Embriyonik Hipokampal Nöronların Dondurulmuş Stoğunu Kullanarak Kolay ve Tekrarlanabilir Düşük Yoğunluklu Birincil Kültür

Sıçan embriyonik nöronlarının dondurulmuş stokları kullanıma hazırdır ve hücrelerin kültürlenmesi için gelişmiş tekniklere gerek yoktur. Bu teknik çok kolaydır ve hayvan deneyleri, zamanlanmış hamile hayvanları düzenlemek veya embriyoları incelemek için herhangi bir izne ihtiyacınız yoktur. Nöronlar diğer kültür damarlarında kültürlenebilir ve diğer deney türleri için uygulanabilir.

Örneğin, elektrofizyolojik deneyler için mikroelektrot dizi plakaları. 96 delikli bir mikro plakayı, kuyu başına 100 mikrolitre poli-L-lizin ile kaplayarak başlayın. Daha sonra, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Kuluçka sonunda, poli-L-lizin çözeltisini çıkarın. Plakaları iki kez sterilize suyla ve bir kez takviyesiz, taze kültür ortamıyla yıkayın. Plakaları kuruması için dışarı yerleştirin.

Kuru plakalar dört santigrat derecede bir aya kadar sarılabilir ve saklanabilir. Hücre tohumlamasına başlamak için, kaplanmış plakalardaki her bir oyuğa 50 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Çevre kuyularını 200 mikrolitre sterilize su ile doldurun ve plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin.

Nöron kriyo şişesini sıvı azot tankından çıkarın ve içeriğini kısmen çözmek için 37 santigrat derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin. Geniş bir delik ucuna sahip bir mililitrelik pipet kullanarak, şişe içeriğini yavaşça steril, 50 mililitrelik bir tüpe damla damla aktarın. Boş kriyo şişesini bir mililitre oda sıcaklığında kültür ortamı ile durulayın.

Durulama çözeltisini, hücre süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik tüpe aktarın. Daha sonra, oda sıcaklığı kültür ortamının dokuz mililitresini 50 mililitrelik tüpe damla damla ekleyin ve hacmi 11 mililitreye kadar çıkarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu bir rezervuara aktarın.

Şimdi, geniş delik uçlarına sahip çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu, kuyu başına dört hücreye 1,0 çarpı 10'luk bir son sayımla kaplanmış 96 delikli plakaya dağıtın. Nöronları% 5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede bir ila iki saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, kültür ortamını 100 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin ve aynı koşullarda tekrar inkübe edin.

İn vitro dört gün sonra, glial hücrelerin büyümesini azaltmak için kuyucuk başına 0.2 mikromolar nihai konsantrasyonda sitozin beta-D-arabinofuranosid ekleyin. Plakayı tekrar inkübatöre yerleştirin. İn vitro 21 gün sonra, hücreleri ilgilenilen ilaçlarla tedavi edin.

Pozitif bir kontrolü sürdürmek için, fiksasyondan önce hücreleri kuyu başına 100 mikromolar glutamat ile 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca tedavi edin. İmmünositokimyasal çalışmalar yapmadan önce, kültür çözeltisini her bir kuyucukta 100 mikrolitre paraformaldehit ile değiştirerek hücreleri 20 dakika sabitleyin. Fiksasyondan sonra, kuyucukları her biri beş dakika boyunca kuyu başına 250 mikrolitre fosfat tamponlu salin ile iki kez yıkayın.

Bu çalışmada, nöronlar üç hafta boyunca kültür ortamını değiştirmeden normal olarak geliştirilmiştir. İmmünohistokimya, MAP2-pozitif dendritler boyunca drebrin-pozitif dendritik dikenleri ortaya çıkardı. Glutamat stimülasyonuna karşı drebrin kümesi yoğunluklarının doza bağlı olarak azalması gözlendi.

Hücre süspansiyonunun çok ısınmadan önce nakli çok önemlidir. Kültür ortamının damla eklenmesi, ozmolaritedeki ani değişimi önlemek için de çok önemlidir.