This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

Fare dokuları elde etmek için kullanılan uygulamalar Trento Üniversitesi Hayvanları Koruma (OPBA) (İtalya) için Vücut tarafından kabul edildi, protokol yok. 04-2015 olarak Madde.31 başına Kanun Hükmünde Kararname no. 26/2014. Tüm fareler Bütünleştirici Biyoloji Merkezi&#39;nin (CIBIO), Trento Üniversitesi, İtalya Model Organizma Tesisleri&#39;nde tutuldu. Dikkat: numunelerin herhangi RNA bozulmasını önlemek RNaz kontaminasyonu en aza indirmek için DEPC arıtılmış su kullanılarak tüm tamponları hazırlamak. Tüm beyinlerinden polizom hazırlanması 1. <ol><li> beyin dokularında toplama (15 dk) <ol><li> 5 dakika 36 için CO2 ile boğularak vahşi tip fare suşu C57BL / 6 öldürülür. Dikkatle, kafatası 36 beyin teşrih 1.5 ml tüp içine doku yerleştirin ve hemen sıvı nitrojen içinde yerleştirin. kullanılıncaya kadar -80 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> lizatının hazırlanması (30 dakika) <ol><li> kullanarak tüm beyin dokusu toz halineSıvı azot altında bir havan. </li><li> Soğuk mikrosantrifüj tüpüne yaklaşık 25 mg toz aktarın ve hemen hemen aşağı yukarı pipetleme 25 kez ile Lizis Tamponu (bakınız Tablo 1) 0.8 ml ekleyin ve hücre bozabilir (pulverize doku çözülme önlemek için). </li><li> hücre yıkıntıları pelet haline 4 ° C de 1 dakika için 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın ve 15 dakika süreyle buz üzerinde tüp tutun. </li><li> çekirdek ve mitokondri pelet 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de santrifüjleyin tüpü. </li><li> Yeni bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın. </li><li> 6 aylık bir süre için -80 ° C &#39;de süpernatan saklayın veya hemen kullanın. </li></ol></li><li> Sukroz gradyanlı hazırlanması ve santrifüj (2 saat ve 30 dakika) <ol><li> RNaz içermeyen su (dietilpirokarbonat muamele edilmiş, su (DEPC su) ya da ticari) ile iyice yıkayın ultrasantrifüj tüplerid% 3 H 2 O 2 / DEPC H2O çözüm. </li><li> Buz üzerinde tüpler yerleştirin ve her bir tüp (sakaroz çözeltileri için Tablo 1 &#39;e bakınız) altındaki soğuk% 50 sukroz çözeltisi 5.5 ml. Dikkatle tüpü tamamen dolana kadar keskin bir interfaz korumak için interfaz yakın kalmak, damla% 15 sakaroz çözeltisini damla ekleyin. Tüp tamamen dolduğunda, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için bir lastik tıpa ile kapatın. </li><li> Soğuk bir odada yavaşça yatay tüpler bırakmaya ve 2 saat boyunca bu konumda tutun. Bu süreden sonra, yavaşça geri dik konuma getirin tüpleri düzeltin ve buz üzerine koydu. geçişlerini şimdi kullanılmaya hazırdır. Seçenek olarak ise, önceki bilinen bir gradyanı kullanılarak% 15-50 sakroz gradyanı hazırlar. </li><li> Soğuk bir odada degrade üstünden dikkatlice 1.0 ml kaldırmak ve sitozolik lizat ile damla sakaroz damla (yani, yüzen ste elde bindirmeks 1.2). </li><li> Dikkatle sallanan bir kova rotor kova içine tüpler indirin. Ultrasantrifüj işlemi kullanılarak 4 ° C&#39;de 180,000 x g&#39;de 100 dakika boyunca geçişlerini santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, gradyanlar stabilize izin 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca kendi kova tüpler bırakın. </li></ol></li><li> Sükroz Gradyan Bölünmesi (2 saat) <ol><li> Dikkatle ultrasantrifüjdeki rotor bir ultrasantrifüjdeki tüp kaldırmak ve bir Yoğunluk Gradient Fraksiyonu Sistemi toplayıcı cihaz üzerinde monte edin. UV / VIS detektörü (bakınız Şekil 1, üst panel) 260 nm&#39;deki soğurma gücü izlenerek, 1 ml&#39;lik fraksiyonların toplayın. Buz üzerinde toplanan fraksiyonlar tutun. </li><li> Ilgi kesirler 30-40 ul hacimde hazırlayın kullanımı kadar -80 ° C saklamadan önce buz üzerinde saklayın. İkiden fazla donma-çözülme döngüleri uygulanan alikotları veya sakaroz kesirler kullanmayın (Şekil 1 alt paneline bakın). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> Atomik Kuvvet Mikroskobu 2. Numune Hazırlama (3 saat) <ol><li> mika levhalar soyulabilir, bant kullanarak. </li><li> DEPC su ile mika levhaları 3-4 kez yıkayın ve küçük bir Petri kabı içine yerleştirin. Sonra hava ile yüzey kurutun. </li><li> 1 mM N&#39;nin 4 200 ul mika kapağı ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> nikel çözüm çıkarın ve sonra hava kullanarak yüzeyini kurulayın. buz üzerinde mika ile Petri kabı koyarak 4 ° C&#39;de gelecekteki tüm adımları uygulayın. </li><li> buz üzerinde 1.4.2 elde edilen bir kısım Çözülme ve yavaşça mika damla örnek damla tüm ekleyin. 100-200 ul ucu kullanarak, mika tüm yüzeye örnek yayıldı. 3 dakika boyunca buz üzerinde örnek inkübe edin. </li><li> 200 ul soğuk tampon-AFM ile damla mika levha damla Kapak (Tablo 1 e bakınız) ve buz üzerinde 1 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> sıvı Görüntüleme <ol><li> dikkatle Tampon-AFM çıkarın ve mika levhaları 3-4 defa yıkayın200 ul soğuk Tampon-AFM ile s aşırı sukroz kaldırın. Sonra mika levhaları soğuk Yıkama Çözeltisi ile 3 kere yıkayın çözümün bazı mikrolitre kapsadığı mika yüzeyi bırakarak, (bakınız Tablo 1). </li><li> 3 (Görüntü edinimi) işaret gidin. </li></ol></li><li> Havada görüntüleme <ol><li> Dikkatle Tampon-AFM kaldırmak ve aşırı sukroz çıkarmak için 200 ul soğuk Tampon-AFM ile mika 3-4 kez yıkayın. Ardından, mika, soğuk Yıkama Çözeltisi ile 3 kere yıkayın (Tablo 1) ve kağıt kullanarak fazla suyu boşaltın. </li><li> kısmen açık Petri kabı üst kimyasal kaputun altında kurumaya örnek bırakın. 2 saat sonra, oda sıcaklığında Petri kabı ve mağaza kapatın. bu uzun bir süre stabil olarak 2-3 saat sonra örnek ölçün. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition (termal stabilizasyon sonra resim başına 15 dk) Not: mika üzerinde hareketsiz Polisomlar AC modunu kullanarak, havada ya da sıvı olarak görüntülenebilir. <ol><li> çift ​​taraflı bant kullanarak numune tutucu için mika takın. </li><li> üreticinin talimatlarına aşağıdaki AFM aşamasında numune tutucu yerleştirin. Mümkünse görüntüleme sıvı içinde, zaman içinde Polizom istikrarı artırmak için bir sıcaklıkta daha düşük 25 ° C örnek korumak çalıştığınızda. </li><li> AC görüntüleme için uygun bir konsol seçin ve üreticinin yönergeleri izleyerek uç tutucuya monte edilir. Burada, hava görüntüleme için 2-20 N / m ve sıvı görüntüleme için yaklaşık 0.1 N / m arasında sürekli bir güçle kullanım dirsekleri. </li><li> konsol üzerinde lazer nokta ayarlayın ve kadran detektör sinyallerini sıfır. </li><li> bir fırsat sürüş frekansı seçin ve 10-20 nm bir genlik ile konsol sürücü. </li><li> ucu yüzeyine oturana kadar örnek yaklaşın. </li><li> En az 512x512 piksel görüntüleri (piksel genişlik &lt;4 nm) elde, 2x2 um tarama alanı seçin canlı arka plan çıkarma modu ve 20-25 nm Z ölçeğini seçin. </li><li> t inceleyino görüntü aralığı 25-30 nm hava ve 25 ve sıvı 30 nm genişliğinde satın alırken 10 ve 15 nm arasındaki yükseklik ile karakterize yuvarlak nesnelerin varlığına arıyor. keskin nesneler görüntülenmiştir kadar set değeri ve geri besleme parametrelerini ayarlayın. Arka plan bazı 2-4 nm yüksekliği nesneleri (Şekil 2A ve B) ile, iyi örneklerinde nispeten düz görünmelidir. </li><li> (Nokta 3.8 de belirtildiği gibi) görüntü iyi görünüyorsa, farklı örnek alanlarda birkaç (en az on) 2x2 mikron taramaları kazanır. </li><li> (Isteğe bağlı). Gerekirse, seçilen polizom yüksek çözünürlüklü görüntü elde (Şekil 2C bakınız). </li><li> AFM görüntüleri keyfi eğimini kaldırma ve etkileri sürüklenen düzeltmek için yazılım düzeltmeleri (düzlem çıkarma ve hat-by-line düzeltme algoritmaları) uygulayın. </li></ol> 4. Veri Analizi (resim başına 30 dk) <ol><li> preferent: ImageJ (bir ölçek faktörü uygulamak opsiyonel) İhracat görüntüleriially örneğin, bir kayıpsız sıkıştırma biçimini kullanarak, TIFF formatında (Şekil 3A bakınız). </li><li> Örneklemin istatistiksel özelliklerini polizom içinde ribozomlar (Şekil 3B) saymak ve hesaplamak için (ImageJ makro / araç seti alt dizininde kopyalanacak) ImageJ makro araç seti RiboPick.ijm kullanın (Şekil 3C). <ol><li> programı başlatır &lt;Okuma görüntü&gt; aracını kullanarak bir görüntü yükleme başlayın. </li><li> Standart ImageJ &lt;Nokta seçimi&gt; aracı (shift + sol klik ribozomların çok seçimini sağlar) ile ribozom merkezleri seçin. &lt;Mark ribozomlar&gt; aracıyla seçilen ribozomlar işaretleyin. Ribozom koordinatlar özel bir metin penceresinde görüntülenir. </li><li> noktasında 4.2.2 de belirtilen prosedür tekrar aynı Polizom daha fazla ribozomlar ekleyin. </li><li> birinciye Son eklenen ribozom kaldırma &lt;Geri Al son çekme&gt; aracını (başlar kullanarak yanlış işaretlenmiş ribozomlar kaldır212; Geçerli Polizom sadece). </li><li> Polizom tamamlandığında, &lt;Yeni Polizom&gt; aracını kullanın. Polizom numarası görüntüye bir kaplama olarak eklenir olarak, metin penceresi güncellenir. </li><li> Kullan Ribozom dosyası (görüntü varsayılan birimlerinin kullanıldığı) ve aldı ribozomlar ve Polisomlar özetleyen bir PNG resmi koordinatlarını yazmak için &lt;sonuçları ve yakın Kaydet&gt;. orijinal görüntü kaydedildi olmadan kapanır. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Buttgereit, F., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+ATP-consuming+processes+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells.</a> Biochem J. 312, 163-167 (1995).</li>
<li>Russell, J. B., Cook, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+bacterial+growth%3A+balance+of+anabolic+and+catabolic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+signatures+and+mRNA+concentration+can+explain+two-thirds+of+protein+abundance+variation+in+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line.</a> Mol Syst Biol. 6, 400(2010).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13, 220(2012).</li>
<li>Kondrashov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+specificity+in+Hox+mRNA+translation+and+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning.</a> Cell. 145 (3), 383-397 (2011).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Pircher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA-derived+noncoding+RNA+targets+and+regulates+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome.</a> Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).</li>
<li>Simms, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+role+for+the+ribosome+in+determining+the+fate+of+oxidized+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA.</a> Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).</li>
<li>van Heesch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+localization+of+long+noncoding+RNAs+to+the+cytosol+and+mono-+and+polyribosomal+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes.</a> Genome Biol. 15 (1), R6(2014).</li>
<li>Preissler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not4-dependent+translational+repression+is+important+for+cellular+protein+homeostasis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast.</a> EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).</li>
<li>Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+particulate+component+of+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">A small particulate component of the cytoplasm.</a> J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).</li>
<li>McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+nascent+protein+by+ribosomes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).</li>
<li>Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+aggregate+engaged+in+protein+synthesis%3A+characterization+of+the+ergosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome.</a> Nature. 2 (197), 430-435 (1963).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+organization+of+vertebrate+centromeric+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).</li>
<li>Allen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+measurements+of+nucleosome+cores+assembled+along+defined+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences.</a> Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289 (5481), 905-920 (2000).</li>
<li>Schluenzen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+functionally+activated+small+ribosomal+subunit+at+3.3+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution.</a> Cell. 102 (5), 615-623 (2000).</li>
<li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li>
<li>Anger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+human+and+Drosophila+80S+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the human and Drosophila 80S ribosome.</a> Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).</li>
<li>Brandt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+3D+organization+of+bacterial+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The native 3D organization of bacterial polysomes.</a> Cell. 136, 261-271 (2009).</li>
<li>Myasnikov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+structure+of+the+left-handed+supra-molecular+helix+of+eukaryotic+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes.</a> Nat. Commun. 5, 5294(2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+circular+polyribosomes+on+eukaryotic+mRNA+without+cap-structure+and+poly%28A%29-tail%3A+a+cryo+electron+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+transitions+of+eukaryotic+polyribosomes+during+multi-round+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation.</a> Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).</li>
<li>Viero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+ribosome+assemblies+modulated+by+translation+are+the+building+blocks+of+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes.</a> J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).</li>
<li>Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+polyribosomes+in+intact+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells.</a> Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).</li>
<li>Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+ribosomes+and+initiation+complexes+from+rat+liver+as+revealed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy.</a> Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).</li>
<li>Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+and+atomic+force+microscopic+observation+of+polysomes+on+carbon-coated+grids+prepared+by+surface+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).</li>
<li>Mikamo, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+polysomes+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+liquid+solution+observed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy.</a> J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).</li>
<li>Mikamo-Satoh, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+gene-dependent+translational+progress+in+cellfree+protein+synthesis+by+real-space+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging.</a> Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).</li>
<li>Bernabò, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+translational+control+in+non-model+stressed+organisms+by+polysomal+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling.</a> J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboAbacus%3A+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853(2015).</li>
<li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li>
<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

DNA&#39;nın yapısı transkripsiyon ve kromatin organizasyonu gen ifadesinin transkripsiyonel kontrolü anlayışımızı ilerledikçe süreci tanımlamak için büyük önem olduğu kanıtlanmış gibi, doğru anlama geliştirmek için polizom organizasyonunu ve yapısını analiz etmek esastır çeviri ve düzenleme. tarif edilen protokol ile hafifçe düz bir yüzey üzerinde immobilize polizom optimal yoğunluğu, AFM görüntüleme için uygun elde edilir. uygun hazırlanan numuneler i...

Protein sentezi hücrelerinde 1,2 en çok enerji tüketen bir süreçtir. Bu nedenle, protein bolluğu ağırlıklı öteleme ziyade transkripsiyonel seviyede 3,4,5 kontrol edilir şaşırtıcı değildir. Polizom fonksiyonel proteinli okumalarla içine mRNA bilgiyi dönüştüren temel makromoleküler bileşenidir. Polisomlar şimdiye kadar birkaç öteleme kontroller 6-13 yakınsama makromoleküler kompleksleri olarak kabul edilmektedir. Ribozom yapısı 14- 16 çalışmaların yüzlerce rağmen, çeviri dinamikleri hakkında detaylı moleküler anlayışlar ve polizom topoloji sınırlı bir ilgi ile karşılaştı. Bunun bir sonucu olarak, yerli polysomal ribonükleoprotein kompleksinin organizasyonu ve tercüme üzerindeki potansiyel etkisi hala oldukça belirsiz sorunlardır. Polisomlar potansiyel neler nükleozom ve epigenetik contro yansıtma, henüz bilinmeyen sipariş ve işlevsel organizasyonları gizleyebilirls transkripsiyon alanı için temsil etmişlerdir. Nitekim, bu ilginç hipotezin araştırılması ek çalışmalar ve yeni teknik yaklaşımlar gerektirir. Bu doğrultuda, yapısal teknikler ve atomik kuvvet mikroskopisi fruitfully benzer nükleozom 17,18 için elde ne kadar, gen ifadesini kontrol etmek için yeni mekanizmalar çözülmeye işbirliği olabilir. Ribozom 14-16 keşfinden beri yapısı yoğun protein sentezi tabanında mekanizmaların moleküler bir açıklama temin prokaryotlarda 19,20, daha yakın zamanda, insan 22 maya 21 ve karakterize edilmiştir. Polisomlar başlangıçta tipik 2B geometrik örgütleri 14 oluşturan, endoplazmik retikulum zarı üzerinde kabul edildi. Daha önce belirtildiği gibi, Polizom montaj ribozom yapısı olarak sürekli ilgi nesnesi olmamıştır. Geçmişte, Polisomlar tr esasen çalışılmıştıransmission teknikleri EM-tabanlı. Ancak son zamanlarda, kriyo-EM teknikleri in vitro çeviri sistemleri 23-26 saflaştırılmış polizom 3D rekonstrüksiyonu, insan hücre lizatları 27 veya hücre 28 sağladı. Bu teknikler polizom 23, 26-28 ve buğday tohumu polizom 24 bitişik ribozom temas yüzeylerinin bir ön moleküler tanımındaki ribozom-ribozom organizasyon hakkında daha rafine bilgi sundu. Böylece, cryo-EM tomografi moleküler detaylı ribozom-ribozom etkileşimlerin açıklanmasını sağlar, ancak kapsamlı post-processing ile yatar ve rekonstrüksiyon verileri işlemek için ağır hesaplama kaynakları gerektiren analiz eder. Ayrıca, ribozom ribozom etkileşimlerinin moleküler detay elde etmek üzere, ribozom yüksek ölçüde çözülmesi harita gereklidir, ve referans ribozom bu tür bir kaç tür için kullanılabilir. Önemlisi, cryo-EM tomografi serbest RNA tespit etmek mümkün değildir. therefCevher, yeni teknikler tamamen çeviri makine organizasyonunu anlamak için gereklidir. Cryo-EM yanında, AFM de düşük ökaryotlar 29-33 ve insanlarda 27 polizom doğrudan görüntüleme için yararlı bir araç olarak kullanılmıştır. EM ile karşılaştırıldığında, AFM hiçbir örnek tespit veya etiketleme gerektirir. Buna ek olarak, ölçümler, yaklaşık olarak fizyolojik koşullar altında ve açıkça ribozomlar çıplak RNA şeritleri 27, her iki belirleme benzersiz olasılığı ile gerçekleştirilebilir. Tek polizom görüntüleme geniş ve ağır post-processing ve yeniden cryo-EM mikroskobu ile gerekli analizleri karşılaştırıldığında küçük post-processing çabayla nano çözünürlükte görüntülerin binlerce elde edilmesi, nispeten hızlı bir şekilde yapılabilir. Sonuç olarak, AFM veri işleme ve analiz pahalı iş istasyonları ve yüksek işlem gücü ihtiyacı yoktur. Bu nedenle, bu teknik polysomal şekilleri hakkında bilgi, morfolojik özellikleri (örneğin toplaryükseklik, uzunluk ve genişlik), ribozom yoğunlukları, serbest RNA&#39;nın varlığını ve kriyo-EM daha yüksek bir verimle polisom 27 ortalama ribozom sayısı. Bu şekilde, AFM Polisomlar 27 canlandıracak EM tekniklerine güçlü ve tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil etmektedir. Burada arınma gelen AFM görüntüye uygulanan ve fare beyin Polisomlar analiz veri analizi için tam bir boru hattı mevcut. önerilen protokol arıtma konularında ve AFM görüntüleme için kullanılan mika yüzeylerde polizom doğru birikimi üzerinde duruluyor. Kolayca AFM topluluğu tarafından kullanılan ortak yazılım ile gerçekleştirilebilir geleneksel parçacık analizine ek olarak, RiboPick adlı bir ImageJ 34 eklentisi, polisom 27 35 ortalama ribozom sayısını saymak için sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Sucrose gradient preparation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Polyallomer tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionation System&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Sucrose gradient fractionation</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualization</td></tr></tbody></table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

Translasyonel makine, yani, polisom ya polyribosome hücrelerde büyük ve en karmaşık sitoplazmik makine biridir. Ribozomlar, mRNA, çeşitli proteinlerin ve kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar tarafından oluşturulan Polisomlar, translasyonel kontrol gerçekleşecek platformlar entegre temsil eder. Ribozom yaygın çalışılmıştır Ancak, polizom organizasyonu hala kapsamlı bir anlayış yoktur. Bu nedenle çok çaba polisom organizasyon ve gömülebilir translasyonel kontrol herhangi bir yeni etki mekanizmasını açıklamak için gereklidir. Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) nano çözünürlükte 3D görüntülerin elde edilmesine izin verir tarama prob mikroskobu türüdür. Elektron mikroskopisi (EM) teknikleri ile karşılaştırıldığında, AFM ana avantajlarından biri, hava ve çözelti, iki görüntü binlerce elde örnek sağlayan olmasıdır boyama ve pro sabitlenmesi için herhangi bir gerek olmaksızın, yaklaşık olarak fizyolojik koşullar altında muhafaza edilmesiprosedürlerinin. Burada, fare beyin ve mika alt tabakalar üzerine birikmesinden polizom doğru saflaştırılması için detaylı bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, AFM ve üç boyutlu nesne olarak yeniden sahip hava ve sıvı içinde polisom görüntüleme sağlar. cryo-elektron mikroskopisi (cryo-EM) Tamamlayıcı, önerilen yöntemin uygun sistematik Polisomlar analiz ve organizasyon eğitimi için kullanılabilir.

Bütün fare beyninin sukroz gradyanlı polysomal profil Kendi ağırlığı ve büyüklüğü uygun bir şekilde makromolekülleri ayıran polysomal profil ile bir selüler lizat polizom arıtmak mümkündür. polysomal profil ile, bu örnekteki gibi kültürlenen hücreler ya da dokulardan elde edilen sitoplazmik lizatları (çökelme katsayılarına göre 40S ve 60S alt birimleri, 80S ribozom ve polizom ser...

Watch this Scientific Journal Video about Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Görüntüleme.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

Video: Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Biyomühendislik

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Mühendislik

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biyokimya

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanarak Yaşam Hücrelerinin Mekanik Özellikleri Ölçme

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Yüzlerce C. albicans Hücresinde Biyo-Atomik Kuvvet Mikroskop Ölçümlerinin Otomasyonu

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

Tek-T hücreleri veya tek parçacık Immünolojik tek hücreli kuvvet spektroskopisi ile Atomic Force mikroskop Cantilevers functionalization

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

 Imaging Polysomes Isolated from a Mouse Brain Using Atomic Force Microscopy

Source: Lunelli, L.,&#160;et. al. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy.&#160;J. Vis. Exp.(2016).This video demonstrates the imaging of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Nörobilim

Neuroimaging

Synaptic & Cellular Imaging

Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, polymers, and biological samples. AFM offers over 1000 times more resolution than the optical imaging system. Images generated from AFM are three-dimensional surface profiles, offering an advantage over the flat, two-dimensional images from other imaging techniques.
The AFM Probe
The probe is regarded as the heart of any AFM setup and comprises the cantilever and tip assembly. Probes are the most commonly replaced part on this type of microscope because&#160; the constant interaction with the samples wears down the tip. Therefore, the choice of material for the probe depends on the properties of the sample. Silicon probes, used to analyze hard samples, are stiffer and sharper than silicon nitride probes, which are better suited to scan softer samples. These sharp tips are produced using electrochemical etching or carbon nanotubes for higher accuracy analysis.
Imaging Modes of AFM
In AFM, surface topography is studied using the interaction between the probe tip and the sample surface. There are two main imaging modes &#8212; a static mode, also referred to as the contact mode, and a dynamic mode.
In the static or contact mode, the tip of the probe is in continuous contact with the sample surface. As the tip drags over the surface, repulsive forces between the sample and the tip result in the cantilever bending, which is recorded. The entire specimen surface is scanned back and forth in both x- and y-axes, called raster scanning, while the vertical movement of the cantilever records the z-axis, thus generating a 3D image.
In the dynamic mode, the probe oscillates just above the sample surface, coming close to, but not touching the surface. Attractive and repulsive forces determine the variation in distance between the tip and the sample, affecting the amplitude of cantilever oscillation. This feedback is recorded to construct the surface topography of the sample.

Atomik Kuvvet Mikroskobu

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, ...