) dermal maruz bozukluğu 6 yara iyileşme neden olur. Bu tür bileşikler nedeniyle siyasi istikrarsız bölgeler ve nispeten basit sentez mevcut stokları güçlü endişe nedeni, 20. yüzyılda çeşitli çatışmalarda kimyasal savaş maddeleri olarak kullanılan ve devam edildi. Sülfür, hardal, ilk 1822 sentezlendi rağmen, SM maruz moleküler ve klinik patoloji detaylı olarak anlaşılamamıştır SM maruz kalma bir antidot saptanmıştır. Pek çok çalışma, anlamak ve SM maruz kaldıktan sonra bozuk yara iyileşmesi model ve bu etki ayırma yeteneğine potansiyel aday bileşikler test etmek için gerçekleştirilmiştir. Schmidt ve ark. (2009), klorambusil etkisini MM SM benzer özelliklere sahip bir alkilleme bileşiği testse embriyoid vücut modelleri ve damar oluşumunda 7 dramatik, bazen% 99&#39;dan fazla azalma bulundu. Bu olumsuz etki, en, fizyolojik koşullar altında, proliferasyon ve vasküler endotel öncü hücrelerin göç hakim olduğu bir gelişme aşamasında belirgindir. Bu nedenle, bu hücreler, alkile edici maddeler, özellikle duyarlı olduğu tespit edilmiştir. Steinritz ve ark., (2010), fare embriyoit vücut modellerinde ve özellikle SM toksisitesini azaltmak için yetenekleri açısından özellikle, N-asetilsistein (NAC), ve alfa linolenik asit (ALA), reaktif oksijen türlerinin (ROS), temizleyicileridir test damar oluşumunu 8 geri yükleme. Geçici koruyucu etkilerinin aşırı ROS oluşumu yara iyileşmesi üzerine SM olumsuz etkilerine katkıda muhtemel olduğunu belirten gözlendi. Bu etkiler kalıcı değildir ve iki aday bileşikler, uzun vadede 8 damar oluşumu ve yara iyileşmesini geri yeteneğine sahip olmayabilir. However, bu deneyler, hücre göçü soruşturma izin vermedi karmaşık bir 3D modelinde yürütülmüştür. Böylece, sonradan damar oluşumu 9 sürecinde önemli bir role sahip EEC hücre göçü üzerindeki yararlı etkileri NAC ve ALA test edilmiştir. Ayrıca, hücre kutup hücre göçü için gerekli olduğunu kanıtlar vardır. ROS oluşumuna yol açan Mitokondriyal işlev bozukluğu, hücre polarite bozduğu gösterilmiştir ve bu nedenle olumsuz hücre göçü etkileyebilir. Bu nedenle, mitokondriyal fonksiyon açısından canlı hücre görüntüleme uygulandı ve ROS temizleyicilerin etkileri incelenmiştir. Aşağıdaki protokol EEC, Boyden odasının deneyi, hücre izleme analizleri ayrıntılı olarak mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için TMRM kullanımı dahil olmak üzere deney yara iyileşmesi kültivasyonu için genel şartları tarif eder. AET ekimi ve göç için deneysel protokollerin önemli yönleri vurgulanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Boyden Chamber&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &#181;m</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>#351151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &#181;m</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>#351152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound&#160; healing assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Word Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>#FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assessment of mitochondrial potential</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA, Pasching, Austria</td>
			<td># L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Linolenic acid</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td>&#160;# L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorambucil</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td># 23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td># G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

(Kükürt ve azot hardalları gibi alkilleyici kimyasal savaş ajanları dahil) kimyasal maddelere maruz kalma yara iyileşmesi bozukluğu gibi klinik belirtiler bir bolluk neden olur. Yara iyileşmesinin fizyolojik süreç oldukça karmaşıktır. Ya vaskülojenez yoluyla (roman oluşumu) veya anjiyojenezi (mevcut gemilerin filizlenmesi) - granülasyon dokusu oluşumu bir ön yara kapanması ile sonuçlanan ve yeni kılcal kan damarlarının ağını sağlayan bu süreçte önemli bir adımdır. Hem vasculo- ve anjiyojenez endotel hücrelerinin fonksiyonel yönelik geçiş gerektirmektedir. Böylece, erken endotel hücre (AET) göç soruşturma potansiyel terapötik müdahale için yeni stratejiler belirlemek bozuklukları şifa kimyasal kaynaklı yara patofizyolojisi anlamak ve önemlidir. Biz ajan poz alkilleyici sonra bozulmuş yara iyileşmesi değerlendirildi ve tr için potansiyel aday bileşikler testeatment. Bu protokolde belirtilen tekniklerin bir dizi kullanılabilir. Modifiye Boyden odası kantitatif AET&#39;nin kemokinezinin açıklanmıştır araştırmak. Ayrıca, niteliksel göç değerlendirmek için iz analizi ile birlikte tahlil yara iyileşmesi kullanımı gösterilmiştir. Son olarak, biz rahatsız hücre göçünün altında yatan mekanizmaları belirlemek için mitokondriyal membran potansiyelinin araştırılması için floresan boya TMRM kullanımını göstermek. Aşağıdaki protokol AET soruşturma için adapte edilmiş temel teknikleri anlatılmaktadır.

Alkilleyici ajanlara dermal maruziyet eritem, blister oluşumu ve yara iyileştirici bozukluğu ile ilişkili dermal ülserasyon kışkırtır. Yara iyileşmesi endotel hücrelerinin göçü dayalı anjio ve vaskülogenezis gerektirir. Kantitatif geçiş Boyden odasının deneyinin kullanımı ile değerlendirilebilir. Alkilleyici ajan klorambüsil için AET Şekil 1C maruz gösterildiği gibi hücre migrasyonu 9 önemli bir azalmaya neden olmuştur. Doğrudan 24 saat chlorambucil maruz kald?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals at JoVE.com

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Toksik Kimyasalların Maruz sonra Endotel Hücre Göç Değerlendirilmesi

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K Görüntüleme.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Video: Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Zebra balığı Keratosit Eksplantlarındaki Deri Yara İyileşmesi Toplu Hücre Göç ve reepithelialization Eğitim için

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Gelişim Biyolojisi

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Mikrosıvısal tahlil endotel hücrelere (hiPSC-ECs) insan indüklenen Pluripotent kök hücre kaynaklı lökosit yapışma değerlendirme için

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...