We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N&#176; SFI20111203770 and N&#176; PJA 20131200143.

참고도 1은이 프로토콜의 개요를 제시한다. 사출 및 이식의 바늘 1. 준비 주 : 바늘 언제든지 준비되고 저장 될 수있다. 모델링 점토의 밴드에, 페트리 접시에 보관하십시오. 먼지로부터 보호하기 위해 파라 필름으로 접시를 밀봉합니다. <ol><li> 주사 바늘의 경우, 마이크로 피펫 풀러와 (재료의 목록 참조) (필라멘트 (재료의 목록 참조)하지 않고, 직경 0.58 mm 내부 직경 1.0 mm 외부) 유리 모세관을 당기십시오. 그들은 융모막을 관통 더 효율적으로 짧고가는 바늘 (약 5mm의 테이퍼 부분)을 선호한다. 주 : 주사 바늘은 일회용이다. </li><li> 세포 이식을위한 바늘 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러와 (필라멘트 (재료의 목록 참조)하지 않고, 직경 0.78 mm 내부 직경 1.0 mm 외부) 유리 모세관을 당겨. </li><li> 유내부 직경 (셀 직경보다 약간 더 이식 함)이 35㎛이고 시점에서 바늘의 선단을 절단하는 microforge (재료의 목록 참조) 노래. </li><li> 경사 45 °의 각도와 microgrinder (재료의 목록 참조)와 모세관의 절단 사지. </li><li> 선택적으로, microforge를 사용하여 바늘 끝에 미늘을 당긴다. 이를 위해, 베벨의 팁 뜨거운 필라멘트을 터치하고 빠르게 배아를 관통 도움을 줄 수있는 미늘을 만들어, 그것을 멀리 당기십시오. </li><li> 주사기에 부착 된 바늘 홀더에 바늘을 탑재합니다. 주사기를 사용하여, 유리 잔류 물을 제거하고, 아세톤으로 3 회 씻어 2 % 불산 바늘 세번의 내부를 헹군다. 주의 : 불산은 독성이, 장갑, 후드 조작 할 수 있습니다. 주 : 세포 이식 바늘을 여러 번 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 의 2. 준비사출 및 세포 이식 용 식기 <ol><li> 열 전체 전력에서 1 분 동안 전자 레인지에 아가로 오스 0.5 g을 포함 11 매체 배아의 50 ml의 배아 매체에 1 % 아가로 오스를 얻을 수 있습니다. 약 60 ° C의 아가 로스 겔 쿨하고 90mm 페트리 접시에서 50 ㎖를 붓는다. 특별히 고안된 금형 (물질의 목록 참조), 중 사출 요리 라인 또는 세포 이식의 요리 우물과 겔의 표면에 놓습니다. <ol><li> 아가로 오스가 너무 뜨겁지 않은 경우, 아가로 오스의 금형 플로트를 관찰한다. 아가로 오스 겔을 설정 한 후, 집게와 금형 (- B 그림 2A)를 제거합니다. 참고 : 요리는 몇 주까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 건조를 방지하기 위해 밀폐 된 습식 상자에 보관하십시오. </li></ol></li><li> 사용하기 전에 28 ° C 배양기 30 분에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 태아 및 사출 3. 컬렉션 <ol><li> 사출 솔루션 준비 참고 : 액틴 결합 도메인mCherry 결합 등 Lifeact 같은 단백질 140 (ABP-140)를 결합 효모 액틴의 돌출 활성을 분석하기 위하여, 세포 내에서 중합 액틴을 시각화하기 위해 사용된다 (ABP140-mCherry을 함). 후보 유전자 (지배 부정 또는 구조적으로 활성 구조의 예를 들어 mRNA의, 또는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드)의 기능을 테스트하기 위해 다른 화합물을 추가합니다. (도 3), 우리는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 사용한 결과에 기재된 Sin1의 기능을 평가한다. 대조군으로서, 우리는 sin1의 모르 폴리 노에 있지만 제어 모르 대상 RNA 일치하지 않도록 순서를 따라 분포 5 뉴클레오티드 동일 모르 폴리 노를 사용 하였다. <ol><li> 해동 sin1 및 5 불일치 제어 morpholinos (2 MM의 재고 솔루션), 얼음에 ABP140-mCherry의 mRNA. 의 mRNA의 375 NG (75 NG / 최종 μL) 및 sin1 또는 5 불일치 제어 모르 폴리 노 중 하나의 0.75 μL (0.3 mM의 최종) Danieau 버퍼 (58 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터에 추가의 KCl, 0.4 mm의 (NO 3) 2, 5.0 mM의 HEPES pH를 7.6), 5 ㎕의 총 부피에 도달하는, 0.6 mM의 칼슘을 황산 4. </li></ol></li><li> 배아 컬렉션 참고 :이 실험은 설정 모두 기증자와 호스트 배아는 유전자 변형이며, 장래 prechordal 플레이트 (11)를 시각화하기 위해 상기 goosecoid (GSC)의 제어 발기인에서 GFP를 표현. <ol><li> (: GFP GSC) 계란의 Tg를 수집합니다. 배아 매체 가득 90mm 페트리 접시에 약 80 알을 놓고 28 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 기증자의 배아를 주입 <ol><li> 실체 현미경에서 부드럽게 배아 매체 가득 사출 접시의 라인에 집게로 수집 된 배아를 짠다. 집게를 사용하여, 상부를 향해 세포 배아를 배향. 배아는 4 셀 단계 (1 시간 게시물 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C에서 인큐베이터에 주입 접시를 놓습니다. </li><li> 2 μL와 주사 바늘을로드주입 솔루션입니다. 공기 transjector에 (물질의 목록 참조) 마이크로 매니퓰레이터에 넣고 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 튜브 (재료의 목록 참조)에 연결된 바늘 홀더 (물질의 목록 참조)에 바늘을 삽입 (재료의 목록을 보려면 ). </li><li> 부드럽게 미세 집게로 끝을 터치하여 모세 혈관을 엽니 다. 필요한 경우, 그 말단을 곤란에 의해 열린 모세관을 잘라. </li><li> 바늘로 4 개의 셀 중 하나를 입력하고, 셀 체적 (2 NL)의 70 %를 채우기 위해 셀 내의 용액을 주입. 30 배아를 주입한다. 주 : 원형질막 소프트와 같이 셀의 바늘을 얻기 어려울 수있다. 셀과 노른자 사이의 접합을 목표로하는 것은 바늘 침투를 용이하게한다. </li><li> 그들은 구 단계 (4 시간 후 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C 배양기에서 배아를 놓습니다. </li></ol></li></ol> 셀 Transplantat의 배아 4. 준비이온 <ol><li> 200 μL 페니실린 / 스트렙토 마이신 (물질의 목록 참조) (펜 / 연쇄상 구균 EM)와 배아 매체의 20 ㎖를 준비합니다. </li><li> 구 단계에서 배아의 Dechorionation (4 시간 후 수정) 참고 : Dechorionated 배아 매우 깨지기하고 공기 또는 플라스틱과 접촉시 폭발 할 것입니다. 따라서 그들은 아가 코팅 접시에 넣고, 화재 연마 유리 파스퇴르 피펫으로 전달 될 필요가있다. <ol><li> 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아 매체에 1 % 아가 로스 코팅과 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득이 35mm 배양 접시에 단계 3.3에서 주입 단계 3.2에서 수집 호스트 배아 기증자의 배아를 전송합니다. 두 개의 요리 호스트 배아 기증자의 배아를 유지합니다. </li><li> 수동으로 미세 핀셋 (물질의 목록 참조)과의 chorions에서 배아를 추출합니다. </li><li> 그들은 방패 단계 (6 시간 게시물 수정)에 도달 할 때까지 28 ° C를 인큐베이터에서 배아를 놓습니다. </li></ol></li></ol>5. 세포 이식 <ol><li> 세포 이식을위한 배아를 정렬합니다. <ol><li> 형광 실체 현미경에서 선택 기증자의 배아는 실드 (녹색) 내에서 ABP140-mCherry (적색)을 표현. </li><li> 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득 세포 이식 접시의 우물에서 배아를 전송합니다. 이웃 행 한 행의 호스트 배아 및 기증자의 배아를 놓습니다. </li><li> 속눈썹을 사용하여 조심스럽게 방패 위로 배아의 방향. 주 : 실드의 위치는 GFP 발현에 의해 평가 또는 해부학 적으로 될 수있다. </li></ol></li><li> 이식 시스템 설정입니다. 참고 : 이식 시스템은 마이크로 드라이브가 장착 된 해밀턴 주사기 (물질의 목록 참조) PTFE 튜브 (재료의 목록 참조) 및 튜브 커넥터 (재료의 목록 참조)에 연결된 바늘 홀더로 구성되어있다 (목록 참조 재료). 바늘 홀더3 방향 미세 조작기에 장착된다 (재료의 목록 참조). <ol><li> 주사기에 부착 된 바늘 홀더를 사용하여, 70 % 에탄올로 세포 이식 바늘을 헹군다. 바늘로 공기를 흡입하여 건조. 이 먼지는 바늘의 테이퍼 부분에 갇히지 될 수 있으므로, 불어 건조하지 마십시오. </li><li> 위쪽으로 베벨과, 해밀턴 주사기에 연결된 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다. </li></ol></li><li> 방패에 방패 세포 이식 <ol><li> 이식 바늘로 기증자 배아의 방패를 입력하고 ABP140-mCherry 표지에 대한 10 ~ 20 세포를 그립니다. 조심스럽게 노른자 그리기 마십시오. </li><li> 호스트 배아 실드에 세포를 이식. 모든 호스트 배아가 이식 될 때까지 반복합니다. </li><li> 화재 연마 파스퇴르 피펫으로 손상된 배아를 제거합니다. 28 ° C에서 인큐베이터에 이식 된 배아를 배치하고 약 30 분 동안 복구 할 수 있습니다. </li><li> 바늘을 사용하여주사기에 부착 된 홀더, 물을 세포 이식 바늘을 씻어 모델링 점토의 밴드에 페트리 접시에 다시 배치합니다. 파라 필름으로 접시를 밀봉합니다. </li></ol></li></ol> 6. (선택 사항) 단일 세포 이식 참고 : 이식 바늘 하나의 셀을 그리기 어려워되도록 배아 세포는 서로 부착. 우리는 쉽게 하나의 prechordal 판 전구 세포를 이식하는 수정 된 프로토콜을 개발했다. 아이디어는 이전에 이식에 세포를 떼어 놓다하는 것입니다. 격리 판 prechordal 전구 세포들의 신원을 잃는 경향이 있기 때문에, 우리는 유전 Sox32 전사 인자의 부재하에, 절점 신호 전달 경로를 활성화하여, 장래 prechordal 판 신원을 부과. 우리는이 유도 된 세포가 내인성 prechordal 판 전구 세포 (8)처럼 행동 것을 확인했습니다. 아래는 하나의 세포 이식을 수행 할 수있는 특정 단계가있다. 셀 dissocia기 칼슘 프리 링거 11 배아 배치 체외 이식편 해부 기계적으로 교반함으로써 달성된다. <ol><li> 2.1 단계에서 대신 배아 중간의 칼슘 무료 벨소리 1 % 아가로 오스와 이식 요리를 준비합니다. </li><li> 3.1 단계에서, ABP140-mCherry RNA와 sin1 모르 폴리 노 이외에, 2에서 3 (최종 0.6 NG / μL) 마디 수용체 Taram-A의 활성 형태를 코딩하는 RNA를의 NG 및 sox32에 대한 모르 폴리 노의 1.25 μL (원액을 추가 밀리미터, 따라​​서 0.5 mM의 최종). </li><li> 4 단계, 전송 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여 펜 / 패 혈성 칼슘 무료 벨소리로 가득 세포 이식에 대한 접시에 세 가지 선택 기증자의 배아 후. 미세 핀셋, 주입 된 세포 (ABP140-mCherry 표지화 된 세포)를 함유하는 이식편 해부. 빠르게 배아의 나머지 부분을 폐기합니다. </li><li> 세포가 해리까지 속눈썹으로 부드럽게 이식편을 저어. </li><li> 이식 바늘에 하나의 고립 된 셀을 그립니다및 호스트 배아 실드로 이식. </li><li> 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 펜 / 연쇄상 구균 EM 가득 아가로 오스 - 코팅 접시에 배아를 전송합니다. 30 분 동안 28 ° C에서 인큐베이터에서 배아를 놓습니다. </li></ol> 설치 7. 배아 <ol><li> 영상 상공 회의소 <ol><li> 방법 1 : 한쪽 3mm 높은 가장자리 4 홀 (5.5 mm 직경), (그림 2C - D)을 관통 플라스틱 슬라이드 (75 * 25 * 0.5 mm)로 구성된 영상 실을 사용합니다. 시아 노 아크릴 레이트 접착제 (슈퍼 접착제)과 뒷면 유리 커버 슬립을 붙인다. 참고 실험의 마지막에, 커버 슬립을 제거하고 모래 종이 접착제 잔기 없애 하룻밤 동안 물에 챔버를 배치했다. </li><li> 방법 2 : 10mm 구멍 35mm 매텍 유리 바닥 요리 (재료의 목록을 참조)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 배아 실장 <ol><li> 배아 매체의 뜨거운 0.2 % 아가로 오스 1 ml의 유리 병을 채 웁니다.열 블록에 42 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 형광 실체 현미경에서 빨간색 이식 된 세포가 녹색으로 표시된 예상 prechordal 판 (즉, 빨간색 이식 된 세포가 녹색 미래의 prechordal 판에서, 그리고 동물 극으로 이주 시작)의 일부있는 배아를 선택합니다. </li><li> 화재 연마 파스퇴르 피펫 아가로 오스 솔루션으로 선택된 배아를 전송합니다. 피펫으로부터 배아 매체의 과잉 버린다. 아가로 피펫 배아을 그리고 아가 방울을 증착 촬상 챔버 배아 옮긴다. 아가로 오스가 설정되기 전에, 속눈썹과 배아의 방향. 직립 현미경으로 이미징 위쪽으로 예상 prechordal 플레이트를 배치, 또는 거꾸로 현미경 이미징의 유리 바닥에. 아가로 오스는 챔버의 다음 물론 다른 배아를 설치하기 전에 (실내 온도에 따라 약 1 분) 설정 될 때까지 기다립니다. 참고 : 영상의 차를mber 4 우물을 포함하는 4 배아까지 장착 할 수 있습니다. </li><li> 아가로 설정하면 건조를 피하기 위해 펜 / 스트렙토 EM과 상기 챔버를 채운다. </li></ol></li></ol> 8. 라이브 영상 <ol><li> 40 배의 물에 침수 장거리 렌즈를 사용합니다. GFP에 대한 이미지 GFP 및 mCherry (적절한 필터 세트를 사용하여, 여기 BP 40분의 470, 빔 스플리터 FT (510), 및 배출 BP의 50분의 540 mCherry에 대한 : 여기 BP 21분의 578, 빔 스플리터 FT (596), 및 배출 LP 641 / 75). 상 동성을 최적화하기 위해, 노광 시간을 조정한다. </li><li> 접시에 모든 셀 이미지 (외배엽)에서 예상 prechordal 판 위의 몇 μm의 시작 (노른자)에서 예상 prechordal 판 아래에 몇 μm의 끝, Z-스택을 취득. 2 ㎛의 Z-단계를 사용합니다. 수집 속도를 최적화하기 위해, Z-스택 사이가 아닌 프레임 사이에 색상을 전환 할 수 있습니다. 이 녹색과 빨간색 이미지 사이에 약간의 차이가 발생할 수 있지만 정확한 공동 이후 문제가되지 않습니다 참고 :녹색과 빨간색 신호 사이의 -localization가 필요합니다. 광에 상기 촬상 시간의 노출을 줄이기 위해, 녹색 번만 prechordal 플레이트 전구 세포를 식별하기에 충분한 시간마다 5 포인트를 획득 할 수있다. </li><li> 돌기 주파수와 방향을 분석 할 필요가있는 2 분의 시간 간격 내에서 4 배아, 화상 등의 설정을 사용. 돌기 수명의 분석을 위해, 더 높은 시간 해상도를 얻기 위해 30 초까지의 시간 간격을 감소시킨다. 80 % epiboly에 60 % epiboly에서 이미지. </li></ol> 9. 세포 역학 분석 <ol><li> ImageJ에있는 4D 이미지를로드 참고 : 인수에 사용되는 소프트웨어에 따라, 이미지가 다른 형식으로 저장됩니다 (이미지 당 하나의 파일, Z-스택 당 하나의 파일, 전체 실험에​​ 대한 하나의 파일). 일부 ImageJ에의 플러그인 4D 스택을 열 온라인으로 사용할 수 있습니다. 우리의 데이터는 Z-스택 당 하나의 파일로 저장됩니다. 데이터 셋이 커질 수 있기 때문에, 그것의 일부 (일부 팀을 열 편리 할 수​​있다E 지점 또는 Z - 스택, 또는 8 비트의 서브 파트는) ... 이미지 변환된다. 우리는 우리가 요청에 배포 행복 할 것이다, 그렇게하기 위해 주문 제작 ImageJ에 플러그인을 사용합니다. </li><li> 오리엔테이션의 분석 및 세포 돌기의 주파수 <ol><li> 미래의 prechordal 판 이주의 주요 방향을 결정하기 위해 GFP 이미지를 사용합니다. 세포 돌기 각도 측정을위한 기준으로서 이것을 가지고. 이 기준 방향은 화상의 한쪽면에 평행하도록 스택을 돌린다. </li><li> 하나의 셀을 따르십시오. 선택 각 도구입니다. 각 프레임의 각 돌출부를 들어, 돌출부와 기준 방향 (도 3a) 사이의 각도를 측정하는 각도 도구를 사용한다. (키보드를 누르거나 M) 값을 저장하기 위해 측정 / 분석 명령을 사용하십시오. TXT 파일로 결과를 저장합니다. 다음 셀 반복합니다. </li><li> 히스토그램과 같은 R과 플롯의 각도 분포로 데이터를 가져옵니다. 다른 조건을 비교하기 위해 콜 모고 로프 - 스 미르 노프 테스트 (R에 ks.test)를 사용합니다. 주 : 각 도구 고전 통계적 테스트 원형없는 테스트의 사용을 허용, 0 °와 180 ° 사이에 포함 된 값을 제공한다. </li><li> 이 데이터 세트 분당 셀당 돌기의 수가 발광 주파수를 계산한다. 사용 학생 T-테스트 (R에 t.test는) 다른 조건을 비교합니다. </li></ol></li><li> 셀 돌출부 수명의 분석 <ol><li> 각 셀에 각각 돌출, 측정 돌기 기간 (돌출부 프레임 사이에 X 시간 간격 동안 프레임 수)를 참조하십시오. </li><li> 다른 조건을 비교 R. 사용 학생 T-테스트 (R에 t.test)에 데이터를 가져옵니다. 참고 : 다른 마이그레이션 기능은 세포 이동을 특성화하기 위해 분석하는 흥미로운 일이 될 수 있습니다. 이 속도, 방향과 지속성 측정, 또는 세포 형태에 대한 세포 트랙을 포함한다. 일부 상용 소프트웨어 응용 프로그램은 이러한 기능을 측정 할 수 있지만, 오픈 소스 소프트웨어 어플리 많은 수의예를 들어 morphodynamics (12)를 분석에 적응으로 양이온과 ImageJ에의 플러그인도 사용할 수 있습니다 DiPer 마이그레이션 14시 셀 경계를 추적하는 세포 궤적과 방향 지속성 (13), CellTrack 볼 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin.">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).</li><li>Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+protrusion+and+polarity+by+PI3K+during+neutrophil+motility+in+live+zebrafish.">Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish.</a> Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).</li><li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis.">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li><li>Johnson, H. W., Schell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+IP3+3-kinase+is+an+F-actin-bundling+protein:+role+in+dendritic+targeting+and+regulation+of+spine+morphology.">Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology.</a> Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).</li><li>Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+retrograde+flow+and+actomyosin+II+arc+contraction+drive+receptor+cluster+dynamics+at+the+immunological+synapse+in+Jurkat+T+cells.">Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 생체 내에서 라이브 영상으로 세포 이식을 사용하여 키메라 배아의 생성을 결합하여 세포 이동의 후보 유전자의 역할을 연구하는 쉬운 방법을 제공합니다. 모자이크 배아의 생성 셀의 역학을 공부하는 것은 세포질 확장을 분석하기 위해 형상의 시각화가 필요합니다. 따라서 좋은 시각적 대비를 제공하고, 환경 - 또는 다르게 표시 ...

다세포 생물에서, 세포 이동은, 조직 및 기관에 대한 세포의 조직을 보장 배아의 발달과 그 조직의 항상성 (상처 치유) 및 내성에 참여한다 성인기에 대해 모두 필요하다. 이러한 생리 기능에 더하여, 세포 이동은 암 전이를 포함한 특정의 다양한 병리학 적 상황에 참여하고있다. 세포 이동은 평평한 표면에 세포의 움직임을 보장하는 분자 메커니즘의 전반적인 이해를 제공, 수십 년 동안 시험관에서 분석하고있다. 생체 내에서 그러나, 세포는 더 복잡한 환경에 직면하고 있습니다. 명확하게 마이그레이션을 안내 세포 분비 케모카인 이웃, 같은 세포 외 매트릭스 유기체 내에서 마이그레이션이 외부 단서에 의해 영향을받을 수 있다는 것을 지난 몇 년에 등장하고, 그 설명 된 내용과 다를 수 있습니다 세포 이동을 구동 메커니즘 &lt;EM&gt; 체외 1,2. 생체 내 세포의 이동에 보장 메커니즘은 체외 연구에 비해, 주로 인해 증가 된 기술적 인 어려움 때문에 훨씬 적은 관심을 받았다. 생체 특히 세포 이동의 분석 이주 세포에 직접 광 액세스를 필요로 독특한 셀 라벨을 기술 그 동역학 및 형태뿐만 아니라, 이득 또는 기능의 상실을보고하기 위해 후보 유전자의 역할을 테스트하기 위해 접근한다. 지금까지, 이러한 특성을 보유하는 몇 모델 시스템은 생체 내 세포 이동 (3)에 절개하는데 사용되어왔다. 최근 생체 세포의 이동의 제어에 4,5- 후보 유전자의 기능을 평가하기 편리한 새로운 모델 시스템으로 초기 제브라 피쉬 배아 예상 prechordal 플레이트의 이동을 사용 하였다. (또한 전방 mesendoderm라고도 함) 유망 prechordal 플레이트 가스트의 발병에 형성하는 셀 그룹배아의 등쪽면에 rulation. 낭배 동안이 그룹은 공동으로 척색에 prechordal 판, mesendodermal 비후, 전방을 형성하고, 신경 판을 기본에, 배아 6-8의 동물 극으로 이동한다. 그 후방 부분은 가능성이 중배엽 (9) 머리에 기여하면서 prechordal 판의 앞쪽 부분은 부화 선을 야기 할 것이다. 외부 개발 및 어류 배아의 광학 투명도 덕분에, 세포의 이동이 직접적으로 쉽게 구조에서 관찰 될 수있다. 세포 이식은 모자이크 배아 (10)의 신속하고 쉽게 만들 수 있습니다 매우 강력한 기술이다. 분리 된 세포의 라벨에 이식 된 세포 결과에 형광 세포 골격 마커를 표현, 형태 및 역학있는 쉽게 관찰 할 수있다. 손실 함수의 게인이 결합은 허용에게 전지 캔의 자율 기능의 분석 접근didate 유전자. 제시된 프로토콜은 우리가 생체 5 세포 이동 및 굴지 역학을 제어에 TORC2 구성 요소 Sin1의 기능을 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 결과를 상기에 언급 된 바와 같이하지만, 이는 생체 내에서 세포의 이동을 제어하는 후보 유전자의 잠재적 의미를 분석하기 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58&amp;nbsp;mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>standard thickness</td></tr><tr><td>Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300085</td><td>thin-walled</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>10&amp;nbsp;000&amp;nbsp;units penicillin and 10&amp;nbsp;mg streptomycin per ml</td></tr><tr><td>fine tweezers</td><td>Dumont Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>5F</td></tr><tr><td>glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Air transjector</td><td>Eppendorf</td><td>5246</td><td></td></tr><tr><td>Micro-forge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder</td><td>Narishige</td><td>EG-44</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (for injection)</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (for cell transplantation)</td><td>Leica</td><td>Leica Micromanipulator</td><td></td></tr><tr><td>Hammilton Syringe</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Transplantation mold</td><td>Adapative Science Tools</td><td>PT-1</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td></td></tr><tr><td>Tube connector</td><td>Narishige</td><td>CI-1</td><td></td></tr><tr><td>PTFE tubing</td><td>Narishige</td><td>CT-1</td><td></td></tr></tbody></table>

analyzing in vivo cell migration using cell transplantations and time-lapse imaging in zebrafish embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

제시된 기법은 생체 내 세포 이동의 제어에 Sin1 상기 토 착체 2 (TORC2)의 핵심 구성 요소 중 하나의 역할을 분석 하였다. 세포 이식의 사용은 분리 된 세포 및 세포 자율 효과 분석 라벨을 허용한다. 영화 S1은 이식 prechordal 판 전구 세포의 이동을 보여줍니다. ABP140와 굴지의 표시는 굴지 풍부한 세포질 돌기 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 우리는 그들의 주파수와 ?...

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Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

분석<em&gt; 생체</em&gt; 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

7.6K 조회수.  IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure. Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration. 

비디오: Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

생물학

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

효율적인 In Vivo 종양 연구를 위한 유충 제브라피시 활용

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

저자 스포트라이트: 제브라피시에서 종양 이종장기이식을 사용한 암 치료의 발전

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

암 연구학

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

분석

요약

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살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

개발 Zebrafish의 표피에서 세포 압출의 라이브 영상