EMS wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (NIH) [Grant-Nummer R01HL120919] unterstützt; der American Heart Association [Gewährungsnummer 10SDG4350046]; University of Rochester CTSA Auszeichnung von der NIH [Grant-Nummer UL1 TR000042]; und Startup-Mittel aus dem Aab CVRI. MAT wurde zum Teil durch einen Zuschuss an die University of Rochester School of Medicine and Dentistry vom Howard Hughes Medical Institute Med-In-Grad-Initiative unterstützt; und eine institutionelle Ruth L. Kirschstein National Research Service Award von der NIH [Grant-Nummer GM068411].

HINWEIS: Alle Experimente mit Mäusen von der Universität Ausschuss für Tier Ressourcen an der Universität von Rochester genehmigt. 1. Epicardial Outgrowth Kulturassay (1A) <ol><li> Die Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie 5 ml Medium A für die primäre epikardialen Zellisolierung durch Ergänzung Medium 199 (M199) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep). </li><li> Vorwärmen Medium A und 100 ml Hanks &#39;Balanced Salt Solution (HBSS) in einem 37 ° C Wasserbad °. </li><li> Erlauben kollagenbeschichtete chamber slides für 30 min auf Raumtemperatur erwärmen. </li><li> 100 l Medium A in jede Vertiefung der Kammer Rutsche und sanft drehen, um die Kollagenoberfläche gleichmäßig zu beschichten. Wiederholen Sie dies für 8-12 Brunnen. Entfernen Sie das Medium nach dem Beschichtungskammern. </li><li> Aliquot vorgewärmte HBSS in zwei 10 cm 2 Platten mit jeweils 50 ml HBSS. </li></ol></li><li> Isolieren Embryonale Herzen von schwangeren Mutter auf 11,5 Tage post coitum (DPC).30 <ol><li> Anästhesieren Maus mit 0,5 ml von 13 mg / ml Ketamin / 0,88 mg / ml Xylazin Cocktail in 1x Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) über intraperitoneale Injektion. Bestätigen Sie die richtige anesthetization einen Zeh Prise Test. Eine sanfte pinch ist ausreichend, um zu bestimmen, ob die Maus anspricht. Jede Bewegung oder Pfote zurückzuziehen zeigt das Tier nicht ausreichend zu tun Operation narkotisiert. Euthanize durch zervikale Dislokation. </li><li> Legen Sie die Maus Bauchseite nach oben und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol Kontamination durch Haare zu reduzieren. </li><li> Drücken Sie die Haut mit einer Pinzette und schneiden einen seitlichen Schnitt am Bauch mit chirurgischen Schere. Halten Sie die Haut fest und ziehen Sie dann auseinander Richtungen in Richtung Kopf und Schwanz in entgegenwirkt. </li><li> Pinch das Peritoneum mit einer Zange und Schneiden mit einer Schere in die Bauchhöhle zu belichten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Decidua entlang der Mesometrium durch Schneiden. Übertragen Sie die seziert Decidua auf vorgewärmt HBSS im ersten10 cm 2 - Platte. </li><li> Trennen Sie die Decidua von zwischen Embryonen zu schneiden. </li><li> Übertragen eines Embryos in die zweite 10 cm 2 - Platte mit vorgewärmter HBSS unter einem Binokular. Entfernen Sie vorsichtig die extraembryonic Gewebe und Dottersack, dann den Embryo enthaupten. </li><li> Klemmen Sie die Brustwand mit einer Pinzette und reißen das Gewebe auseinander an der Mittellinie, Freilegung der Brusthöhle. </li><li> Legen Sie die Zange hinter dem Herzen. Fassen Sie den Ausflusstrakt und ziehen Sie das Herz weg vom Embryo. Trennen Sie die Lungenwege und Lunge aus dem Herzen, wenn noch angebracht. </li></ol></li><li> Übertragen Sie das Herz auf eine einzelne Vertiefung der Kollagen-beschichteten Objektträger und legen Sie es dorsalen Seite nach unten (Abbildung 1B). Wiederholen Sie die Schritte 1.2.7-1.3 für jeden Embryo. </li><li> Sobald alle Herzen zu einzelnen Vertiefungen übertragen worden ist , die Kammer inkubieren Rutsche für 30 min bei 37 ° C, 5% CO 2 ausreichende Haftung an der Kollagenmatrix zu ermöglichen. </li><li> sorgfältig hinzufügen20-50 &amp; mgr; l vorgewärmtes Medium Explantat A um jedes Herz. Wichtig: Nehmen Sie das Medium nicht addieren sich zu schnell oder zu einem Niveau oberhalb des Herzens, sonst Herzen, die von Kollagen Substrat ablösen kann. </li><li> Kultur die Herzen bei 37 ° C, 5% CO 2 für ungefähr 24 Stunden epikardialen Auswuchs zu ermöglichen. Anmerkung: Auswüchse kann bereits 3-4 h der Kultur (1C) und in erster Linie besteht aus Mesothelzellen Anzeige cobblestoned Morphologie mit minimaler mesenchymale Zellkontamination (Figuren 1D, E) beobachtet werden. Repräsentative Ergebnisse wurden mit einem Präpariermikroskop mit einer Kamera ausgestattet erworben. </li></ol> 2. Genetische Ablation und Induktion der EMT in Epikardiale Auswüchse Vorsicht: Behandeln Sie Adenoviren mit Sorgfalt nach anerkannten Richtlinien der biologischen Sicherheit. <ol><li> Bereiten Sie 15 ml Medium B (M199 mit 1% FBS und 1% Pen / Strep) und Pre-warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Für Exzisionfloxed Allele, bereiten Explantation Medium B , ergänzt mit 2,5 x 10 4 pfu / ml Adenovirus exprimieren Cre - Rekombinase (Ad / CRE) oder Kontrollvirus. Hinweis: Adenovirale vermittelte Überexpression von Kandidatengenen können auch gain of function Phänotypen zu bewerten durchgeführt werden. Virustiter sollte durch den Endverbraucher bestimmt. </li><li> mit einer Pinzette vorsichtig Epikard abgereicherte Herzen aus Auswuchs Kulturen zu entfernen. Übertragen Herzen auf 1,5-ml-Röhrchen mit 800 ul Trizol und bei -80 ° C für eine spätere RNA-Isolierung und Genexpressionsanalyse. </li><li> Waschen jeder Vertiefung mit DPBS Blutzellen und überschüssige Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Hinzufügen 500 ul Explantat - Medium B mit Adenovirus ergänzt (n) zu jedem Auswachsen der Kultur und Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Für EMT Induktion entfernen Medien und füllt mit 37 ° C Explantation Medium B ergänzt mit rekombinanten Transforming Growth Factor (TGF) -β1 [10 ng / ml] oder Vehikel (4 mM hydrochloric Säure (HCl), enthaltend 1 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA)). Kultur Explantate für weitere 24 h bei 37 ° C, 5% CO 2. Fahren Sie mit dem Gen / Protein-Expressionsanalysen oder Immunzytochemie, wie in den nachfolgenden Protokollen beschrieben. Anmerkung: Die Induktion der epikardialen EMT wurde mit verschiedenen Konzentrationen von TGF-β1 im Bereich von 0,5 ng / ml stimuliert worden - 10 ng / ml 26,31-33. Höhere Konzentrationen von Liganden in unspezifischen führen kann an alle TGF-β-Rezeptoren binden. Die Konzentration von TGF-β1 sollten die spezifischen experimentellen Ziele widerspiegeln. </li></ol> 3. Genexpressionsanalyse von Epikardiale Auswüchse <ol><li> Thaw Epikard verarmten Herzen zuvor in Trizol gespeichert (2.2). </li><li> Absaugen Medien aus EPDC Kulturen und waschen zweimal mit DPBS. </li><li> In 800 ul Raumtemperatur Trizol Kulturen bis zur Explantation. </li><li> Inkubieren Epikard abgereicherte Herzen und EPDC Kulturen in Trizol für 5 min bei Raum temperatu<html> Re. Pipette nach oben und unten das Zehnfache der lysierten Probe zu homogenisieren. Hinweis: Innere weitere Pipettieren erfordern, um vollständig zu homogenisieren. </li><li> Übertragen Lysate bis 1,5-ml-Röhrchen und fahren Sie mit der Gesamt-RNA Isolierung pro Anweisungen des Herstellers. In 10 ug Glykogen vor der Fällung RNA-Ausbeute zu erhöhen. Eine gegebene Explantation wird etwa 0,5 bis 1,0 &amp; mgr; g RNA ergeben. </li><li> Entfernen Sie kontaminieren DNA mit DNase I und Reverse transkribieren 0,5 ug mRNA pro Anweisungen des Herstellers. </li><li> Überprüfen Sie die Reinheit der epikardialen Explantate und / oder Induktion von EMT mit quantitativen reversen Transkription (qRT) -PCR 34 mit SYBR grün und die in der Tabelle beschriebenen Marker 1. Normalisieren - mRNA - Spiegel zu Glycerinaldehyd - 3-Phosphat - Dehydrogenase (GAPDH) und berechnen relativen Expression unter Verwendung von die 2 - ΔΔCt Verfahren 35. Typische Ergebnisse sind in 2A gezeigt. </li></ol>title &quot;&gt; 4. Protein-Analyse von Epikardiale Auswüchse <ol><li> Absaugen Medien aus EPDC Kulturen und waschen zweimal mit DPBS. </li><li> In 10 ul eiskaltem Protein Lysepuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, pH 8,0, 1% Triton X-100, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail) zu jeder Kammer gut und legen Sie die Kammer gleiten auf Eis. Schneiden Sie ca. ¼ des Bodens auf einer P200 Pipettenspitze ab und verwenden Sie das restliche Stück der Zellen aus der Folie zu kratzen. Pipette nach oben und unten zu lysieren epikardialen Zellen und in ein 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Beschallen lysiert Explantate auf niedrig (160 W) für 5 min in einem Bad Eiswasser mit 30 Sekunden EIN und AUS-Zyklen. </li><li> Zentrifuge Lysate 10 min bei 10000 · g, 4 ° C. Überstand in ein frisches Röhrchen und Bestimmung der Proteinkonzentration unter Verwendung eines Protein - Assay 36. Hinweis: Eine gegebene Explantation wird Ausbeute von bis zu 1,5 &amp; mgr; g Gesamtprotein. Wir haben gefunden, dass die Bündelung Explantate von zwei Herzen eind Beladung 2 ug Protein pro Vertiefung ist ausreichend glatten Muskulatur α-Aktin (ACTA2) und 9 GAPDH zu erkennen. Die Detektion von anderen Zielproteine ​​erfordern können mehrere Proben Explantat Pooling wie durch den Endverbraucher bestimmt. </li></ol> 5. Immuncytochemie von Epikardiale Auswüchse <ol><li> Entfernen Sie das Medium aus Explantation Kulturen und waschen zweimal mit DPBS. </li><li> Fügen Sie vorsichtig 500 ul 4% (v / v) Paraformaldehyd oder eiskaltem Methanol in jede Vertiefung und fixieren Explantate für 5 Minuten bei Raumtemperatur oder 10 min bei -20 ° C. Fix nach Antikörper-Spezifikationen, wie vom Hersteller empfohlen. </li><li> Entfernen Fixiermittel und spülen jede Vertiefung mit DPBS dreimal 5 min. </li><li> Permeabilisierung der Zellen mit 500 ul 0,1% (v / v) Triton X-100 in DPBS für 5 min. </li><li> Entfernen Permeabilisierung Lösung und Spülen mit DPBS dreimal 5 min. </li><li> Blockieren die Zellen mit 10% Serum in DPBS für 30 min bei Raum temperatuRe. </li><li> Fahren Sie mit dem primären Antikörperfärbung pro Herstellerempfehlungen und optimale Bedingungen, wie durch den Endverbraucher bestimmt. </li><li> Entfernen Antikörperlösung und Spülen mit DPBS dreimal 5 min. </li><li> Bewerben sekundären Antikörper den Anweisungen des Herstellers und counterstain mit einem geeigneten Kern Farbstoff. </li><li> Entfernen Antikörperlösung und Spülen mit DPBS dreimal 5 min. </li><li> Entfernen Kammer Gleitwänden den Anweisungen des Herstellers und fügen Medium wässrige Montage direkt an die Zellen. Legen Sie ein Deckglas über die Zellen und Dichtung mit Nagellack. 2D unter Verwendung von invertierten konfokalen Rastermikroskopie - Typische Ergebnisse sind in Figur 2B gezeigt. </li></ol> 6. Ex Vivo Kulturassay (3A) <ol><li> Die Vorbereitungen <ol><li> Vorbereitung 12 ml ex vivo - Kulturmedium unter Verwendung eines (1: 1) -Mischung aus Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM): M199 , ergänzt mit 10%FBS und 1% Pen / Strep. </li><li> In einem 37 ° C Wasserbad, vorwärmen ex vivo Kulturmedium und 100 ml HBSS. </li><li> Aliquot 1 ml vorgewärmtes Medium in 8-12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte. </li><li> Transfer vorgewärmt HBSS auf zwei 10 cm 2 Platten, mit je 50 ml. </li></ol></li><li> Isolieren embryonalen Maus-Herzen in HBSS von schwangeren Dämme bei 12,5 dpc (wie in 1.2 beschrieben). </li><li> Übertragen jedes Herz zu einer einzigen Vertiefung der 24 - Well - Platte , die ex vivo Kulturmedium. Inkubieren der Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 unter leichtem Schaukeln oder manuell eine Schaukelplattform Anhaften zu verhindern. Ab sofort gehen 7.1 zu treten. </li></ol> 7. Epikardiale Labeling und EMT Induktion in Ex - vivo - Kulturen <ol><li> Um das Epikard etikettieren, bereiten 12 ml 37 ° C ex vivo - Kulturmedium , supplementiert mit 3,0 x 10 6 pfu / ml Ad / GFP. Für die gezielte Ablation von floxed Allele, Transfer 6 ml Ad / GFP Kulturmedium in ein neues 15 ml konischen Röhrchen ergänzt. Hinzufügen Ad / Cre oder Kontroll - Adenovirus zu einer Endkonzentration von 1,5 x 10 6 pfu / ml. Note: Verstärkung von Funktionsanalysen können auch mit geeigneten Adenovirus-vermittelte Genübertragung durchgeführt werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig von jeder Vertiefung der 24-Well-Platte mit einer P1,000 Pipettenspitze mit dem Kulturmedium. </li><li> Sanft Kulturmedium mit Adenovirus (n) in jede Vertiefung ergänzt hinzuzufügen. </li><li> Die Platte bei 37 ° C, 5% CO 2 für 24 Stunden unter leichtem Schütteln. </li><li> Für EMT Induktions bereiten 12 ml 37 ° C ex vivo - Kulturmedium , enthaltend 10 ng / ml TGF-β1 und 20 ng / ml platelet-derived growth factor (PDGF) -BB oder Vehikel (4 mM HCl , enthaltend 1 mg / ml BSA ). </li><li> Kulturmedium aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte mit einer P1,000 Pipettenspitze vorsichtig entfernen. Spülen Sie leicht die Herzen mit 1 ml DPBS. </li><li> Entfernen Sie die DPBS und ergänzen Herzen mit ex vivo Kultur michdium enthaltend TGF-β1 und PDGF-BB oder Vehikel. </li><li> Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2 unter leichtem Schütteln. </li></ol> 8. Kryokonservierung und Immunhistochemie von Ex Vivo Cultures <ol><li> Bereiten Sie die Herzen für die Kryokonservierung. <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Herzen zweimal mit eiskaltem DPBS. </li><li> 1 ml 4% (v / v) Paraformaldehyd zu jedem Herzen und fixieren für 2 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Entfernen Sie die Fixiermittel und waschen Herzen zweimal mit DPBS. Übertragen Sie die Herzen an die frische Brunnen mit 1 ml 10% (w / v) Saccharose in DPBS. Die Platte über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Sorgfältig übertragen Herzen neue Brunnen mit 18% (w / v) Saccharose in DPBS vorbereitet. Die Platte über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Übertragen jedes Herz zu einem cryomold haltiges Gewebe Einfriermedium. Sofort Blöcke einfrieren flüssigem Stickstoff und bei -80 &amp; # verwenden176; C. </li></ol></li><li> Abschnitt Herzen bei 5 um ein Kryostat und Platz Gewebeschnitte auf positiv geladene Objektträger verwenden. Shop gleitet bei -80 ° C bis zur Färbung. </li><li> Führen Immunhistochemie auf Abschnitte zur Erfassung des Unter epikardialen Basalmembran. <ol><li> Auftauen Folien für Temperatur mindestens 30 min bei Raum. </li><li> Rehydrieren die Abschnitte durch zweimal in DPBS für 5 min unter leichtem Schütteln waschen. </li><li> Permeabilisieren Abschnitt mit 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Objektträger zweimal in DPBS für 5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Blot überschüssige DPBS und definieren die Färbung Region mit einem hydrophoben Markierungsstift. Blockabschnitte mit 10% Serum in DPBS für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Block und anwenden Kollagen Typ IV-Antikörper (ColIV, 1: 200) in Block verdünnt. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in einer feuchtigkeitsgesteuerten Kammer. </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in DPBS für5 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Verdünnte fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper (1: 500) und DAPI (1: 5.000) in DPBS und gelten für den Folien. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur. Wählen Sie einen geeigneten sekundären Antikörper mit einem Emissions- und Anregungswellenlänge verschieden von GFP. </li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 min unter leichtem Schütteln. Berg Träger mit Eindeckmediums. </li></ol></li></ol> 9. Imaging und Quantifizierung von Ex - vivo - Kulturen <ol><li> Haben Sie einen verblendet Benutzer Bild und zu quantifizieren gefärbten Schnitten. Bild mindestens fünf nicht aufeinanderfolgende Gewebeschnitte aus einem gegebenen Herz in 4-5 beliebigen Stellen entlang der Epikard (Rand des Herzens) mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. Typische Ergebnisse sind in Figur 3B Verwendung invertierter konfokalen Rastermikroskopie gezeigt. </li><li> Zählen Sie manuell die Gesamtzahl der GFP-positiven Zellen in einem gegebenen Bild. Identifizieren EPDC als GFP po Migrationsitive Zellen innerhalb oder außerhalb des subepikardialen Basalmembran ColIV entfernt. Bestimmen den Prozentsatz der GFP-Zellen, wie die Anzahl von migrierenden GFP positive Zellen über die Gesamtzahl der GFP-positiven Zellen in einem gegebenen Bild migrieren. Typische Ergebnisse sind in 3C-D mit invertierten konfokalen Rastermikroskopie gezeigt. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir detaillierte Methoden skizzieren primäre epikardialen Zelle durch Auswuchs zu isolieren und EPDC Migration in ex vivo Herz Kulturen verfolgen. Für Auswuchs Kulturen variiert die geeignete Zeit, um das Epikard abgereicherte Herz zu entfernen leicht zwischen den Experimenten. Eine regelmäßige Überwachung der Explantate nach einer Inkubation über Nacht wird empfohlen, um das Ausmaß der epikardialen Auswuchs zu messen und um das Herz zu extrahieren, bevor Fibroblasten erscheinen. Um sicherzust...

Das Epikard ist eine einzelne Schicht aus Mesothelzellen, die Linien das Herz und die Auswirkungen Herz Entwicklung, Reifung und Reparatur. Durch eine hoch koordinierten Austausch von parakrine Signale ist die innige Dialog zwischen dem Myokard und Epikard unverzichtbar für kardiale Wachstum und der Bildung von Nicht-Myozyten - Herzabstammungslinien 1. Epikardiale abgeleiteten Zellen (EPDC) ergeben sich aus einer Untergruppe von epikardialen Zellen durch eine epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) 2, dringen in den subepikardialen Raum und das darunter liegende Myokard und unterscheiden weitgehend in koronaren Gefäßwandzellen und kardialen Fibroblasten, und ein geringerem Maße, Endothelzellen und Kardiomyozyten 3-9. Die Regulierungsmechanismen epikardialen EMT und EPDC Invasion haben die koordinierte Aktion verschiedener Moleküle einschließlich sezerniert Liganden 10-13, Zelloberflächenrezeptoren und Adhäsionsmoleküle 14,15, regel zugeschrieben wordenToren der apikal-basale Polarität 16,17, kleine GTPasen 18,19 und Transkriptionsfaktoren 2,20,21. Während viele der molekularen Effektoren der EPDC Migration definiert wurden, ein besseres Verständnis der physiologischen Signale, die EPDC Mobilisierung im Embryo stimulieren kann die Entwicklung von Strategien beschleunigen diesen Prozess bei Erwachsenen für eine verbesserte Herz-Reparatur zu manipulieren. Ziel Studien neue Regulatoren der EPDC Mobilisierung zu identifizieren, verlassen sich auf die Reinigung von dieser Zellpopulation oder die Migration einzelner epikardialen Zellen zu verfolgen. Eine oder eine Kombination von Markergenen, einschließlich Wt1, Tcf21, Tbx18 und / oder Aldh1a2, wird üblicherweise um die fötale Epikard 1 zu identifizieren. die Verwendung dieser Marker jedoch zu verfolgen EPDC Migration nicht optimal ist, als Ausdruck der epikardialen Markierungen im Laufe der Herzentwicklung nachlässt und wird oft verloren, wenn epikardialen Zellen transdif laufenferenzierung in mesenchymalen Zellen. Die Anwendung des Cre / loxP - System in Verbindung mit lineage-Tracing - Reporter wurde in permanent Markierung des Epikard und seine Abkömmlinge während Herzentwicklung und nach ischämischer Verletzung im erwachsenen 7,22,23 nützlich. Mehrere epikardialen beschränkten Cre Linien wurden 1 erzeugt und verwendet werden , weit EPDC und für die bedingte Gen - Deletion Strategien zu beschriften. Diese Studien haben die Charakterisierung verschiedener Abstammungen epikardialen geführt, und die Identifizierung von kritischen Mediatoren von EPDC Motilität und Differenzierung. Allerdings akkumulieren Hinweise darauf , auch die Epikard eine heterogene Population von Vorläuferzellen 4,24,25 ist. Somit wird nur eine Teilmenge von epikardialen Zellen gerichtet werden, um einen gegebenen Cre-Treiber. Um die gesamte Epikard unabhängig von Cre Spezifität, eine Reihe von Labors zu beschriften haben Auswuchs cul genutztture Systeme oder ex - vivo - Verfahren der Organkultur zu epikardialen Zellen treu zu isolieren oder zu beschriften , ohne in Abhängigkeit von der Expression eines genetischen Abstammungslinie Marker 26-28. Für die Ex - vivo - Migrationsstudien, sind embryonale Herzen vor dem epikardialen EMT und in Medium mit einem grün fluoreszierenden Protein (GFP) exprimierenden Adenovirus (Ad / GFP) 9,18 ergänzt isoliert. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente Markierung des gesamten Epikard eher als eine Untergruppe von Zellen, die durch Cre-vermittelte Rekombination. Herz - Kulturen werden anschließend mit bekannten Induktoren von EMT ausgesetzt , um die Mobilisierung von EPDC 28,29 zu stimulieren. Ex - vivo und in - vivo - Analysen werden ergänzt durch in vitro epikardialen Explantation Kulturen, die sind ein besonders nützlicher Ansatz für die Erkundung detaillierten Mechanismen der Fahrt EPDC Migration. Hier beschreiben wir Verfahren zur Isolierung von primären epikardialen Zellen für in vitro - Studien von epicardial EMT sowie ein Organkultursystem für die ex vivo - Analysen von EPDC Motilität. Wir haben vor kurzem gezeigt , den Nutzen und die Robustheit dieser Methode durch genetisch die myocardin-related transcription factor Modulation (MRTF) / Serum Response Factor (SRF) Signalisierungsachse 9 Aktin-basierte Migration von EPDC zu manipulieren. Während unsere Ergebnisse notwendig für die Regulierung EPDC Migration eines Signalwegs zu markieren, sind diese Verfahren geeignet ist, die Mechanismen zu entwirren, die gemeinsam EPDC Migration und Differenzierung zu orchestrieren. Darüber hinaus könnte das Explantat und ex vivo - Kultursystemen in Funktionsbildschirme implementiert werden , um neue Regulatoren der EPDC Mobilisierung für therapeutische Anwendungen in der Herzregeneration zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone&#160;</td>
			<td style="width:141px;">SH3002201</td>
			<td style="width:203px;">DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3003102</td>
			<td style="width:203px;">HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Medium 199</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3025301</td>
			<td style="width:203px;">M199</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SH3002802</td>
			<td style="width:203px;">DPBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Gemini&#160;</td>
			<td style="width:141px;">100-106</td>
			<td style="width:203px;">FBS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:163px;">Hyclone</td>
			<td style="width:141px;">SV30010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides</td>
			<td style="width:163px;">Corning</td>
			<td style="width:141px;">354557</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Multiwell 24-well plates</td>
			<td style="width:163px;">Falcon</td>
			<td style="width:141px;">08-772-1</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">M50</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with Leica KL300 LED might source</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:244px;">Confocal miscroscope</td>
			<td style="width:163px;">Olympus</td>
			<td style="width:141px;">1X81</td>
			<td style="width:203px;">Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Bioruptor</td>
			<td style="width:163px;">Diagenode&#160;</td>
			<td style="width:141px;">UCD-200</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Transforming growth factor beta 1</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">100-B-001</td>
			<td style="width:203px;">TGF-&#946;1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Platelet-derived growth factor BB</td>
			<td style="width:163px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">220-BB-010</td>
			<td style="width:203px;">PDGF-BB</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Trizol Reagent</td>
			<td style="width:163px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:141px;">15596-026</td>
			<td style="width:203px;">Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">TURBO DNA-free Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">AM1907</td>
			<td style="width:203px;">DNaseI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">1708891</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">UltraPure Glycogen</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">10814-010</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">SYBR Green</td>
			<td style="width:163px;">BioRad</td>
			<td style="width:141px;">170-8880</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Protease inhibtor cocktail tablets</td>
			<td style="width:163px;">Roche</td>
			<td style="width:141px;">11836170001</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat-anti-rabbit 488</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A11008</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-rabbit 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11012</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Alexa Goat anti-mouse 594</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">A-11005</td>
			<td style="width:203px;">Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">C6198</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1)</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>MA1-46028</td>
			<td style="width:203px;">monoclonal antibody, clone 6F-H2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-ZO1</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td>40-2200</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Rabbit anti-Collagen Type 4</td>
			<td style="width:163px;">Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB756P</td>
			<td style="width:203px;">polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:141px;">D1306</td>
			<td style="width:203px;">DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Fluorescent mounting medium&#160;</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S3023</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:244px;">16% Paraformaldehyde solution</td>
			<td style="width:163px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:141px;">15710</td>
			<td style="width:203px;">PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:141px;">S0389</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:163px;">Triangle Biomedical Sciences</td>
			<td style="width:141px;">TFM-B</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Pap pen</td>
			<td style="width:163px;">DAKO</td>
			<td style="width:141px;">S2002</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable mictrotome blades&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Sakura Finetek</td>
			<td style="width:141px;">4689</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:244px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:163px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:141px;">1358W</td>
			<td style="width:203px;">positively charged, 25 x 75 x 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Leica</td>
			<td style="width:141px;">CM1950</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Forceps</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">11295-00</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:141px;">91460-11</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Disposable base molds</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:141px;">22-363-553</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Ketamine</td>
			<td style="width:163px;">Hospira</td>
			<td>NDC 0409-2051-05</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:244px;">Xylazine</td>
			<td style="width:163px;">Akorn</td>
			<td>NADA 139-236</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epicardial outgrowth culture assay and ex vivo assessment of epicardial-derived cell migration

Eine einzelne Schicht aus epikardialen Zelllinien das Herz, parakrine Faktoren, die die Bereitstellung von Kardiomyozyten Proliferation stimulieren und Herz-Kreislauf-Vorläufern während der Entwicklung und Krankheit direkt beitragen. Während eine Anzahl von Faktoren in Epikard abgeleitete Zelle (EPDC) Mobilisierungs gebracht wurde, werden die Mechanismen ihrer späteren Migration und Differenzierung regeln schlecht verstanden. Hier stellen wir in vitro und ex vivo - Strategien EPDC Motilität und Differenzierung zu studieren. Zunächst beschreiben wir ein Verfahren zur primären epikardialen Zellen durch Auswachsen aus der Kultur embryonaler Mäuseherzen erhalten. Außerdem stellen wir ein detailliertes Protokoll dreidimensionale Migration von markierten EPDC in einem Organkultursystem zu bewerten. Wir bieten Beweise für diese Techniken, die genetische Deletion von myocardin bezogenen Transkriptionsfaktoren im Epikard EPDC Migration abschwächt. Dieser Ansatz dient als Plattform Kandidat Modifikatoren der EPDC zu bewertenBiologie und könnte verwendet werden, genetische oder chemische Bildschirme zu entwickeln neuartigen Regulatoren der EPDC Mobilisierung zu identifizieren, die für die Herzreparatur nützlich sein könnten.

Das Epikard effizient sein kann mit einem Auswuchs Kulturtest isoliert durch Ausnutzung seiner äußeren Stelle zu nehmen und die Entwicklungs Plastizität und intrinsische Zugverhalten der EPDC nutzen. Murinen embryonalen Herzen werden bei E11.5 vor epikardialen EMT und kultivierten dorsalen Seite nach unten auf kollagenbeschichteten chamber slides 26 (1A, B) isoliert. Explantierte Herz wird schrumpfen weiter; jedoch wird das Epikard zu der Kollagenmatrix haf...

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Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

8.2K Aufrufe.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility. 

Serie: Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Bewertung der Endothelzellmigration nach der Exposition gegenüber toxischen Chemikalien

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Ex-vivo-Kultur von Schlundbögen auf Herz und Muskelvorläuferzellen und ihre Nische Studieren

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Einrichtung von einem klinisch relevanten<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Kataraktchirurgie Modell zur Untersuchung von epithelialen Wundheilung in einer nativen Mikromilieu

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Ex Vivo Perfusion der Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...