Bu çalışma CIHR MOP-142209 TJs için destek verdi.

Tüm deneyler ve laboratuar hayvanları kullanarak protokolleri Manitoba Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi yönergelerine uyumlu idi. Aletler, Tamponlar ve Solüsyonlar 1. Solüsyonun hazırlanması a <ol><li> tüm diseksiyon ekipman, cam Pasteur pipet, pipet uçları, filtre düzeneği ve deiyonize su otoklav ile sterilize edin. </li><li> iyonu giderilmiş su ve filtre-sterilize stok glukoz çözeltisi,% 20 (1.1 M / h) hazırlayın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> iyonu giderilmiş su ve filtre-sterilize 100 mM sodyum piruvat çözeltisi hazırlayın. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Hazırlama 10% (HBSS 10x), 10 mM HEPES, 100 U / ml penisilin-streptomisin, deiyonize su içinde bir çözelti yapmak suretiyle kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (CMF-HBSS). en fazla 1 veya 2 ay için 4 ° C &#39;de muhafaza edin. </li><li> 10 mg / ml deoksiribonükleaz hazırlayın I CMF-HBSS içinde (DNaz),ve daha sonra filtre-sterilize ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> (Steril çözeltiden), 30 mM glukoz ihtiva eden bir çözelti yaparak glial orta Minimum Esansiyel Ortam (MEM) içinde, 95 U / ml penisilin-streptomisin ve% 10-15 büyükbaş hayvan büyüme serumu (BGS) hazırlayın. Not: protokol belirtildiği üzere hücre çoğalmasını yavaş gerekirse,% 5 BGS bir çözeltisi kullanılabilir. At Serum yerine BGS kullanılır, ancak her parti nedeniyle arası toplu varyasyonuna kullanılmadan önce test edilmesi gerektiğine dikkat edilebilir. en fazla 1 veya 2 ay için 4 ° C&#39;de hazır çözelti saklayın. Birçok laboratuarlar FBS kullanmak rağmen, sürekli olarak BGS glial büyüme FBS olduğu kadar sağlam olduğunu gözlemledik. BGS kimyasal olarak tanımlanmış bileşenleri ile takviye edilmektedir cenin buzağı serumundan elde edilir. Buna ek olarak, BGS FBS büyük ölçüde daha ekonomiktir. </li><li> ihtiva eden bir çözelti yaparak nöron büyümesi ve bakım ortamı (Neuro temelli B27 NBG) Hazırlama 1 x B27 takviyesi ve 500 ml Neurobasal Medi içinde 0.5 mM L-Glutaminum. en fazla 1 veya 2 ay için 4 ° C &#39;de muhafaza edin. L-Glutamin büyüme ortamı içinde daha stabil olduğu ileri sürülmüştür Glutamax, ile ikame edilebilir. </li><li> MEM (steril çözeltiden), 30 mM glukoz ihtiva eden bir çözelti yaparak orta kaplama nöron (steril çözeltiden), 1 mM sodyum piruvat ve% 10 BGS hazırlayın. en fazla 1 veya 2 ay için 4 ° C &#39;de muhafaza edin. </li><li> 1 mM sitarabin (Ara-C) çözeltisi ve filtre-sterilize hazırlayın. -20 ° C&#39;de 1 ml kısımlar halinde kısım ve mağaza. </li><li> 100 mN filtre ile sterilize edilmiş NaOH içinde 100 mM APV bir çözelti hazırlayın. -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 1 mg borat tamponu içinde / mL poli-L-lizin, pH 8.5 (50 mM borik asit ve 12 mM boraks) ve filtre-sterilize çözülür. -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. Bunun yerine, poli-L-lizin, tek hücreler için daha az toksik olabilir poli-L-ornitin kullanabilir. </li></ol> 2. Glia Kültür Hazırlık <ol><li> kortikal astroglia hücre kültürü hazırlayın <ol><li&gt; Doğum 24 saat içinde sıçan yavrular elde etmek. Onları uyuşturan buz üzerinde yavrular yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ile yavrular Sprey ve bunları başını kesmek. </li><li> 15 ml CMF-HBSS içeren buz üzerinde 100 mm çanak kafaları yerleştirin. </li><li> , Kafa derisi kesme kafatası açma, beyin sapı ayırma ve daha sonra 3 ml CMF-HBSS içeren buz üzerinde 60 mm Petri tabaklarına beyin aktararak her beyin teşrih. </li><li> Hipokampuslardan gelen hemisferdeki ayırın ve bunları çevreleyen meninks kaldırdığını. meningeal fibroblastlardan az kirlenmesini sağlamak için yeterli önlem olun. kültürde meningeal fibroblastlar büyüme için glia ile rekabet ve nöron sağlığı için zararlı olabilir. 5 ml CMF-HBSS içeren buz üzerinde 60 mm Petri tabağına tüm hemisferdeki toplayın. </li><li> CMF-HBSS çıkarın ve sonra mikro diseksiyon yay makas kullanılarak ince mümkün olduğunca toplanan kortikal doku kıyma. </li><li> pirzola için yeterli CMF-HBSS ekleyinped dokusu. bir cam Pasteur pipeti kullanılarak, bir 15 ml tüp doku parçaları aktarın. CMF-HBSS eklenerek 12 mL toplam hacim getirin. </li><li> 1.5 mL% 2.5 tripsin ve 10 mg / ml DNaz çözüm her ekleyin. 12 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de elde edilen karışımın inkübe edin. </li><li> Doku bir cam Pasteur pipet kullanılarak 10-15 kez Karışım, ve 3 dakika daha bir 37 ° C su banyosu içinde inkübe edilir. </li><li> Lens kağıt veya BGS 5 mL içeren bir 50 ml tüp içine bir filtre keçesi süpernatanın filtre. Bu ayrışmamış doku parçalarını kaldırmak için yapılır. Seçenek olarak ise, ticari olarak temin edilebilen hücre gericileri kullanın. </li><li> Geri kalan doku parçaları içeren tüp CMF-HBSS ve% 2.5 tripsin 1.5 mL, 13.5 mL ekleyin ve ayrıca ilave bir 10 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. </li><li> bir kez daha geri kalan doku toz haline getirilir, ve daha sonra, ilk filtre ürünü ihtiva eden 50 ml tüp içine yeniden süspansiyon filtre. Daha sonra, durulama leBGS 3 mL ns kağıdı. Nihai hacim yaklaşık 38 ml olmalıdır. </li><li> Santrifüj 130 x g 6 dakika ayrışmış glial hücreler içeren süspansiyon. Dikkatlice cam Pasteur pipeti kullanarak süpernatant atın. altta edilen hücreler rahatsız emin olun. pelet alt kan bileşenleri içeren hafif kırmızımsı görünür. </li><li> pelet kırmızımsı kısmı bozmamaya özen taze tüpe glial orta 1 mL glial hücreler aktarın. </li><li> glial hücreler ayrışmış Birleştirilen yeniden askıya almak için yavru başına glial orta 2 mL kadar ekleyin. Örneğin, 10 köpek yavruları kullanılmıştır, ve daha sonra, toplam yeniden süspansiyon hacmi 20 ml olur. </li><li> Yavru başına bir 75 cm2 hücre kültür şişesi hazırlayın. Her bir şişeye 18 mL önceden ısıtılmış glial orta ekleyin. </li><li> Transferi 2 Her şişeye hücre süspansiyonu ml ve 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir. </li><li> Bir gün sonra, 20 ml glial m yerineedium. Bu aşamada, kültür glial ve diğer istenmeyen hücre tiplerinin bir karışımıdır. </li><li> Dört gün tohum hücreleri sonra, şiddetli bir şekilde olmayan astrosit hücreleri çıkarmak için şişeler. Bunu yapmak için, CMF-HBSS ile bir kez şişeler durulama ve daha sonra her bir şişeye 10 ml taze CMF-HBSS ekleyin. kuvvetli bir şekilde 5-10 kez çalkalama cam deney şişesinin ve CMF-HBSS aspire. CMF-HBSS ile iki kez durulanır ve daha sonra 20 mL olmak glial orta ekleyin. NOT: Bu adım hedef olmayan hücre tiplerinin kaldırılmasını sağlamak için çok önemlidir ve istenen astrositlerin kaybına neden olmamalıdır. </li><li> Hücreler birleştiklerinde, (Şekil 1) kadar haftada iki kez, taze glial ortamla değiştirin. </li></ol></li><li> Dondurucu glia <ol><li> Kültürler konfluent sonra, ortam aspire edilmiş ve 10 mL CMF-HBSS, hücre tekli tabakası yıkayın. </li><li> Her bir şişeye,% 0.25 tripsin / EDTA, 10 mL ilave edin ve 3 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Musluk şişeler hafifçe hücreleri çıkarmak için. 1 ml BGS t eklemeo, her şişe ve 15 mL tüpler içine hücre süspansiyonları aktarın. </li><li> 6 dakika boyunca 130 x g&#39;de tüpler santrifüjleyin. Elde edilen süpernatant atılır. </li><li> 2 ml glial ortamda hücre pelletini. </li><li> Glial dondurma ortamı (1-kısım dimetil sülfoksit ve 4-parçaları BGS) hazırlayın. şişe başına 4 kriyojenik şişelerin her birine Bu çözeltiye 0.5 mL ekleyin. </li><li> Her bir şişeye, hücre süspansiyonu, 0.5 mL transferi ve daha sonra gece boyunca -80 ° C&#39;de derin dondurucuda, yalıtılmış bir kap içinde şişeleri yerleştirerek yavaşça hücreler dondurma. Bir gün sonra, uzun süreli saklama için sıvı nitrojen dondurucuya şişeleri aktarın. </li></ol></li><li> Kaplama glia canlandı <ol><li> Plaka glia nöron kültürü gününden önce 1-2 hafta. </li><li> ml glial orta ısıtıldı, 10 ile 50 ml tüp hazırlanır. </li><li> 2-3 dakika boyunca, 37 ° C su banyosu içinde glia 1 dondurulmuş şişe çözülme. </li><li> 10 ml glial ortamı içeren 50 ml tüp içine şişe içeriğini aktarın. </li><li> santrifüjyüzer kapalı 5 130 x g&#39;de dakika ve aspirat e tüpü. </li><li> 20 ml glial ortamda pelletini. </li><li> kültür tabaklarına (60 mm) her birine 3 ml taze glial ortamı ilave edin ve daha sonra her bir tabak için hücre süspansiyonu 1 mL aktarın. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde kültürleri inkübe edin. </li><li> Haftada iki kez hücreleri besleyin. Hücre yoğunluğu,% 50 kaynaşmaya önce de nöron kültürü gün ulaşırsa, glial büyüme hızını yavaşlatmak için,% 5 BGS ihtiva eden glial ortama geçer. % 70 - nöron kültürü için glial tek tabaka istenen izdiham 50% &#39;dir. </li><li> 1-2 gün nöron kültürü önce NBG ortamı ile glial ortamı (6 ml / tabak) değiştirin. </li></ol></li></ol> 3. Lamel hazırlanması <ol><li> Temizlik ve Parafin Boncuk Hazırlanması <ol><li> ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır onları: (yüksek derecede aşındırıcı DİKKAT% 70 ağırlık / ağırlık) konsantre nitrik asit içinde lamelleri daldırın. Diğer laboratuvarlar f varound bu yararlı yerine oda sıcaklığında 12-24 saat boyunca seramik raflar içinde% 70 nitrik asit içinde lamelleri kuluçkalanması. </li><li> Dikkatle kurumsal kurallarına uygun olarak belirlenen bir kimyasal davlumbaz nitrik asit atın. lamelleri deiyonize su ile 3-5 kez yıkayın. </li><li> (Alternatif bir yöntem, aşağıdaki durumların atlama) deiyonize su içinde lamelleri daldırın ve 30 dakika boyunca tekrar sonikasyon. </li><li> deiyonize su çıkarıp lamelleri başka üç kez yıkayın. </li><li> 50 mL deiyonize su içinde lamelleri daldırın ve otoklavlama ile sterilize. Seçenek olarak ise, 6 saat süre ile bir fırında 225 ° C&#39;de lamelleri sterilize edin. Bu alternatif bir yaklaşım kullanılıyorsa, 3.1.9 adıma geçin. </li><li> otoklava sonra aşağıdaki adımlar için steril bir laminer akış başlığı lamelleri aktarın. </li><li> iyonu giderilmiş su çıkarın ve% 100 etanol içinde 20-30 mL ile durulayın. </li><li> % 100 etanol 20-30 ml ilave edilir ve lamelleri transferi ve100 mm Petri tabağına etanol. </li><li> 60 mm Petri tabaklarına, çanak başına 4-5 lamelleri lamelleri aktarmak ve sonra çanak kenarına lamelleri yaslanarak kurumaya izin verilecek şekilde küt bir cımbız kullanarak. Etanol buharlaştırıldıktan sonra, yüzeyde lamelleri düz bir şekilde. </li><li> uygun bir ısıya dayanıklı bir cam şişeye, 10 g parafin aktarın. parafin eritin ve en az 1 saat için bir sıcak plaka üzerinde yaklaşık 150-200 ° C de muhafaza. parafin ısıtılmasının gerektiği için ideal sıcaklık bazı verdiği alabilir. İdeal olmayan sıcaklıklar parafin boncuk doğru boyutu üreten zorluk yol açabilir. erime sonra bekleme süresi sıvı boyunca tutarlı bir sıcaklık sağlamak için yardımcı olur. </li><li> (Her nokta, yaklaşık 120 ° aralıklar ile olmak üzere) her lamel kenarına yakın üç noktalar için dokunun hemen sonra parafin içine Pasteur pipeti Dip ve. damla yaklaşık 0.3-0.5 mm yüksekliğinde boncuk ve çap olarak 1.0-2.0 mm içine katılaşacaktıreter lamel nöronlar ve aşağıdaki glial tek tabaka (Şekil 2) arasında bir boşluk temin etmek üzere işlev görür ve. </li><li> 30 dakika boyunca UV ışığı altında yemekler sterilize ve daha sonra oda sıcaklığında alüminyum folyo ve mağaza ile kapak. Hazırlanan lamelleri saklanır ve bir ay kadar kullanılabilir. Parafin boncuklar kullanmadan önce en az bir hafta süreyle lamelleri uymak izin verilmelidir. Bu protokolün kalan adımları sırasında koparmasını parafin önleyecektir. </li></ol></li><li> Poli-L-Lisin ile kaplama Lameller <ol><li> parafin boncuklar ile daha önce hazırlanmış lamelleri içeren Petri kapları alın. </li><li> Her bir lamel yüzeyine borat tamponu içinde poli-L-lizin, 200 uL ilave edin ve çözelti, oda sıcaklığında, kapalı, bir gece boyunca lamelleri bekletin. Kaplama parafin boncuklar üzerine konulduğu aynı yüzey. uygun şekilde temizlenmiş, poli-L-lizin, kolayca yayılan gerektiğini notlamel yüzeyini kapsayacak şekilde. </li><li> Bir gün sonra, 2 saat her steril deiyonize su içinde ıslatarak iki kez lamelleri yıkayın. Son yıkamadan sonra, çanak başına nöronal kaplama ortamının 4 ml su ile değiştirin. kapak slipleri olmayan yüzey poli-L-lizin ile kaplanmış sonra kurumaya bırakılır önemli olduğunu not edin. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde lamel içeren yemekler yerleştirin. kaplı kapak nöron kültürü önce en az 24 saat süre ile inkübe edilmelidir. Bu nöron kültürü için asal ortam için yapılır. </li></ol></li></ol> Hipokampüs ve Kaplama nöronlar 4. Diseksiyon <ol><li> (Vajinal fiş keşif gün ölçülen embriyonik gün 18-19) hamile bir sıçan elde edilir ve izofluran anestezi başları kesilerek ya da başka kabul yöntemle euthanize. </li><li> % 70 etanol ile sıçan alt püskürtme ve daha sonra kasık bölgesinde bir uçtan bir uca bir kesikarın boşluğuna sonuna öf. kirlenmesini önlemek için, sadece bu adımda deri yoluyla kesmek için özen gösterin. </li><li> % 70 etanol ile yeniden tahlil durulayın ve rahim maruz karın duvarı içinden kesin. İki rahim boynuzları çıkarın ve steril bir 100 mm Petri tabağına yerleştirin. </li><li> Laminer akış kaputu içinde kalan adımları gerçekleştirin. fetüsleri çevreleyen rahim zarı çıkarın. bunları başını kesmek ve 20 ml CMF-HBSS içeren bir 100 mm petri kafaları yerleştirin. </li><li> beynini inceleyin ve hemen buz üzerine 2 mL CMF-HBSS içeren 60 mm Petri tabağına yerleştirin. bir sonraki aşama için yeterli bir boş alan bırakacak tabak başına 2-3 beyinleri toplayın. </li><li> bir mikroskop altında iki hemisferdeki orta hat meninks kaldırdığını ve hipokampusların teşrih ve 4.5 ml CMF-HBSS içeren 60 mm Petri tabağına yerleştirin. Hipokampus hilal biçimli Struc olarak ayırt edilebilir unutmayınkortikal yarımkürede medial yüzeyinde Ture ve bir ventrikül tarafından yanal sınırlanmıştır olarak çıkarmak kolaydır. </li><li> 15 ml tüp toplandı hipokampal doku ve CMF-HBSS aktarın. % 2.5 tripsin 0.5 mL ekleyin ve daha sonra 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. bu nazik ve verimini artırmak, çünkü papain yerine tripsin kullanılabilmektedir. </li><li> Yavaşça tüpün altındaki rahatsız hipokampal doku bırakarak Pasteur pipeti ile tripsin solüsyonu çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de kuluçka sırasında yavaşça 5 ml CMF-HBSS ile iki kez doku yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, dokuya CMF-HBSS yeterli bir hacminin eklenmesiyle, en az 5 mL toplam hacmi getirmek. 8&#39;e kadar fazla 10 yavrularından hipokampi varsa ml CMF-HBSS eklenebilir. </li><li> Doku disosiasyon için yangın cilalı pipetler iki çeşidini hazırlayın. Bir varyant uç pipet ama ateş cilalı pürüzsüzleştirilmiş kenarları olan normal bir çaptadır. diğer varikarınca yarı yarıya azaltılmış uç çapı olan bir tanesidir. Kısaca, bir alev kaynağı ile çapraz bir cam Pasteur pipet ucu açığa, ve daha sonra pipet uçları inceleyin. <ol><li> uç kenarı pürüzsüzleştirilmiş edilmiş ya da çapı azaltılmış kadar yineleyin. Doku bu hücrelerin zarar vermeden tek hücreler elde ayrışmış olduğundan emin olmak için ideal bir çapa bulmak için pratik önemlidir. </li></ol></li><li> bir düz kenarlı, normal cam Pasteur pipeti ile önce yaklaşık 10 geçiş ile hipokampal doku toz haline getirilir ve indirgenmiş çaplı pipeti ile daha sonra 5 ila 10 geçer. Amaç hiçbir ile hücre veya çok az doku kümeleri homojen çözelti elde etmektir. </li><li> Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğu belirleyin. iki hemisferden hipokampi bir araya getirildiğinde tipik olarak, yavru başına 0,8 milyon 1.0 hücreler elde edilir. </li><li> yemekleri hücre süspansiyonu yeterli hacmi aktarın60 mm tabak başına 300,000 hücrelik bir kaplama yoğunluğu elde etmek için orta kaplama 4 mL poli-L-lizin kaplı lamelleri içeren. hücre yoğunluğu amaçlanan deney bağlı olarak, 100,000 ila 500,000 arasında değişebilir. </li><li> 3-4 saat sonra, NBG ortamı glial hücrelerini içeren tabaklar bağlı nöronlarla lamelleri aktarın. Bu nöronlar kaplanmıştır üzerinde tarafı aşağı glial hücre tabakası doğru bakacak şekilde yapılmalıdır. glia çanak başına 4-5 lamelleri toplam ekleyin. </li><li> İki ya da üç gün sonra kaplama, glial büyüme tutuklama çanak başına 5 uM&#39;lik bir son konsantrasyona Ara-C çözüm ekleyin. </li><li> Her bir besleme taze ortam 2.5 mL eski orta 2 mL değiştirerek haftada bir kez hücreler besleyin. eklenen ekstra ortamı zaman içinde buharlaştırma telafi etmek, ve ortamın yalnızca bir kısmı glial hücreler tarafından ortamın sürekli kurutma sağlamak için değiştirilir. Bu kültürler (en az bir ay süreyle tipik sağlıklıŞekil 3). Nöronun hayatta kalması, 100 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek için kültür ortamına APV eklenerek geliştirilebilir. APV bir NMDA reseptör antagonisti olup, glutamat eksitotoksisitesi azaltarak hayatta kalmasını teşvik eder. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126, 397-425 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+after+ChR2+in+neurons--views+from+the+community.">Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community.</a> Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).</li><li>Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+synaptic+plasticity.">The cell biology of synaptic plasticity.</a> Science. 334, 623-628 (2011).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPARs+and+synaptic+plasticity:+the+last+25+years.">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80, 704-717 (2013).</li><li>Luscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+AMPA+receptor+cycling+in+synaptic+transmission+and+plasticity.">Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity.</a> Neuron. 24, 649-658 (1999).</li><li>Varoqueaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+determine+synapse+maturation+and+function.">Neuroligins determine synapse maturation and function.</a> Neuron. 51, 741-754 (2006).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li><li>Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione+with+the+N-methyl-D-aspartate+receptor-associated+glycine+binding+site.">Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site.</a> Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+low-density+culture.">Rat hippocampal neurons in low-density culture.</a> Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).</li><li>Hanisch, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+as+a+source+and+target+of+cytokines.">Microglia as a source and target of cytokines.</a> Glia. 40, 140-155 (2002).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kültürleme nöronların &quot;sandviç&quot; yöntemi başka yerlerde iyi anlatılmış olmasına rağmen 2, 11, bunu kabul etmek isteyen araştırmacılar için hayal kırıklığı yol açabilir sadece metin olarak tarif etmek oldukça zordur protokol boyunca çeşitli adımlar vardır. Glial kültür, lamel hazırlanması ve nöron kültürü ve bakım: yöntem, üç ana iş akışları ayrılabilir. Üç hazırlıkları Her ak?...

Beyin nöronların karmaşık ağlar halinde düzenlenmiştir. ağ etkinliği ve beyin fonksiyonu için bireysel nöronların katkı molekül bileşimi ve bunların fizyolojik özelliklerinin perturbance seçici değiştirilmesi ile incelenebilir. bireysel nöronların genetik ve kimyasal işleme sonrakinin hücresel heterojenlik ve karmaşıklığı ile serbest, sağlam beyin dokusunda daha kültüre edilmiş nöronlarda muhtemelen daha kolaydır. kültürde Nöronlar iyi tanımlanmış aksonal ve dendritik milleri geliştirmek ve birbirleriyle kapsamlı sinaptik bağlantıları oluşturur. Yetişkin hayvanların veya sinir sisteminin diğer bölgelerden nöron kültürü mümkün olsa da, embriyonik hippokampal kültürler sık sık tarif piramidal hücre popülasyonu ve nispeten düşük glial yoğunluğu 1, 2 nedeniyle tercih edilir. kültürde düşük yoğunlukta yetiştirilir hipokampal nöronlar bilhassa ame olanalt hücresel lokalizasyonu, protein değiş tokuşunu, nöronal polarite ve sinaps gelişimini çalışmaya nable. Kültür nöronlar da kapsamlı sinaptik plastisite 3, 4, 5, 6, moleküler süreçler üzerinde çalışılması olarak kullanılmıştır. Doğum sonrası hayatta olmayan küresel genetik delesyonu olan farelerden alınan Nöron kültürü hazırlıkları belli genlerin 7 hücresel ve sinaptik roller okuyan özellikle yararlıdır olmuştur. Beyinde gibi, kültürlenmiş hipokampal nöronlar glial hücrelerden trofik desteğine bağlıdır. Bu kendi kültür zorlaştırmaktadır ve bu destek verilir hangi birkaç farklı yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Yaygın olarak kullanılan bir yöntem, glial hücreler 8 ya da edinilmiş Hipp kirletici glial hücreler sağlayan bir tek tabaka üzerine direkt olarak nöronlar kaplama içerirocampal doku çoğalır ve nöronlar 9 altında bir tek katman oluşturmak için. Bu yöntem bazı başarılar sağlamasına rağmen, ortaya çıkan nöronal kültürün kirlilik görüntüleme deneyleri için sakıncalıdır. Nöron kültürü Bir başka sık kullanılan yöntem, tamamen tabaka glial besleyici Çıkış bırakın ve bunun yerine belirli bir büyüme ortamında 10 şeklinde trofik destek sağlamaktır. Burada, &quot;sandviç&quot; ya da nöron kültürü 2, 11 &quot;Banker&quot; yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, daha sonra parafin mumu ile ayrılmış, glial hücrelerin tek bir tabakası üzerinde asılı duran cam lameller üzerinde hipokampal nöronlar kaplama içerir. Bu altta yatan glial tek tabaka trofik destek için izin verirken glia kirletmeden nöronların homojen nüfusun uzun vadeli kültürü kolaylaştırır. Nöronlar yeterli yaş ve olgunluk düzeyine ait olduğunda,nöron lamelleri-çevrilmiş üzerinden glial çanak ve görüntüleme ya da işlevsel tahlillerde kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps (#5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps (#PP)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25&#160;mm</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflorane</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 105 Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>2105-841</td>
			<td>Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes with cotton filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butane bunsen burner</td>
			<td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td>
			<td>Model 65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>Corning, Inc</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks (75 cm^2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum (BGS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3054103</td>
			<td>Heat-inactivation is recommended before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate (borax)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9876-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity Convection Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89511-404</td>
			<td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath (Sonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>62786-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Staining Racks</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&#160;GmbH</td>
			<td>1001/18</td>
			<td>Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Used with BD syringe for filter-sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td>Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-16Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

low-density primary hippocampal neuron culture

kültür içinde tek tek sinir hücrelerinin yapısı ve fizyolojisi sonda yeteneği nörobiyolojisinin çalışma için çok önemlidir, ve tek tek hücreler veya tanımlanmış ağlar genetik ve kimyasal manipülasyonu esnekliğe olanak sağlamaktadır. sağlam beyin doku ile karşılaştırıldığında manipülasyon gibi kolaylığı düşük kültür sisteminde daha basittir. Bu birincil nöronların izolasyonu ve büyümesi için birçok yöntemler varsa da, her biri kendi sınırlamaları vardır. Bu protokol daha sonra glial hücrelerin tek bir tabakası üzerinde asılı duran cam lameller, düşük yoğunluklu ve yüksek saflıkta kemirgen embriyonik hippokampal nöronlar yetiştirmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu &#39;sandviç kültürü&#39; altta yatan glial tek tabaka trofik destek için izin verirken nöronların nüfusu münhasır uzun vadeli büyüme için izin verir. nöronlar yeterli yaş ve olgunluk seviyesi olduğunda, nöron lamelleri glial çanak Çıkış ters çevrilmekte ve görüntüleme ya da işlevsel tahlillerde kullanılabilir. Nöronlar gBu yöntemle rown genellikle birkaç hafta boyunca hayatta ve kapsamlı milleri, sinaptik bağlantıları ve ağ özelliklerini geliştirir.

Birincil sinir hücresi kültürünün bu &quot;sandviç&quot; yönteminde, hipokampal nöronlar (Şekil 3) parafin boncuklar (Şekil 2) ile ayrılan glial hücreler (Şekil 1) bir yatakta büyür. Bu nöronlar selektif asgari glial hücre kontaminasyonu ile cam lameller üzerinde büyüyecek ama doku kültürü çanak büyüyen glia yeterli trofik destek almasını sağlamaktadır. Tipik olarak, nöronlar&gt; 3 hafta kültür içinde mu...

Watch this Scientific Journal Video about Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture at JoVE.com

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Bu makalede, bir glial tek tabakalı üzerinde ters cam lamelleri büyüyen düşük yoğunluklu birincil hipokampal nöronlar kültürleme için protokol açıklar. nöron ve glial tabakalar parafin mumu ile ayrılır. Bu yöntem ile yetiştirilen nöronlar yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme ve işlevsel tahliller için uygundur.

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.4K Görüntüleme.  University of Manitoba.  Bu makalede, bir glial tek tabakalı üzerinde ters cam lamelleri büyüyen düşük yoğunluklu birincil hipokampal nöronlar kültürleme için protokol açıklar. nöron ve glial tabakalar parafin mumu ile ayrılır. Bu yöntem ile yetiştirilen nöronlar yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme ve işlevsel tahliller için uygundur. 

Video: Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Nörobilim

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Fare Beyin<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Nörogelişimsel Bozukluklar Fare Modeli Mekansal Öğrenme ardından Hipokampal Nöron Faaliyet immünohistokimyasal Görselleştirme

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...