This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).

fareler içeren tüm deneysel prosedürleri Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan ve NIH kurallarına uyduğu bulundu. Hipokampal Nöron Kültürü 1. Doku Kaynağı <ol><li> Hipokampal nöron kültürü için prenatal fare yavrular üretmek için evi 17 yetiştirilen zaman gebe farelerin (C57BL6 / J) kullanın. vajinal fiş algılama ile gün E0.5 olarak belirlenmiştir. kültür için planlanan hasat zamanı E16.5-E17.5 olduğunu. Not: Bu protokol, düşük yoğunluklu nöronlarla ko-kültür, iki yüksek yoğunluklu nöron iki 24-yuvalı plakalar kültürleri tarif (48 lamelleri toplam) hazırlandı. daha fazla levha, ancak malzeme ve reaktif için uygun şekilde ölçeklenebilir. </li></ol> Yüksek Yoğunluklu nöron kültürleri 2. 24 oyuklu plakalar hazırlanması Not: embriyoların planlanan hasattan önce aşağıdaki adımları (2-3) gün yapın. <ol><li> İki 24 kuyu getirhücre kültürü kaputu içine plakaları, bireysel ambalaj açın. </li><li> 1 ml&#39;lik plastik tek kullanımlık şırıngaya 18 G şırınga iğnesi bağlayın. </li><li> şırınga tutun ve de alt merkezi sol ~ 1 mm iğne ucu amaçlamaktadır. kuyu (~ 1 mm uzunluğunda) alt etch orta kuvvet (~ 250 gr) uygulayın. Bir oluk oluşmuş ve plastik malzemeler düz dipli kuyu yüzeyi üzerinde yükseltilmiş bir destek oluşturacaktır yerinden edilecektir. Benzer bir şekilde alt merkezinin sağındaki ~ 1 mm bir yaklaşık 1 mm uzunluğunda paralel oluk Etch. </li><li> İki 24 oyuklu plakaların tüm oyuklara için yineleyin. Yüksek yoğunluklu kültürü için kullanılan iki adet 24 oyuklu plakalar artık, poli-D-lisin (aşağıdaki adımı 3.8) ile kaplama için hazırdır. </li></ol> Düşük Yoğunluklu Nöron Kültürler 3. Lameller Hazırlık <ol><li> 12-mm çaplı 1. tur camını kullanın. </li><li> 100 mm çaplı steril plastik petri içinde 50 lamelleri yerleştirin ve lamelleri daldırın20 mi% 70 etanol çözeltisi içinde. bir saat boyunca, orta (70 rpm) dönüş hızı ile dönen bir platform üzerinde, bu petri yerleştirin. % 70 etanolü çıkarmak ve daha sonra% 70 etanol taze toplu ile değiştirin. Döndürün ve bir saat daha yıkayın. </li><li> % 70 etanol temizleme solüsyonu atın. (0.2 mikron filtre birimi ile filtrelenmiştir) steril su ekle. elle petri çevirerek titizlikle lamelleri durulayın. üç kez taze steril su ile değiştirilmesi her zaman durulayın. </li><li> laminer akış steril bir hücre kültürü kaput içinde lamelleri ile petri yerleştirin. Vakum hattı üzerinden durulama suyu aspire ve lamelleri sokmak için steril su filtrelenmiş 10 ml ekleyin. lamelleri steril olmalıdır ve yüzey poli-D-lisin kaplama için yeterince temiz olmalıdır. </li><li> bireysel ambalaj açma iki adet 24 oyuklu plakalar ve başlık koyun. </li><li> kaputu vakum hattında açın. vakum hattına 200 ul pipet bağlayın ve bir SCIS kullanınsor daha büyük bir açılış oluşturmak için ucu kesmek için. </li><li> petri, bir anda birinden lamelleri pick up ve tamamen lamel kurumaya vakum hattını kullanmak için ince uçlu 5. cımbız kullanın. Daha sonra, 24 gözlü bir levhanın gözleri her birine, bir lamel. 50 temizlenmiş lamelleri, iki 24-çukurlu tablalara, her bir doldurmak için yeterli olmalıdır. </li><li> borat tampon maddesi (pH 8.5) ile çalışma çözeltisi (0.1 mg / ml) içine poli-D-lizin stok çözeltisi (1 mg / ml) ile seyreltilir. (Kazınmış dipli, iki yüksek yoğunluklu plakaları dahil), dört 24 oyuklu plakalar için toplam çalışma çözeltisinin 30 ml hazırlar. </li><li> cam kapak slipleri, her bir oyuğa 300 ul 0.1 mg / ml poli-D-lizin çalışma solüsyonu ekleyin. lamelleri solüsyon içinde tamamen batırılır emin olun. Değilse, kuyunun dibinde karşı lamelleri bastırın # 5 cımbız ucu kullanın ve lamelleri tüm yüzeyini kapsayacak şekilde poli-D-lizin çözüm rehberlik ucu kullanın. Görme Herhangi yüzeylerin olmak için tüm lamelleri incelemekHiçbir hava yeniden plaka ve lamelleri arasında sıkışıp edildi. </li><li> Ekle 300 ul 0.1 mg / kazınmış dipli yüksek yoğunluklu kültür plakasının her bir oyuğuna ml poli-D-lizin çalışma çözeltisi. Kuyunun tüm alt kapağı çözüm yaymak için elle döndürün. </li><li> kültürü inkübatör poli-D-lizin ile dört tabak dönün ve / N O kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> Kültür 4. Yıkama ve Ön şartlandırma Tabaklar Not: Aşağıdaki aşamalar (4-9), doku hasat gününde gerçekleştirilir. <ol><li> lamelleri ve 24 oyuklu plakalar göre O / N inkübasyon / Kaplamadan sonra, dört Levhalar, kültürün davlumbaz içine (donör lamelleri, kazınmış plastik dipli, iki alıcı yüksek yoğunluklu plakaları ile iki adet) getir. poli-D-lisin çözeltinin ayrılması için vakum hattı kullanın. </li><li> Hemen her bir plastik bir transfer pipeti kullanılarak ~ 1 ml steril su ekle, poli-D-lisin çözeltisinin çıkarılmasını takiben. Tüm oyuklar sıkıldıktan sonrasu ile 10 dakika süreyle bekletin. Daha sonra, (ya da cam lameller olmadan) kuyunun alt kapak her bir 300 ul yıkama ortamı ekleyin vakumla su çıkarın. poli-D-lizin kaplama kurumasına izin vermeyin. </li><li> Hücre inkübatör dört tabak dönün. Plakalar dağınık hipokampal nöronlar hazırlanır kez kullanıma hazırdır. </li></ol> Enzimatik sindirme 5. tam kültür ortamı içinde hazırlanması ve Tripsin Çözeltisi <ol><li> malzemeler (Malzeme) karıştırarak 60 ml Komple Kültür ortamı hazırlayın. iki adet 50 ml konik tüp içine tam kültür ortamı filtre bir 0.2 mikron gözenek boyutunda bir şırınga filtresi ile birleştirilmiş bir 50 ml şırınga kullanın. Her tüp 30 mL tam kültür ortamı içerir. </li><li> Ayrı bir 50 ml konik tüp, ~ 30 mi yıkama ortamı (Malzeme) ve 37 ° C&#39;ye kadar ısıtmak ekleyin. Bu enzimatik sindirimden sonra doku yıkamak için kullanılır. </li><li> enzimi sindirimi ortamı hazırlayın. 15 ml konik tüp, 4.5 mi yıkama ortamı ve 0.5 ml% 2.5 tripsin solüsyonu ve 50 ul 100X DNase ilave </li><li> Tam kültür ortamı, yıkama ortamı yerleştirin ve 37 ° C su banyosu içinde sindirim ortam enzim. </li></ol> Cerrahi Araçlar 6. hazırlanması <ol><li> Bir sterilizasyon kese tüm cerrahi aletleri sterilize: iki küçük makas, forseps bir çift ve iki 5. cımbız. </li></ol> Hippocampi E16.5-E17.5 Fare Embriyolar ve Diseksiyon gelen Brain 7. Kaldırma <ol><li> Hazırlama iki adet 10 cm&#39;lik petri buz soğukluğunda steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile doldurulmuş kaplar. </li><li> (Bir hacme ~ 0.5 ml, 100 mg / kg), sodyum fenobarbital ile karından bir enjeksiyonla fare baraj öldürülür. baraj ayak tutam yanıt kaybeder kez enjekte edildikten sonra, servikal dislokasyon ile kurban. </li><li> % 70 etanol ile baraj karın alan sprey, ve ortaya çıkarmak için karın orta hat boyunca 2 cm uzunluğunda kesi yapmakrahim. </li><li> embriyolar çıkarın ve soğuk kesme HBSS tamponu ile 10 cm çapında bir Petri tabağına bağımsız olanlar yerleştirin. </li><li> Bir forseps kullanarak boynundan embriyo tutun ve beyin dokusu üzerinde beyincik düzeyi ve bölümünün altında orta hatta ilk kesim doğru yapmak için küçük bir makas kullanın. embriyoyu başını kesmek yok. <ol><li> tüm yol embriyonik beynin rostral kısmından, açık kesilerek kaudal bölgede küçük makas sağ tarafı ucu takın (çapraz orta hat yok) ve kafa tabanı düzeyinde sol tarafında bir kesim yapmak. </li><li> Sağ tarafta bir kesim yapmak için tekrar sola yan makas ucu takın. tüm beyin kolay çıkarılması için bir kenara saygısız böylece, rostral sonunda kesilmemiş kafatası kemik ve cilt dokusunun dar bir bant bırakın. </li><li> HBSS çözeltisi içine embriyonik beyin oymak için makas ucu kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında beyin kontrol edin. Beyin hiçbir brüt kesme o ile sağlam olmalıdırff bölgeler. </li><li> Tüm embriyo beyinleri toplamak için bu adımları tekrarlayın. </li></ol></li><li> 20 ml soğuk HBSS tamponu içeren yeni bir petri tüm bozulmamış beyin toplayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında petri yerleştirin. </li><li> ventral taraftan beyin görüntüleyin. kaudal ucunda forseps ile beyin basılı tutarken, orta rostral noktası ve kaudal-temporal bölge arasında bir kesim yapmak için çapraz keskin 5. cımbız yerleştirin. diğer yarımkürede için bu işlemi tekrarlayın. Beyin sapı dokuların geri kalanından bozulmamış hipokampus ile ayrı iki hemisfer kestikten sonra. <ol><li> beyinleri her biri için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> tüm disseke hemisferlerin havuz ve 5. cımbız iki çift kullanarak meninksler kaldırmak. </li><li> temporal lob içinde katlanmış kavisli bir yapı olarak gelişen hipokampus tanımlayın. kortikal dokuları bitişik hipokampus ayırmak için cımbız iki çift alternatif. Toplayın ve tüm hippocam havuzpi doku (Şekil 1). </li></ol> Tek Nöronlar içine ayrı 8. Enzimatik Sindirim, <ol><li> Plastik bir transfer pipeti kullanarak, 15 ml konik bir tüp içinde% 0.25 tripsin + 1X Dnaz I ile 5 ml yıkama ortamı içeren enzimatik sindirim çözeltisi içine tüm parçalara hippocampi aktarın. </li><li> Bir su banyosu içinde Tüp ve her 5 dakikada bir kez tüpün kesikli yumuşak invertli, 25 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 25 dakika sonra, dikkatli bir şekilde aspire edilerek bir el pipet kullanılarak enzim çözeltisi çıkarın. 10 ml ılık Yıkama orta ekleyin ve yavaşça yavaşça tüpü 5 kez ters yüz edilerek doku yıkayın. Yıkama ortamı çıkarın ve ilave bir yıkama için tekrar 10 mi yıkama ortamı ilave edin. </li><li> Yıkama ortamı çıkarın ve tekrar taze sıcak Yıkama orta 3 ml ekleyin. dokudan sindirilmiş nöronlar çıkarmak için elle sıkı 15 kez tüp sallayın. Orta Hücreler, bir kez bulanık bir hale gelmelidirYıkama ortamı içine dokudan ayrılır yeniden. tüp içinde kalan doku bırakırken, yeni bir 15 ml konik bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu toplanır. </li><li> dokuya bir 2 mi yıkama ortamı ekleyin ve yavaşça ~ 15 kat için plastik bir pipet ile öğütülerek kalan doku ayırın. 5 dakika bekletin. &#39;Shake-off&#39; hücreleri toplanır içeren yeni 15 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu Havuz. </li><li> Bir hemasitometre ile nöronların yoğunluğunun sayın. Tipik haliyle, mikrolitre başına 3.000-5.000 hücre parçalara embriyo sayısına bağlı olarak elde edilebilir. Altı embriyolar varsayılarak kesilir ise 2.5 x 10 7 nöronların arasında ortalama bir sayı olduğu tahmin edilmektedir. </li><li> 30 mi kadar tam kültür ortamı ilave edildiğinde 250.000 nöron / ml&#39;lik bir yoğunluğa elde etmek için, bu hücre süspansiyonunun gerekli hacmi hesaplayın. Yüksek yoğunluklu nöron kaplama ortam elde edilmesi için, 30 ml komple kültür ortamı içeren iki konik boruların biri için bu hacim. </li> &lt;li&gt; başka bir 30 ml için bu yüksek yoğunluklu nöron çözeltisi Aktarım 1.2 mi tam kültür ortamı ~ 10,000 nöron / ml&#39;lik bir konsantrasyon elde edilir. Düşük yoğunluklu lamelleri tohum Bu seyreltme kullanın. </li></ol> Nöronlar ve Uzun Vadeli İşbirliği kültürünün 9. Kaplama <ol><li> Hücre kültürü davlumbaz içine yüksek yoğunluklu nöronların kazınmış tabanları iki 24-kuyu tabak getirin. vakum ile 300 ul önkoşulu orta çıkarın. 250.000 nöron / ml 0.6 ml yüksek yoğunluklu hücre süspansiyonları Plate. </li><li> kültürü kaputu içine lamelleri ile diğer iki 24-kuyu plakaları getirin ve vakum ile 300 ul önkoşulu orta kaldırmak. İki 24 oyuklu plakalar içinde lamelleri 10.000 nöron / ml&#39;de Levha 0.6 mi düşük yoğunluklu hücre süspansiyonları. </li><li> inkübatör dört 24 oyuklu plakalar döndürür. 2 saat bekletin. </li><li> yüksek yoğunluklu kültürü nöronlar kalarak düşük yoğunluklu lamelleri çevirin. Nöronlar (yani, n birbirine bakacak emin olun) Cam lamel ile ayrılmış ot. Daha sonra inkübatör ko-kültürü ile iki tabak döndürür. </li></ol> 10. Co-kültür Sürdürmek <ol><li> Diğer birçok çalışmalarda bildirilen orijinal Komple Kültür ortamı% 50 çıkarmak gerek yoktur 5. in vitro (DIV) &#39;de günde (Malzeme bakınız) 300 ul taze Besleme orta ekleyerek ortak kültürleri besleyin. besleme ortamı, aynı zamanda 15 uM sitosin arabinosid (ARA-C, 5 um bir son konsantrasyon elde etmek üzere), glia kirlenme ve çoğalma şansını en aza indirmek için içerir. </li><li> Bu ilk beslenme ardından, her hafta kuyuya Ara-C olmadan 300 ul taze Yem orta ekleyin. Kültür birden fazla ay boyunca tutulmalıdır (DIV33 ilk ve orta yarım değiştirme ile) bir ay zaman noktasında ötesinde her hafta taze Yem orta orta yarısı değiştirin. Morfolojik olarak, yüksek ve düşük dansiteli nöronlar hem yukarı üç ay (exper tarafından gözlemlenen en uzun süre sağlıklı görünüyorsunimenters). </li></ol> Deneysel Manipülasyon-düşük yoğunluklu Nöron Transfeksiyon 11. İllüstrasyon Not: Düşük yoğunluklu nöronlarında transfeksiyon istendiğinde, basit bir kalsiyum fosfat protokolü kullanılabilir. Bu düşük yoğunluklu kültürleri DIV12 önce kalsiyum fosfat işlemi daha da transfeksiyon randımanına sahip olduğunu bulduk, ancak bu süre boyunca dendritik dikenler belirgin DIV21 veya daha büyük, çok daha düşük verimlilik ile transfekte edilebilir. kültürlenmiş düşük yoğunluklu nöron transfeksiyonu fizibilitesi bir pEGFP-C3 plasmidi ile transfekte nöronların gösterilmiştir (aşağıya bakınız). <ol><li> DIV21 da eş-kültür, her kuyudan orta Koşulları 600 ul çıkarın ve yeni bir 24 oyuklu plakaya transfer. Sonra geri orijinal hacminin getirmek için ko-kültür için 600 ul taze Yem orta ekleyin. <ol><li> orta durumunu 600 ul yeni 24-iyi plaka içine lamelleri aktarın. emin olundüşük yoğunluklu nöronlar yukarı bakacak şekilde. yüksek yoğunluklu plakaları ve inkübatör geri lamelleri ile yeni tabak yerleştirin. </li></ol></li><li> İki 1.5 ml steril tüpler hazırlayın. bir tüp içinde, 600 ul 2X HEPES tuz (HBA) çözümü tamponlu ekleyin. plazmid konsantrasyon dayalı 12 mikrogram pEGFP-C3 DNA hacmini hesaplayın. Diğer tüp içinde, 74 ul CaCl2 (2 M stok) ve plazmid ekledikten sonra 600 ul yapacak su hacmi ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve daha sonra plazmid DNA ekleyin. Yavaşça iyice karıştırın. Her iki tüpler oda sıcaklığında 5 dakika bekletin. </li><li> 2X HBS tüpü elle tutma ve orta bir mikserde çözüm ajite ederken, 600 ul 2X HBS tüpüne damla DNA CaCl2 çözüm damla ul 600 tüm ekleyin. Oluşan çökelti, &#39;ince kum &quot;granül şeklinde olmasına özen gösterilmelidir. daha muhtemel büyük &#39;kar flake&#39; benzeri çökeltileri üretecek beri çok güçlü ve çok hızlı karıştırma, yüklenebileceğini arzu değildirh bizim gözlemlerine dayalı önemli ölçüde daha düşük transfeksiyon verimine sahiptir. </li><li> Çökelti, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta oluşturulması için devam edelim. </li><li> lamelleri düşük yoğunluklu nöron içeren her bir kuyunun 100 ul çökelti ekle, eşit damla ve damla. Plakaları kuluçka makinesine geri dönün ve 2 saat süreyle inkübe edin. CaCI2 en varsayarak bu uzun süreli kuluçkadan sonra nöronlar için toksik olabilir, ~ 17.6 mM Ca2 + konsantrasyonda sonuçlanır serbest formdadır. </li><li> , ~ 50 ml yıkama ortamı ile 50 ml konik tüp hazırlanır, 37 ° C&#39;ye ısıtın. </li><li> 2 saat sonunda, davlumbaz içine çökelir DNA, kalsiyum fosfat ile düşük yoğunluklu nöron getir. keskin 5. cımbız ile her lamel Pick up ve kısaca yıkamak için 50 ml Yıkama ortamında bunu üç kez batırın. Sonra düşük yoğunluklu nöronlar aşağıya bakacak şekilde, özgün ko-kültür plakaları yüksek yoğunluklu nöronlar iade. </li><li> kadar kültür Devamlamelleri düşük yoğunluklu kültür nöronları etütlerin yapılması için alınır. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+microtubule-based+transport+of+dendritic+membrane+proteins+arises+in+concert+with+axon+specification.">Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification.</a> J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Shi, Y., Ethell, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+control+dendritic+spine+plasticity+in+hippocampal+neurons+through+NMDA+receptor+and+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II-mediated+actin+reorganization.">Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization.</a> J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).</li><li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons.">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+neuronal+density+and+maturation+on+network+activity+of+hippocampal+cell+cultures:+a+methodological+study.">The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study.</a> PLoS One. 8, e83899 (2013).</li><li>Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP-dependent+protein+kinase+mediates+activity-regulated+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors.">cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors.</a> J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).</li><li>Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+induces+synaptic+delivery+of+hnRNP+A2/B1+by+a+BDNF-dependent+mechanism+in+cultured+hippocampal+neurons.">Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons.</a> PLoS One. 9, e108175 (2014).</li><li>Clarke, L. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+astrocytes+in+neural+circuit+development.">Emerging roles of astrocytes in neural circuit development.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).</li><li>Kaneko, A., Sankai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+rat+hippocampal+neurons+at+low+density+in+serum-free+medium:+combination+of+the+sandwich+culture+technique+with+the+three-dimensional+nanofibrous+hydrogel+PuraMatrix.">Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix.</a> PLoS One. 9, e102703 (2014).</li><li>Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+peptidomics+of+supraoptic+magnocellular+and+hippocampal+neurons+in+low-density+co-cultures.">Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures.</a> ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).</li><li>Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+dendrite+development+in+hippocampal+neurons+by+binding+to+p75NTR+and+modulating+the+cellular+targets+of+Notch.">NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch.</a> Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).</li><li>Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+technique+for+culturing+primary+fetal+rat+cortical+neurons.">A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Qiu, S., Weeber, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reelin+signaling+facilitates+maturation+of+CA1+glutamatergic+synapses.">Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses.</a> J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).</li><li>Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET+receptor+tyrosine+kinase+controls+dendritic+complexity,+spine+morphogenesis,+and+glutamatergic+synapse+maturation+in+the+hippocampus.">MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus.</a> J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Serum içermeyen koşullar altında, ultra düşük yoğunluklu hipokampal glutamaterjik nöronların uzun süreli kültür için ayrıntılı bir protokol mevcut. ~ 2000 nöronlar / cm 2, yoğunluk ya da mevcut literatüre 2,3,11,13,14 tarafından bildirilen glia desteği olmadan en &#39;düşük yoğunluklu&#39; kültür hazırlıkları kat daha en az iki düşüktür at. ultra düşük yoğunluklu olmasının yanı sıra, bu protokol, yeni ve iki yönden önemlidir. düşük yoğunluklu nöronla...

In vitro koşullarda hipokampal nöronlar Büyüyen gözlem ve in vivo olarak başka türlü mümkün olmayan bu nöronların deneysel manipülasyon sağlar. Bu deneysel yaklaşım yaygın büyüme, kutuplaşma, akson şartname, insan ticareti ve proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, sinaps oluşumu ve işlevsel olgunlaşma 1 nöronal mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılır. Geç embriyonik aşamada hasat zaman Bu in vitro kültür hipokampal nöronlar, piramidal morfoloji 2 (&gt;% 90) glutamaterjik hücreler nispeten saf bulunmaktadır. Nöronlar in vitro koşullarda bir 2-D yüzeyinde yetişen Çünkü, bu yöntem tek bir odak düzlemi 3 ile boyama gibi canlı görüntüleme veya immünsitokimya (ICC) kolay gözlem, izin verir; Böyle ilaç tedavisi ve transfections 3-6 veya manipülasyonlar. yüksek yoğunlukta yetiştirilen zaman, nöronlar, çünkü daha yüksek co hayatta kalma yüksek oranlarına sahip olma eğilimibüyüme ortamından, ve aynı zamanda çünkü akson temas bağımlı mekanizmalar 7 sindirim desteğinin yanı sıra salgılanan büyüme faktörlerinin ncentrations. Bununla birlikte, düşük yoğunluklu hipokampal nöronlar bağımsız bir nöron bütünüyle görüntülenecek veya ICC analizi için boyandı morfolojik çalışmalar için de arzu edilir. Düşük yoğunluklu nöronlar nedeniyle parakrin destek eksikliği nedeniyle kültüründe korumak zor ve bu nedenle sık sık önceki nöron kültürü 2 hazırlıklı olmak olan bir glial (genellikle kortikal astrosit) besleyici tabaka, gelen trofik desteği gerektirir. Bir glial hücre besleyici tabaka ile kültürlü işbirliği yaparken, düşük yoğunluklu nöronlar lamelleri yetiştirilen ve düşük yoğunluklu nöronlar ve glia birbirine bakacak şekilde daha sonra glia tabakasının üstüne çevirdi. Glia ve nöronlar arasındaki küçük bir kapalı alan, bu nedenle bir &#39;sandviç&#39; düzen 2,8,9 yaratma, lamelleri köşelerindeki parafin noktalar yerleştirerek oluşturulur. düşük yoğunluklu nöronlar w büyüyecekglia ve nöronlar ve glia tarafından salgılanan konsantre faktörler ile bir müsamahakar mikro oluşturur lamel arasında kapalı alana ithin. Bu yaklaşım, düşük yoğunluklu, makul aralıklı olan tam gelişmiş nöronlar, bu nedenle kolaylaştırma ICC etiketleme ya da canlı görüntüleme çalışmaları verir. yana zaman alıcı ve zahmetli olmaktan nöron glia ortak-kültürünün bir görünür sakıncası, bu nörona özgü veya hücre-bağımsız, düzenekleri önlemesidir. Bu sistem çok daha az karmaşık daha olmasına rağmen in vivo sinir dokusu, deneyler 10 bulandırabilir salgılanan, zaman henüz tam olarak tanımlanmış faktörleri ile nöron gelişimi üzerindeki glia etkisi. Bu nedenle, nöron spesifik mekanizmaların soruşturma, serum ve glial destek tabakası gerekli kaldırmak tanımlanan kültür koşulları gerektiren deneylerde. Bir önceki çalışmada, bir inci kullanılarak nöronların düşük konsantrasyonlarda (~ 9.000 hücre / cm 2) kültüre başarmıştırree boyutlu hidrojel matrisi 11. nispeten saf nöronal popülasyon glial desteksiz serumsuz koşullar altında, yüksek yoğunlukta kültürlenebilir yana, hipokampal nöronlar ultra düşük yoğunluklu ile serumsuz tanımlanmış bir kültür ortamı içinde yetiştirilen Hipotezimize olarak, yüksek yoğunluklu nöronlar ile ko-kültür geleneksel olarak kabul nöron glia ko-kültür benzer bir şekilde. Gerçekten de, bir &quot;sandviç&quot; yapılandırmada, yüksek yoğunluklu hipokampal nöron kültürleri en son özel magnoselüler endokrin nöronlar 12 az sayıda destek kullanılmıştır. Bu nedenle, yüksek yoğunluklu nöronlar ile ko-kültür düşük yoğunluklu nöronlar uzun süreli sağkalım sağlamak için yeterli trofik faktörler destek almak için izin verebilir. kültür ultra-düşük yoğunluklu nöronların Bu protokol, böylece formüle ve onaylanmıştır. protokol yüksek yoğunluklu hazırlayarak, tek bir deneyde içinde uygulanabilir (~ 250.000 hücre / ml) disBirlikte olan hippokampal nöronlar, önce ve sonra bir yoğunluğa ~ 10,000 nöronlar vermek üzere bir seyreltme yapılmadan / ml (~ 3000 nöronlar / lamel veya ~ 2.000 nöron / cm2), en düşük yoğunlukta kültür bildirilen daha düşüktür, 2,3,9 , 11,13. Bu kültür durum gevşek &#39;ultra-düşük yoğunluklu&#39; kültür olarak adlandırılan ve &#39;düşük yoğunluklu&#39; arası istikrarsızca kullanılır. yüksek yoğunluklu nöronlar, poli-D-lisin kaplı 24 oyuklu plakalar üzerine plakalanır; düşük yoğunluklu nöronlar poli-D-lizin kaplı 12 mm&#39;lik cam lameller üzerine ekildi ise başka bir 24-çukurlu plaka içinde yerleştirilir. nöronlar indiler ve lamelleri bağlı sonra düşük yoğunluklu nöronları yapışmış olan lamelleri 2 saat sonra yüksek yoğunluklu nöronların üstünde çevrileceği. Buna ek olarak, bunun yerine yüksek yoğunluklu nöron katman üzerinde lamelleri yükseltmesine parafin noktalar kullanılarak, bir 18 G şırınga iğnesi, iki paralel çizgi 24 yuvalı plakalar alt aşındırma için kullanılmıştır. Ortaya çıkan displNahl.Acad, bitişik plastik cam lamelleri için yükseltilmiş bir destek sağlar. Bu alan sürekli konsantre trofik faktörler ile mikro sağlarken yeterli oksijen ve kültür ortamı alışverişini sağlayan 150-200 mikron, ölçülür. Bu durumda, düşük yoğunluklu nöronlar yoğun büyür ve kültürde üç ay ötesinde yaşayabilir. Bu nöronlar kültüründe üç hafta sonra GFP plazmid ile transfekte edildiğinde, dendritler bolca dendritik dikenler çivili. ilkesinin bir kanıtı olarak, veriler, bu ko-kültür sistemi nöronları hücre araştırma kolaylaştırabilir autaptic bağlantıları oluşturan poli-D-lizin mikro-adalar &quot;, üzerine ekildi hipokampal nöronlar ultra düşük yoğunluklu kültürleri desteklediğini göstermek için sunulmuştur -autonomous, ağ-bağımsız mekanizmalar.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>aliquot, store in 0.6ml size</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>dilute 100X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>antibiotic-antimycotic (AA)</td><td>Life Technologies</td><td>15240-096</td><td>dilute 100X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Complete Culture medium</td><td></td><td></td><td>Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I</td></tr><tr><td>Wash medium</td><td></td><td></td><td>same as &#039;Neurobasal medium&#039;</td></tr><tr><td>Feed medium</td><td></td><td></td><td>Neurobasal with 1X B27 supplement</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td>prepare 100X stock at 0.6mg/ml</td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>M.W. 70000-150000</td></tr><tr><td>borate buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768 (boric acid); 71997(borax)</td><td>1.24g boric acid &amp;amp; 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl</td></tr><tr><td>12-mm round glass coverslips</td><td>Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH</td><td>1001/12</td><td>No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply</td></tr><tr><td>proFection transfection kit</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>see&amp;nbsp; protocol for details</td></tr><tr><td>2X HEPES buffered saline (HBS)</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td>see&amp;nbsp; protocol for details</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td>0.2um pore size</td></tr><tr><td>Endofree plasmid prep kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>for preparation of transfection grade plasmid DNA</td></tr><tr><td>anti-MAP2 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB3418</td><td>mouse antibody, clone AP20</td></tr><tr><td>anti-p-Tau antibody</td><td>Millipore</td><td>AB10417</td><td>rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td>anti-NR1 antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1586</td><td>mouse antibody, clone R1JHL</td></tr><tr><td>anti-GluR1 antibody</td><td>Millipore</td><td>AB1504</td><td>rabbit polyclonal antibody</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td>500ml size</td></tr></tbody></table>

a simplified method for ultra-low density, long-term primary hippocampal neuron culture

In vitro birincil hipokampal nöronları Kültürleme nöronal gelişimi birçok yönlerini mekanik sorgulama kolaylaştırır. Ayrışmış embriyonik hippokampal nöronlar, genellikle, serum içermeyen koşullar altında, yüksek yoğunlukta cam lameller üzerine başarılı bir şekilde büyüyebilir, ancak düşük yoğunluklu kültürleri, tipik ederek trofik faktöre kaynağı gerektirir zaman alıcı olabilir hazırlanması bunun bir glia besleyici tabaka ile ortak kültür ve zahmetli. Buna ek olarak, glia varlığı nöron spesifik mekanizmalarına sonuçları ve preclude çalışmaların yorumlanmasına neden olabilecek. Burada basitleştirilmiş bir yöntem serumsuz koşullar altında ve glial hücre desteği olmadan bir ultra-düşük yoğunluklu (~ 2.000 nöronlar / cm2), uzun dönemli (&gt; 3 ay) primer hipokampal nöron kültürü için sunulmuştur. Düşük yoğunluklu nöronlar poli-D-lizin kaplı lamelleri yetiştirilen ve 24 oyuklu bir plaka içerisinde yetiştirilen yüksek yoğunluklu nöronlar üzerinde ters çevrilmiş olan. Bunun yerine betwee bir alan oluşturmak için parafin nokta kullanarakn İki nöron katmanları, deneyci sadece düşük yoğunluklu nöron büyümeye elverişli bir MICROSPACE oluşturmak için, yüksek yoğunluklu nöronlar ikamet hangi kuyunun plastik altını, etch olabilir. ko-kültür böylece kolayca bu nöronların morfolojik ve fizyolojik çalışma kolaylaştıran düşük yoğunluklu nöronların önemli bir kayıp olmadan&gt; 3 ay muhafaza edilebilir. Bu başarılı kültür koşulundaki göstermek için, veri uzun süreli kültürden sonra, düşük yoğunluklu hücrelerinde bol sinaps oluşumunu göstermek için verilmiştir. Bu eş-kültür sistemine, aynı zamanda, poli-D-lizin substratlar ve böylece autaptic bağlantıların oluşumu adaları yetiştirilen seyrek bireysel nöronların hayatta kalmasını kolaylaştırır.

Burada açıklanan protokol besleyici tabakası olarak hizmet eden glial hücreler gerek olmadan başarılı ultra düşük yoğunluklu saf glutamaterjik nöronların uzun dönemli kültür sağlar. Protokol bu ayrı ayrı (poli-D-lizin kaplı cam lameller üzerine) (24 kuyu kaplanmış poli-D-lisin ile) yüksek yoğunluklu hazırlanmasını ve düşük yoğunluklu nöronları içeren, Şekil 1 &#39;de diagramed, ve daha sonra eş-kültür edilir üç aya kadar muhafaza ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture at JoVE.com

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

a-simplified-method-for-ultra-low-density-long-term-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.7K Görüntüleme.  University of Arizona College of Medicine-Phoenix. Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms. 

Video: A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Nörobilim

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

P0 Yenidoğan Ratlarda Hipokampal Nöronlar İlköğretim Kültür

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal neurons allows the study of individual neurons or subcellular components. We have shown subcellular protein localization within a neuron by immunocytochemistry, neuronal polarity, synaptic morphology, and its developmental change using a low-density primary hippocampal culture. Recently, ready-to-use frozen stocks of neurons have become commercially available. These frozen stocks of neurons reduce the time needed to prepare animal experiments and also contribute to the reduction of the number of animals used. Here, we introduce a reproducible low-density primary culture method using a 96-well plate. We used a commercially available frozen stock of neurons from the rat embryonic hippocampus. The neurons can be stably cultured long-term without media changes by reducing the growth of glial cells at particular timepoints. This high-throughput assay using low-density culture allows reproducible imaging-based evaluations of synaptic plasticity.

A ready-to-use frozen stock of neurons is a powerful tool for evaluating synaptic functions. Here, we introduce an easy low-density primary culture from frozen stock using a 96-well plate.

Embriyonik Hipokampal Nöronların Dondurulmuş Stoğunu Kullanarak Kolay ve Tekrarlanabilir Düşük Yoğunluklu Birincil Kültür

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

A Technique to Culture Mouse Hippocampal Neurons

Source: Yang, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61411">Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing neurons from murine hippocampi. Initially, the hippocampi undergo enzymatic digestion to break down the extracellular tissue matrix. Subsequently, the digested tissue is mechanically disrupted to isolate individual neurons. Finally, these neurons are cultured on glial feeder cells.

Fare Hipokampal Nöronlarını Kültürlemek İçin Bir Teknik

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparing glia cell feeder dishes ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nöronal Kültür Teknikleri

Birincil Nöronal Kültür

Generating a Low-Density Primary Neuron Culture From Frozen Embryonic Neurons

Source: Koganezawa, N. et al., <a href="https://app.jove.com/v/64872">Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2023)
This video demonstrates the method of culturing cryopreserved embryonic neurons, involving controlled thawing, dilution with a neurobasal medium, and seeding onto a poly-L-lysine-coated plate. Subsequent incubation supports the growth and maintenance of neuronal connections.

Donmuş Embriyonik Nöronlardan Düşük Yoğunluklu Primer Nöron Kültürü Oluşturma

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plate coating

	Coat a 96-well ...

An Indirect Neuron-Astrocyte Co-Culture Technique for Studying Neuron-Glia Interactions

Source: Gottschling, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54757">The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video illustrates a method for establishing an indirect neuron-astrocyte co-culture using a compartmentalized approach. In this setup, neurons and astrocytes are spatially separated but share a conditioned medium. Neurotrophic factors released by astrocytes promote neuron differentiation and the formation of synaptic connections, suggesting neuron-glia interactions.

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...