We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N&#176; SFI20111203770 and N&#176; PJA 20131200143.

Not: Şekil 1 protokolünün anahat sunar. Enjeksiyon ve Transplantasyon için iğneler hazırlanması 1. Not: İğneler her zaman hazırlanmış ve saklanabilir. modelleme kil bandında, bir Petri kabındaki tutun. tozdan korumak için parafilm çanak mühür. <ol><li> Enjeksiyon iğneleri, bir mikropipet çektirmesi ile (Malzeme listesine bakınız) (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.58 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin. bunlar koryon delmek için daha etkin olarak kısa ve ince iğneler (yaklaşık 5 mm&#39;lik konik bölümü tercih). Not: Enjeksiyon iğneleri tek kullanımlık vardır. </li><li> Hücre Nakli iğne <ol><li> Mikropipet çektirmenin ile (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.78 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin. </li><li> Uiç çapı (hücre çapından biraz daha transplante edilecek) 35 um olduğu noktada iğne ucu kesilmiş bir microforge (malzemelerin listesine bakınız) şarkı. </li><li> Konik 45 ° &#39;lik açı ile bir microgrinder (Malzeme listesine bakınız) ile kılcal kesim ekstremite. </li><li> İsteğe bağlı olarak, microforge kullanılarak iğnenin ucundaki dikenlere çekin. Bunun için, konik ucu ile sıcak tel dokunun ve hızla embriyo nüfuz yardımcı olabilecek bir çengel oluşturarak, uzak çekin. </li><li> eden bir şınngaya bağlanmış bir iğne tutucu iğne monte edin. şırınga kullanarak, bir cam artıkları ortadan kaldırmak ve daha sonra aseton ile üç kez durulama% 2 hidroflorik asit ile iğne üç kez iç yıkayın. Dikkat: hidroflorik asit toksik, eldiven ile, kaputun altında manipüle. Not: hücre nakli iğneler birkaç kez kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 2. HazırlıkEnjeksiyon ve Hücre Nakli Yemekleri <ol><li> Isı tam güçte 1 dakika boyunca bir mikrodalga agaroz 0.5 g ihtiva eden 11 orta embriyonun 50 mi embriyo ortamda% 1 agaroz alır. yaklaşık 60 ° C&#39;ye kadar agaroz jeli soğutun ve bir 90 mm Petri kabı 50 ml dökün. özel olarak tasarlanmış kalıp (malzeme listesine bakınız) ya enjeksiyon çanak hatları ile ya da hücre nakli yemeğin kuyuların ile jel yüzeyinde yerleştirin. <ol><li> Agaroz çok sıcak değilse, agaroz kalıp şamandıra gözlemleyin. Agaroz jel ayarlandıktan sonra, forseps ile kalıp (- B Şekil 2A) çıkarın. Not: yemekler birkaç haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. kurumayı önlemek için, kapalı ıslak kutuda saklayın. </li></ol></li><li> Kullanmadan önce bir 28 ° C inkübatör 30 dakika çanak yerleştirin. </li></ol> Embriyoların ve Enjeksiyon 3. Koleksiyonu <ol><li> Enjeksiyon solüsyonu hazırlanması Not: Aktin bağlama alanımCherry bağlı gibi LifeAct olarak protein 140 (ABP-140) bağlanma maya aktin çıkıntılı etkinliğini analiz etmek için, hücre içinde polimerize aktin görselleştirmek için kullanılır (ABP140 mCherry olarak da adlandırılır). Aday gen (baskın negatif ya da yapısal olarak aktif bir yapı örneğin mRNA veya morfolino oligonükleotitler) fonksiyonunu test etmek için başka bir bileşik ekleyin. (Şekil 3), biz Morfolino oligonükleotidleri kullanılan sonuç tarif edildiği gibi sin1 fonksiyonlarını değerlendirmek. Bir kontrol olarak, sin1 morfolino ama bu kontrol morfolino hedef RNA&#39;yı eşleşmediğini şekilde dizisi boyunca dağıtılmış 5 nükleotidler denk bir morfolino kullanılır. <ol><li> Çözülme sin1 ve 5-uyumsuzluğu kontrol morpholinos (2 mM stok çözeltileri) ve buz üzerinde ABP140 mCherry mRNA&#39;lar. MRNA 375 ng (75 ng / nihai uL) ve sin1 ya da 5-uyumsuzluğu kontrol morfolino ya da 0.75 ul (0.3 mM nihai) Danieau tampon maddesi (58 mM NaCI, 0.7 mM eklemeKCI, 0.4 mm (3) 2, 5.0 mM HEPES, pH 7.6), 5 ul toplam hacme ulaşmak için, 0.6 mM Ca 4 MgSO. </li></ol></li><li> embriyo Koleksiyon Not: Bu deneysel kurmak için hem donör ve host embriyolar transgenik olan müstakbel prechordal plaka 11 görselleştirmek için goosecoid (GSC) kontrolü destekleyicisi altında GFP ifade. <ol><li> (: GFP gsc) yumurta Tg toplayın. embriyo orta ile dolu bir 90 mm Petri kabı, yaklaşık 80 yumurta yerleştirin ve 28 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Donör Embriyolar enjekte <ol><li> Bir stereomikroskop altında, yavaşça embriyo orta ile dolu bir enjeksiyon çanak satırlara forseps ile toplanan embriyolar sıkın. forseps kullanarak, üste doğru hücrelerle embriyolar yönlendirmek. Embriyolar 4-hücreli sahne (1 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C&#39;de inkübatör enjeksiyon çanak yerleştirin. </li><li> 2 ul bir enjeksiyon iğnesi yükEnjeksiyon çözeltisi. Bir hava Transjektör için (malzeme listesine bakınız), bir mikro-manipülatör yerleştirilir ve politetrafloroetilen (PTFE) tüp (Malzeme listesine bakınız) ile bağlı bir iğne tutucu (malzeme listesine bakınız) içinde iğneyi (malzeme listesini görmek ). </li><li> yavaşça ince forseps ile ucu dokunarak kılcal açın. Gerekirse, kendi ekstremite kısma açık kılcal kesti. </li><li> iğne ile dört hücrelerden birini girin ve hücre hacmi (2 nl)% 70 doldurmak için hücre içinde çözüm enjekte. 30 embriyolar enjekte edilir. Not: Plazma zarı yumuşak olduğu hücrede iğne alma, zor olabilir. hücre ve yumurta sarısı arasında kavşakta hedefleyen iğne penetrasyonu kolaylaştırır. </li><li> onlar küre sahne (4 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C inkübatör embriyolar yerleştirin. </li></ol></li></ol> Hücre transplant için Embriyolar 4. hazırlanmasıiyon <ol><li> 200 ul penisilin / streptomisin (malzeme listesine bakınız) (Pen / Strep EM) ile embriyonun orta 20 ml hazırlayın. </li><li> küre aşamasında embriyo dechorionation (4 saat sonra döllenme) Not: Dechorionated embriyolar çok kırılgan ve hava veya plastik ile temas halinde patlayacak. Dolayısıyla agaroz kaplı tabaklara yerleştirilir ve yangın cilalı cam Pasteur pipetler ile transfer edilmesi gerekir. <ol><li> Bir plastik Pasteur pipeti kullanarak, embriyo ortamda% 1 agaroz ile kaplı ve Pen / Strep EM ile dolu iki adet 35 mm Petri kapları içine adım 3.3 enjekte adım 3.2 toplanan konak embriyolar ve donör embriyolar transfer. iki ayrı yemekler ev sahibi embriyolar ve donör embriyolar tutun. </li><li> Elle ince cımbız (malzeme listesine bakınız) ile chorions embriyolar ayıklayın. </li><li> onlar kalkan sahne (6 saat sonra döllenme) ulaşana kadar 28 ° C inkübatör embriyolar yerleştirin. </li></ol></li></ol>5. Hücre Nakli <ol><li> Hücre Nakli Embriyolar düzenleyin. <ol><li> Bir floresan stereomikroskop altında seçin donör embriyolar kalkan (yeşil) içinde ABP140-mCherry (kırmızı) ifade. </li><li> Bir yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak, Pen / Strep EM ile dolu hücre nakli plakasının gözenekleri içinde embriyo aktarımı. Komşu satırda bir satırda konak embriyolar ve donör embriyolar yerleştirin. </li><li> bir kirpik kullanarak, dikkatle kalkan up ile embriyolar yönlendirmek. Not: Kalkanın pozisyon GFP tarafından değerlendirilir ya da anatomik olabilir. </li></ol></li><li> Transplantasyon Sistemi Kurulumu. Not: Transplantasyon sistemi mikro sürücü ile donatılmış bir Hamilton şırıngaya (malzeme listesine bakın) PTFE tüp (Malzeme listesine bakınız) ve bir tüp konnektörü (Malzeme listesine bakınız) ile bağlantılı bir iğne tutucu oluşur (listeye bakın Malzemelerin). iğne tutucu3-yollu mikromanipülatör üzerine monte edilir (Malzeme listesine bakınız). <ol><li> eden bir şınngaya bağlanmış bir iğne tutucu kullanılarak,% 70 etanol ile hücre transplantasyonu için iğne yıkayın. iğne içine havayı emerek kuru. Bu toz iğne konik kısmında sıkışmış neden olabileceğinden, esen kuru etmeyin. </li><li> yukarı konik, Hamilton şırınga bağlı iğne tutucu iğne takın. </li></ol></li><li> Kalkan-to-kalkan Hücre Transplantasyonu <ol><li> transplantasyon iğne ile donör embriyo kalkanını girin ve ABP140-mCherry etiketli yaklaşık 10-20 hücreleri hazırlamak. Dikkatle sarısı çizim kaçının. </li><li> ev sahibi embriyo kalkanı içine hücreleri nakli. Tüm ev sahibi embriyolar nakledilen kadar tekrarlayın. </li><li> Bir yangın cilalı Pasteur pipeti ile hasarlı embriyolar çıkarın. 28 ° C inkübatör nakledilen embriyoların yerleştirin ve onları yaklaşık 30 dakika süreyle geri verelim. </li><li> Bir iğne kullanarakBir şırınga bağlı tutucu, su ile hücre nakli iğne durulayın ve modelleme kil bandında bir Petri kabındaki geri yerleştirin. parafilm çanak mühür. </li></ol></li></ol> 6. (İSTEĞE BAĞLI) Tek Hücre Nakli Not: nakli iğne tek bir hücre çizmek zor olacak şekilde embriyo, hücreler birbirine yapışır. Biz kolayca tek prechordal plaka progenitör hücreler nakli için modifiye edilmiş bir protokol geliştirmiştir. Fikir transplantasyon öncesinde hücreleri ayırmak etmektir. İzole prechordal plaka progenitör hücrelerin kimliklerini kaybetme eğilimindedir, çünkü biz genetik Sox32 transkripsiyon faktörü yokluğunda, Düğüm sinyalizasyon yolunun aktive ederek, ileriye dönük prechordal plaka kimlik bunları empoze. Biz bu uyarılmış hücreleri, endojen prechordal plaka progenitör hücrelerin 8 gibi davranır doğruladıktan. Aşağıda tek bir hücre nakli gerçekleştirmek için belirli adımlar vardır. hücre dissociation, kalsiyum içermeyen Ringer 11 embriyolar yerleştirerek bir eksplant kesme ve mekanik olarak karıştırılarak elde edilir. <ol><li> Adım 2.1 yerine Embriyo Orta Kalsiyum içermeyen Ringer% 1 agaroz ile nakli yemek hazırlamak. </li><li> Aşama 3.1 &#39;de, ABP140 mCherry RNA ve sin1 morfolino ilave olarak, 2, 3 (nihai 0.6 ng / | il) Düğüm reseptör Taram-A aktif formunu kodlayan RNA&#39;lar ng ve sox32 karşı morfolino 1.25 ul (stok çözeltisi ekleyin mM, dolayısıyla 0.5 mM nihai). </li><li> Aşama 4, transfer yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak Pen / Strep kalsiyumsuz Ringer dolu hücre transplantasyonu için çanak seçilen üç donör embriyolar sonra. ince cımbız ile enjekte hücreleri (ABP140 mCherry etiketli hücreler) içeren bir eksplant teşrih. Hızla embriyoların kalanını atın. </li><li> Hücreler ayırmak kadar bir kirpik ile hafifçe eksplant karıştırın. </li><li> transplantasyon iğne tek bir izole hücre çizinve bir ev sahibi embriyo kalkan içine nakli. </li><li> Bir yangın cilalı Pastör pipeti kullanarak, Pen / Strep EM ile dolu bir agaroz kaplı tabak embriyolar aktarılır. 30 dakika boyunca 28 ° C&#39;de inkübatör içinde embriyo yerleştirin. </li></ol> Montaj 7. Embriyo <ol><li> Görüntüleme Odası <ol><li> Yöntem 1: Bir tarafta 3 mm yüksekliğinde kenarlı 4 delikli (5.5 mm çap), (Şekil 2C - D) ile delinmiş bir plastik slayt (75 x 25 x 0.5 mm) oluşan bir görüntüleme haznesi. siyanoakrilat yapıştırıcı (süper yapıştırıcı) ile arka tarafta bir cam lamel, Tutkal. Not: Deney sonunda, lamel kaldırmak ve zımpara kağıdı ile tutkal artıkları kurtulmak için bir gece suda odasına yerleştirin. </li><li> Yöntem 2: 10 mm delik olan 35 mm Mattek cam alt yemekleri (Malzeme listesine bakınız) kullanın. </li></ol></li><li> embriyo Montaj <ol><li> embriyo ortamda sıcak% 0.2 agaroz 1 ml cam şişe doldurun.ısı blokunda 42 ° C&#39;de tutun. </li><li> Floresan stereomikroskop altında, kırmızı nakledilen hücrelerin yeşil etiketli prospektif prechordal plaka (yani kırmızı nakledilen hücrelerin yeşil prospektif prechordal plaka içindedir, ve hayvan kutup doğru göç başlamıştır) bir parçası olduğu bir embriyo seçin. </li><li> Bir yangın cilalı Pastör pipeti ile agaroz çözeltisi içine seçilen bir embriyo transferi. pipetle embriyo orta fazlalığı atın. agaroz ile pipet embriyo çizmek ve agaroz bir damla yatırılması, görüntüleme odasında embriyo transferi. agaroz ayarlanır önce, bir kirpik ile embriyo yönlendirmek. dik bir mikroskop ile görüntüleme için yukarı muhtemel prechordal plaka yerleştirin veya bir ters mikroskop ile görüntüleme için cam alt. Agaroz odasının yanındaki kuyuda başka embriyo monte etmeden önce (oda sıcaklığına bağlı olarak yaklaşık 1 dakika) ayarlanır kadar bekleyin. Not: Bir görüntüleme chamber 4 kuyu içeren 4 embriyolar kadar montaj sağlar. </li><li> agaroz ayarlandığında, kurumasını önlemek için Pen / Strep EM ile odasını doldurun. </li></ol></li></ol> 8. Canlı Görüntüleme <ol><li> 40X su daldırma uzun menzilli lensi kullanın. GFP görüntü GFP ve mCherry (uygun filtre setleri kullanın:; uyarma BP 470/40, ışın ayırıcı FT 510 ve emisyon BP 540/50 MCherry için: uyarma BP 578/21, ışın ayırıcı FT 596 ve emisyon LP 641 / 75). Görüntü dinamiklerini optimize etmek için poz süresini ayarlayın. </li><li> plaka tüm hücreler görüntü için (ektoderm) prospektif prechordal plaka üzerinde bir kaç mikron başlayan ve (sarısında) prospektif prechordal plaka altında birkaç mikron biten, z-yığınları kazanır. 2 um z-adım kullanın. satın alma hızını optimize etmek için, z-yığınlarının arasında yerine kare arasında renkleri geçiş. Bu yeşil ve kırmızı görüntüler arasında hafif farklılıklara yol açabilir, ancak kesin co beri bir sorun değil: Notyeşil ve kırmızı sinyaller arasındaki -localization gereklidir. Işık daha fazla görüntüleme süresi ve maruziyeti azaltmak için, yeşil yalnızca bir kez prechordal plaka progenitör hücreleri tanımlamak için yeterlidir her 5 kez puan elde edilebilir. </li><li> çıkıntı sıklığını ve yönünü analiz etmek gereklidir iki dakikalık bir zaman aralığı içinde 4 embriyolar, görüntü gibi ayarları kullanma. çıkıntı ömür boyu analizi için, yüksek zaman çözünürlüğü elde etmek için 30 saniye zaman aralığını azaltmak. % 80 epiboly% 60 epiboly görüntü. </li></ol> 9. Hücre Dinamiği Analizi <ol><li> ImageJ 4D görüntüleri yüklemek Not: edinimi için kullanılan yazılıma bağlı olarak, görüntüler farklı biçimlerde saklanır (görüntü başına bir dosya, z-yığınının başına bir dosya, bütün deney için bir dosya). Bazı ImageJ Eklentiler 4D yığınları açmak için online olarak hazırdır. Bizim verilerimiz z-yığınının başına bir dosya olarak saklanır. Veri kümesi büyük olduğundan, bunun sadece bir kısmını (bazı tim açmak için uygun olabilire noktaları, ya da z-yığını veya 8-bit bir Subpart) ... görüntüleri dönüştürülür. Biz talep üzerine dağıtmak için mutlu olurdu ki, bunu yapmak için bir ısmarlama ImageJ eklenti kullanmak. </li><li> Yönlendirme ve analizi Hücre çıkıntıların sıklığı <ol><li> prospektif prechordal plaka göçün ana yönünü belirlemek için GFP görüntüleri kullanın. Hücre çıkıntılar açı ölçümleri için bir referans olarak alır. Bu referans yönü görüntünün bir tarafına paralel olacak şekilde, yığın döndürün. </li><li> Bir hücre izleyin. Seç açı aracı. Her kare ve her çıkıntı için, çıkıntı ve referans yönü (Şekil 3A) arasındaki açıyı ölçmek için açı aracını kullanın. (Klavyede basın veya M) değeri saklamak için ölçün / Analiz komutunu kullanın. bir txt dosyası olarak sonuçları kaydedin. Bir sonraki hücreye ile tekrarlayın. </li><li> histogramlar olarak R ve arsa açısı dağılımı veri almak. Farklı koşullar karşılaştırmak için Kolmogorov-Smirnov testi (R ks.test) kullanın. Not: açı aracı klasik istatistiksel testler ve dairesel değil testlerin kullanımına izin veren, 0 ° ve 180 ° arasını kapsayan değerler sağlar. </li><li> Bu veri seti ile, dakikada hücre başına uzantı sayısı emisyon frekansı hesaplayabilir. Kullanım Student t-testi (R t.test) farklı koşullar karşılaştırmak için. </li></ol></li><li> Hücre Çıkıntılar ömür boyu analizi <ol><li> Her hücre ve her çıkıntı, ölçü çıkıntı süresi (çıkıntı kareler arasında mevcut x zaman aralığıdır sırasında kare sayısı) için. </li><li> Farklı koşullar karşılaştırmak için R. Kullanım Student T-testi (R t.test) veri almak. Not: Diğer göç özellikleri hücre göçü karakterize etmek amacıyla analiz ilginç olabilir. Bu hız, yön ve sebat ölçümleri veya hücre morfolojisi, hücre parçaları içerir. Bazı ticari yazılım uygulamaları bu özellikleri ölçmek için kullanılabilir, ancak açık kaynak yazılım başvurunun çok sayıdaÖrneğin morphodynamics 12 analiz etmek ADAPT olarak katyonlar ve ImageJ eklentileri de mevcuttur, diper göç 14 sırasında hücre sınırlarını izlemek için hücre yörüngeleri ve yön kalıcılık 13, CellTrack bakmak için. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration.">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+cell+migration:+A+multiscale+tuning+model.">Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model.</a> Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).</li><li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+in+morphogenesis,+regeneration+and+cancer.">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).</li><li>Dang, I., Gorelik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. , (2013).</li><li>Dumortier, J. G., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TORC2+Component,+Sin1,+Controls+Migration+of+Anterior+Mesendoderm+during+Zebrafish+Gastrulation.">The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation.</a> Plos One. 10, e0118474 (2015).</li><li>Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+things:+cell+fates+and+cell+movements+during+early+embryogenesis+of+zebrafish.">Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish.</a> BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).</li><li>Ulrich, F., Concha, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slb/Wnt11+controls+hypoblast+cell+migration+and+morphogenesis+at+the+onset+of+zebrafish+gastrulation.">Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation.</a> Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).</li><li>Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+mesendoderm+migration+relies+on+an+intrinsic+directionality+signal+transmitted+through+cell+contacts.">Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).</li><li>Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+signaling+patterns+the+organizer.">Nodal signaling patterns the organizer.</a> Development. 127 (5), 921-932 (2000).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Gorelik, R., Gautreau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+unbiased+analysis+of+directional+persistence+in+cell+migration.">Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).</li><li>Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellTrack:+An+open-source+software+for+cell+tracking+and+motility+analysis.">CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis.</a> Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).</li><li>Tahinci, E., Symes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+functions+of+Rho+and+Rac+are+required+for+convergent+extension+during+Xenopus+gastrulation.">Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation.</a> Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).</li><li>Zhang, T., Yin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat3-Efemp2a+modulates+the+fibrillar+matrix+for+cohesive+movement+of+prechordal+plate+progenitors.">Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors.</a> Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).</li><li>Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).</li><li>Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li><li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein:+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology.">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li><li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells.">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol, in vivo olarak, canlı görüntüleme hücre transplantasyonu ile kimerik embriyo oluşturulmasını birleştirerek hücre göçü bir aday genin rolünü araştırmak için kolay bir yol sunar. mozaik embriyoların Yaratılış Bir hücrenin dinamiklerini incelenmesi sitoplazmik uzantıları analiz etmek onun konturu görselleştirme gerektirir. böylece iyi bir görsel kontrast sunan, çevre - ya da farklı etiketli - Bu bir başka etikets...

Çok hücreli organizmalarda, hücre göçü bu doku ve organların içine hücreleri organizasyonunu sağlayan embriyonun gelişimi için ve doku homeostazında (yara iyileşmesi) ve bağışıklık yer alır erişkin yaşamda, hem esastır. Bu fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, hücre göçü, kanser metastazı, dahil olmak üzere, özellikle de çeşitli patolojik durumlarda, katılır. Hücre göçü düz yüzeylere hücre hareketlerini sağlayan moleküler mekanizmaların genel bir anlayış sağlayarak, yıllardır in vitro analiz edilmiştir. Vivo Bununla birlikte, hücreler daha karmaşık bir çevre tarafından karşı karşıya kalırlar. Açık bir şekilde taşıma kılavuz hücreleri ya da salgılanan kemokinler, komşu gibi hücre dışı matris olarak bir organizma içindeki geçiş dış işaretlere etkilenebilir geçmiş yıllarda ortaya çıkan ve bu tarif edilmiştir ne değişebilir hücre göçü tahrik mekanizmaları &lt;em&gt; in vitro 1,2. Vivo hücre göçü temin eden mekanizmaların in vitro çalışmalar ile karşılaştırıldığında, esas olarak, çünkü artan teknik zorluk, şimdiye kadar daha az ilgi görmüştür. In vivo özellikle hücre göçü analizi göç hücrelere doğrudan optik erişim gerektiren, benzersiz hücreleri etiketlemek için teknikler kendi dinamiklerini ve morfolojisi yanı sıra kazanç veya fonksiyon kaybını görmek için aday genlerin rolü test etmek için yaklaşımlar. Şimdiye kadar, bu özellikleri barındıran bir kaç model sistemler vivo hücre göçü 3 incelemek için kullanılmıştır. Biz son zamanlarda vivo hücre göçü 4,5 yılında kontrolünde aday genlerin fonksiyonunu değerlendirmek için yeni bir uygun model sistem olarak erken Zebra balığı embriyolarının prospektif prechordal plaka göç kullanılır. (Aynı zamanda, ön mesendoderm olarak da bilinir) Aday prechordal plakası Gast başlangıcında oluşturan hücrelerin bir grup olduğuEmbriyonun sırt tarafında rulation. Gastrulasyon sırasında bu grup topluca Notokordun için prechordal plaka, bir mesendodermal kalınlaşma, anterior oluşturur ve nöral plakayı altta yatan, embriyo 6-8 hayvan kutup doğru göç eder. Posterior kısmı muhtemelen mezoderm 9 kafa katkıda iken prechordal plaka ön kısmı, kuluçka bezinin yol açacaktır. dış gelişme ve balık embriyo optik berraklık sayesinde, hücre göçü, doğrudan ve kolay bir yapı görülür. Hücre nakli mozaik embriyoların 10 hızlı ve kolay yaratılması için izin veren çok güçlü bir tekniktir. İzole hücrelerin etiketleme nakledilen hücrelerin sonuçlarında floresan sitoskeletal belirteçleri ifade, morfolojisi ve dinamikleri olan kolaylıkla görülebilir. kayıp veya fonksiyon kazancı bu birleştiren izinlerin bir kutu hücre özerk fonksiyonların analizi yaklaşımlarıdidate geni. Sunulan protokol in vivo 5 hücre göçü ve aktin dinamiklerini kontrol TORC2 bileşeni sin1 işlevini değerlendirildi açıklamaktadır. Sonuçlar belirtilen ve daha fazla ele alındığı gibi Ancak, in vivo olarak, hücre göçü kontrol herhangi bir aday genin potansiyel implikasyonları analiz etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&amp;nbsp;mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>standard thickness</td></tr><tr><td>Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>thin-walled</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&amp;nbsp;000&amp;nbsp;units penicillin and 10&amp;nbsp;mg streptomycin per ml</td></tr><tr><td>fine tweezers</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Air transjector</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (for injection)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (for cell transplantation)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton Syringe</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Transplantation mold</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Tube connector</td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE tubing</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing in vivo cell migration using cell transplantations and time-lapse imaging in zebrafish embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Sunulan teknik vivo hücre göçü kontrol, sin1, Tor karmaşık 2 (TORC2) çekirdek bileşenlerinden biri rolünü analiz etmek için kullanıldı. hücre nakli kullanımı izole hücreler ve hücre özerk etkilerinin analizi etiketleme izin verir. Film S1 nakledilen prechordal plaka progenitör hücrelerin göçünü gösteriyor. ABP140 ile Aktin etiketleme aktin zengin sitoplazmik uzantıların kolay görüntüleme sağlar. Biz onların sıklığını ve yönünü ö...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos at JoVE.com

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

analyzing-vivo-cell-migration-using-cell-transplantations-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

7.6K Görüntüleme.  IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure. Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration. 

Video: Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Gelişim Biyolojisi

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Biyoloji

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Verimli In Vivo Tümör Çalışmaları için Larva Zebra Balığının Kullanılması

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Yazar Spotlight: Zebra Balıklarında Tümör Ksenotransplantasyonu Kullanarak Kanser Terapötiklerini İlerletmek

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Kanser Araştırmaları

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Analiz

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme