This work was supported by NIH Grant HL-113905

Bu çalışma için yapılan tüm hayvan prosedürleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde Nova Southeastern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi, 8 inci Edition (Ulusal Akademiler Press, Washington, DC 2011 ). Reseptör Otoradyografi 1. hazırlanması Doku Bölümler <ol><li> kurban üzerine, hasat taze beyin dokuları ve alüminyum folyo ve yerinde sarın -20 ° C derin dondurucuda en kısa sürede. 20 ° C derin dondurucu - Doğru şekli korumak kafatası içini taklit eden bir beyin kalıp içinde beyinleri yerleştirmek için, alüminyum folyo ve yerde sarın. 30 dakika sonra, bir yerde yapışmalı dondurucu saklama torbasında doku ve uzun süreli depolama için -80 ° C derin dondurucuda taşıyın. <ol><li> -80 -10 ° C ve -18 ° C maksimum minimum ayarlanmış bir kriostada C derin dondurucuda ve transferi ° önlemek için çözülme ilgi taze dondurulmuş doku örneği elde edin. </li&gt; <li> doku üzerine numune, sadece ortam içine numunenin çok küçük bir kısmını gömme bir glikol ve reçine-tabanlı gömme ortamı ile monte yerleştirin. beyin için, beyin koronal planda kesit etkinleştirmek için dikey olarak monte edilir. </li></ol></li><li> Doku cryostat içinde mikrotom üzerine monte ve sıkıca yerinde sıkın yerleştirin. dorso-ventral eksen dik yaygın olarak kullanılan beyin atlasları olduğunu aynı antero-Postero koordinatlarda olan beynin sol ve sağ tarafını sağlamak ve. </li><li> İstenen kalınlıkta kesme başlar (20 um tavsiye edilir) ve slayt alanı daha büyük bir yüzey alanına sahip bir dikey yönde mikroskop lamı üzerine bölümleri monte eritin. Slaytlar ilk seti (Şekil 3) 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 ve 1-5 etiketli, yani beş sıralı setleri Slaytlarınıza bölümleri toplayın. </li><li> bölümleri ile slaytlar bir dizi doldurduktan sonra, en fazla 1 saat boyunca kuru hava slaytlar, sonra sli yer izin-20 ° C&#39;de bir plastik slayt kendi kendine kapanan dondurucu saklama torbasında kutu ve mağaza des. </li></ol> 2. Alıcı Otoradyografi UYARI: Radyoaktivite. radyoaktivite işlemek için koruyucu kıyafetleri kullanın. Bertaraf kurulması bağımlı olduğunu, ve düzgün (yarım-life 60 gün) çürümeye ya da sertifikalı firma tarafından alınmayı kurallara uymak zorundadır. <ol><li> (Şekil 5) -20 ° C dondurucu ilgi &quot;-2&quot; &quot;-1&quot; ve slaytlar çıkarın ve slayt kulpları içine monte edin. Birlikte &#39;non-spesifik&#39; tedavisi için &quot;-1&quot; slaytlar ve toplam &#39;tedavi için &quot;-2&quot; slaytlar monte edin. Bağlama kavanoz yalnızca 10 içerir, bakiyeleri (Tablo 1) &#39;Spesifik olmayan &quot;kavanoz 2R antagonisti, PD123319, bir 10 uM nihai konsantrasyonlar içerir ve deney ortamı tamponunda, 1R antagonisti, (AM5) bir losartan AM5 mikron PD123319. </li><li> slayt tersçeneler, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca AM5 35-40 ml dolu ön inkübasyon Coplin kavanoz içine slaytlar ve ilgili inhibitörleri yer. 4 dakika aralıklarla öncesi inkübasyon banyosu içerisinde müteakip setleri başlatın. </li><li> Hemen oda 60-90 dakika boyunca 10 AM5 ml artı ilgili inhibitörleri ile (Şekil 4&#39;te hesaplanan) 125I-sı-Ang II önceden tespit edilmiş bir konsantrasyonunu ihtiva eden inkübasyon kayıcı postaları ön inkübasyon çözeltisinden slaytlar aktarmak sıcaklık. Yeterli radyoligand varsa, 10 slaytlar modifiye slayt kulpları (arka arkaya) yerleştirilir ve Coplin kavanozlarda 125 I-SI-Ang II ile inkübe edilebilir. </li><li> Talep (gerekirse), benek, yavaşça, iki ayrı kaplar içinde damıtılmış su, 400 ml 1-2 saniye boyunca döndürülerek yıkayın kayıcı kılıf içine geri çekilir. </li><li> Tam 1 dakika her (Şekil 4 &lt;gösterildiği gibi için AM5 35-40 ml içeren dört Coplin kavanoz içine sırayla slaytlar aktarın/ Strong&gt; &#39;). </li><li> Son 1 dakika durulama sonra, yavaşça buzla soğutulmuş damıtılmış su dört değişiklikler 1-2 saniye için bölümler girdap. </li><li> -Darbe kurumaya soğuk hava ile slaytlar (Dikkat: sıcak hava radyoaktif bileşik uçucu hale) 4 dakika (Şekil 5) için farklı açılardan kurmak dört saç kurutma makinesi kullanarak, tüm bölümleri kuruyana kadar, daha sonra bir kağıt havlu üzerine koyun. </li><li> Dağı dokular çift taraflı bant kullanarak X-ışını filmine apozisyon bir karton üzerine yukarı bakacak şekilde kayar. </li><li> En az bir Dağı, her karton üzerine 125 İyot kalibrasyon standart slayt (Şekil 6). Not: Kalibrasyon standartları iyice beyin kesitleri ile aynı kalınlıkta kesildi ve mikroskop üzerine çözülme monte kriyostat olan 1 mL&#39;lik bir tüberkülin şırınga içinde santrifüjleme ile sıkıştırılmış bir fenol halkası ihtiva eden bir bileşik, bağlanmış 125 iyot ile karıştırılmış, beyin macun oluşur slaytlar. Alternatif olarak, 125I kalibrasyon standartları20 um kalınlığında kesitler plastik reçine ticari olarak elde edilebilir. Bu standartlarda plastik reçine kısmen böyle% 40 ~ bir doku denklik kalibrasyon hesaba gerektiğini radyasyondan filmi korur. </li></ol> 3. Film Pozlama ve Kalkınma <ol><li> bir kayış-arka X-ışını kaset ve otoradyografi film ile bir karanlık oda geçin. Kaseti açın ve içindeki slaytlar (Şekil 6) ile karton yerleştirin. <ol><li> Işıkları kapatın ve Karanlıkodanızda açın. Dikkatle, X-Ray film kutusunu açmak bir filmi çıkarın ve kaset slaytlar üstünde (sağ alt köşede tırtıklı kenar) filmi parlak tarafı yukarı yerleştirin. Dikkatle kaseti kapatın ve hafif (Şekil 6) dışarı mühürlemek için kilit çubuklarını bükün. -20 ° C&#39;de birkaç gün ila birkaç hafta için slaytlar Açığa. </li></ol></li><li> karanlık odada, kaseti açın ve filmin gelişen proc devamess. <ol><li> ardışık tepsilerine slaytlar yerleştirin; 2 dakika için geliştirici, 5 dakika için% 5 buzlu asetik 30 saniye için asit ve fixer içeren su. filmler 20 dakika akan su ile bir tepsiye yerleştirilir, daha sonra en fazla 10 saniye boyunca Photoflo yerleştirilir ve kapattı. Düşük bağlama ile alanlardan ölçülebilir sinyalleri elde etmek için yeterince uzun, ama çok uzun zaman yüksek bağlayıcı olduğu bölgelerde filmini doyurmak için: maruziyet süresi ampirik olarak belirlenir ve farklı pozlama süreleri ile birden filmleri içerebilir: Not. kabul edilebilir riskler elde edildikten sonra, bir sonraki adıma geçin. </li></ol></li></ol> 4. Histoloji <ol><li> Tionin leke ve boyama reaktifleri (Tablo 2, Şekil 7) hazırlayın. <ol><li> Slayt rafa &quot;-3&quot; slaytlar yerleştirin ve 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile başlayarak sıralı transferi, daha sonra 10 dakika boyunca tionin leke çözeltisi Deion halinde üç dip ardındanözelleşmiş suları ve deiyonize su içinde bir 30 saniye yıkama. </li><li> aşağıdaki gibi su takiben, etanol yıkar içine slayt raf yerleştirin; 1 dakika her biri için,% 100 iki etanol yıkaması, ardından% 50,% 70, ve 30 saniye süreyle% 90. Son olarak, 3 dakika boyunca iksilen içine kayar ızgarayı daha sonra 5 dakika için bir ikinci ksilen çözeltisine aktarılmaz. </li></ol></li><li> Son iksilen banyosundan her seferinde bir slayt çıkarın ve organik çözücü montaj orta bir reçine ile sürgünün üst kenarını kapsayan ve slayt üzerine 24 mm x 60 mm&#39;lik bir örtücü cam yerleştirin. ~ 48 saat slaytlar için yeterince kurumasını bekleyin ve sonra 2.400 dpi gri bilgisayara tarayın. </li></ol> 5. Densitometrik Görüntü Analizi <ol><li> sol alt köşesinde tırtıklı kenarı aşağı filmin parlak tarafı yerleştirin ve görüntüleme sistemi bilgisayarda herhangi bir bozulma olmadan film yoğunluğu bilgisini iletebilen özel bir tarayıcı kullanarak tarayın. </li><li> özel görüntüleme sys açtem ve kullanmak kalibrasyon çubukları filmin görüntüleri (- 12 Şekil 9) gelecekteki dansitometrik analizi için kalibrasyon standartları oluşturmak. </li><li> Bir şablon kurulması veya ampirik ilgi alanları özetleyen biri tarafından ilgi ölçüsü alanları. Veriler, kontrol ya da vahşi tip (bölümü) ve bölge ya da toplandı ve film göre ayrılır. (Şekil 9) ölçümlerde yoğunluğu (fmol / g), tarama alanı ve toplam hedef alanı da kapsayacak şekilde emin olun. <ol><li> Ilgi bölgesi vurgulayarak parametreleri (Şekil 10) arasında düştüğü temin ederek tarama alanı çubukları ayarlayın. </li><li> Bir e-tabloya İhracat verileri (Tablo 4). , Yoğunluk çarpı toplam hedef alan çarpın o belirli bir alanın bağlama değerini elde etmek için tarama alanının bölün. Bu ölçülen tüm değerlere tamamlandıktan sonra, seçici bağlantı p vermek üzere toplam oluşturulan spesifik olmayan substratkızıyorum. Ortalamalar, aynı zamanda bu değerleri için gerçekleştirilebilir. </li></ol></li></ol>

Robert Speth has licensed antibodies to angiotensin II receptors to a commercial vendor and receives royalties from the sale of said antibodies. The other authors have nothing to disclose.

Açıklanan protokol, bir kemirgen beyin önce hasat edilmiş ve -80 ° C&#39;de saklandı koronal bölümlerin bitişik bölümlerinde Radyoligandın bağlanması, toplam &quot;ve&quot; non-spesifik &quot;görselleştirme tanımlar ve hemen hemen her dokuya kolayca uygulanabilir olabilir anatomik reseptörlere veya radyoligand bağlanma sitelerinin diferansiyel miktarları görüntülemek altyapılarını çözmüştür. protokolü kapsamında açıklanan prosedürler basit ve analiz sonuçlarını doğru yorumlamak i?...

Kardiyovasküler hastalık 2011&#39;de 1 ABD&#39;de ölümlerin% 30&#39;undan fazlasını neden ABD&#39;de ölüm ve sakatlık, önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Amerikan Kalp Derneği en son istatistikler üç birden fazla kişi birine sahip olduğunu göstermektedir kardiyovasküler hastalık ya da daha fazla türü. Kardiyovasküler araştırmalar bu hastalığı anlamak karşı adımlar atmaya devam ediyor, ancak kuşaklar yaşlanıyor başlarken çabalarına devam etmesi zorunludur. Renin-anjiyotensin sistemi (RAS), esas (Şekil 1), 2-8, sempatik sinir sisteminin ateroskleroz, enflamasyon, sistemik vazokonstriksiyon ve aktivasyonunu teşvik ederek kalp-damar sistemi regülasyonunda önemli bir rol oynamaktadır. RAS tansiyon azalan böbrek jukstaglomerüler hücreleri yanıt olarak kan dolaşımına renin salgılayan aktive bir hormonal sistem, sympat arttıinfographie stimülasyon veya makula densa sodyum akışını azalmıştır. Renin anjiyotensin I (Ang I) &#39;in (karaciğerde sentezlenir) anjiyotensinojen metabolizması için önemlidir. Ang sonra anjiyotensin II (AngII), RAS ana efektör peptit oluşturmak için, birincil akciğer ve böbrekte, vasküler endotel hücrelerinin luminal tarafta, anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) tarafından ectoenzyme metabolize edilir. Ang II İki reseptör alt tipi aktive edebilen olduğu; (1 AT R) tip 1 reseptör ve (2 R AT) tip 2 reseptör, kardiyovasküler sistem düzenleyen hem de sıvı ve elektrolit homeostazisini korumak ve şimdi bilişsel işlev ve nörodejeneratif hastalığı etkilediği düşünülmektedir 8,9 işler. Yerel, beyin özel RAS bağımsız Ang II sentezlenmesi için bildirilmektedir. Beyinde, ön-madde proteini anjiyotensinojen bir renin-benzeri enzim 3 Ang I dönüştürülür astroglial 10 sentezlenir, muhtemelen prorenin prorenin reseptörüne bağlanan11, ve daha sonra, bol beyindeki 12 nöronların hücre dışı yüzeyi üzerinde eksprese edilir anjiyotensin dönüştürücü enzim ile Ang II ile dönüştürüldü. Ang II oluşturulan bu intrabrain 1 beyin ve kan yoluyla bulaşan Ang II izole edilmiştir 2 reseptörlerinde agonistidir. AT 1 R, önemli bir fizyolojik rol oynarken, daha iyi öncelikle kalp-damar sistemi ve böbrekler (Şekil 2) etkileyen, vücutta, patofizyoloji etkileri bilinmektedir. Ang II AT 1 R bağlandığında, bu vazokonstriksiyona neden olur; kan akışına direnci arttırarak ve kan basıncını yükselterek. Ayrıca, artan sodyum ve su retansiyonu giden, aldosteron ve vazopresinin sentez ve salgılanmasını teşvik eder. Bu etkiler, iskemik beyin tahribatı ve bilişsel bozuklukları uyarabilir ve Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ile bağlantılı olduğu ve diabetes, son zamanlarda tespit ediliyor yanı sıra, öğrenme ve hafıza 13-15 etkileyecek. Böbrekte jukstaglomerüler hücreler üzerinde 1 R AT ki RAS bir geribesleme döngüsü renin salgısı yoktur inhibe olduğunu. İlginçtir, AT 2 R genellikle 1 R AT, diğerleri 16-20 arasında vazodilatasyon, nörit büyümesini, aksonal rejenerasyon, anti-çoğalmasını ve cerebroprotection neden eylemi karşı düzenler. AT 2R, aynı zamanda, anti-hipertansiyon ve en son, anti-kanser ilaçları 21 için bir hedef olarak tanımlanmıştır. çeşitli dokularda içinde Ang II reseptörlerinin lokalizasyonu ve yoğunluğunu belirleme ve nasıl RAS belirli hastalıklarda oynadığı rolü ortaya çıkarmak yarayacak nicel dansitometrik reseptör otoradyografisim kullanarak çeşitli tedaviler ve hastalık durumlarında tarafından etkilenmektedir. Reseptör otoradyografi anjiyotensin I varlığını göstermek için etkili bir yöntem olarak 30 yıldan uzun bir süredir kullanılmaktadırI reseptörleri beyinde RAS diğer bileşenleri ve deneysel koşullara 22-34 çeşitli altında sıçan, fare, kobay, köpek ve insan ve diğer dokular. Beyin içinde Ang II reseptörlerini bulma önemi bir beyinde Ang II eylemleri fonksiyonel nöroanatomisini uygulayabilirsiniz olduğunu, örneğin, hipotalamus (PVN) paraventriküler çekirdeğinde AT 1 R varlığı Ang bir fonksiyonu göstermektedir beyindeki II vasopresin, oksitosin veya kortikotropin salan hormon (CRH) serbest ya da sempatik sinir sisteminin aktivasyonu uyarmak için. Bu nedenle, en 1 R bloke eden ilaçlar, beyin RAS aktivitesi ile ilişkili bu PVN aracılı bazı etkileri azaltabilir. Work in progress 1 R antagonistleri AT kullanımı CRH Travma Sonrası Stres Bozukluğu (TSSB) bağlı salınımını azaltmak ve TSSB belirtileri iyileştirmek düşündürmektedir (Hurt ve ark., Yayımlanmak üzere gönderilen). PVn, subfornicalOrgan (SFO), ve amigdala homeostasis, iştah / susuzluk, uyku, hafıza, duygusal tepki düzenleyen bilinir ve bu gösteri çalışmanın hedef alanlardır. Bu bölgeler, mikroskop lamları üzerinde beyin koronal kesitler toplanması ve Ang II reseptörleri için spesifik radyo-ligand ile birlikte spesifik inhibitörleri olan bölümleri muamele edilmesiyle incelendi. Bu çalışmada, önerilen satıcılar ile birlikte tüm maddeleri ve reaktif maddeler listelenmiş iyot-125 daha sonra mono- 125 I olarak saflaştırılan bir Ang II reseptör antagonisti, sarkosin 1, izolösin 8 Ang II (SI Ang II), radyolabel kullanılmıştır edilir Daha önce tarif edildiği gibi 35, HPLC yöntemleri kullanılarak -Si Ang II. Bu yüksek bir spesifik aktivitesi radyo-ligand kullanımı X-ışını filmine radyo-etiketli bölümleri maruz kaldıktan sonra, düşük, orta ve yüksek reseptör yoğunluğu alanlarının görülmesine olanak verir. İyot-125, belirli bir miktarda bilinen miktarlarda içeren beyin macun standartlarına filmi kalibre tarafındanBir alanda bağlanmış Ang II reseptörünün belirlenebilir. Deneysel çalışmalarda, deneysel konularda beyinlerinde bağlanması Ang II reseptör kontrol grubunun beyinlerinde olduğu mukayese edilebilir. Bu Ang II eylemleri genetik durum, fenotipik anormallik, hastalık durumunun veya ilaç tedavisine yanıt değişmiş olup olmadığını gösterebilir. Bu bilgi daha sonra RAS düzensizliklerine bağlı hastalıkların tedavisi için terapiler geliştirilmesi için uygulanabilir. Düşük anatomik çözünürlükte ancak siteler reseptör bağlanma tespit Alternatif teknikler, ayrışma sabiti olarak radyoligand bağlanma afinitesini belirlemek için bir konsantrasyon aralığı üzerinde radyo-ligand ile kuluçkalanır doku homojenatlarında türetilen doku zar müstahzarları kullanan analizler (KD bağlayıcı Çevrede doku) ve maksimum bağlanma kapasitesi (B Max). Burada açıklanan protokol 5 büyük işbirliği içine bölünebilirmponents: Reseptör Otoradyografi için Doku Bölümler hazırlanması; Reseptör Otoradyografi; Film Pozlama ve Gelişimi; Histoloji; VE DENSİTOMETRİK Görüntü Analizi.

<table><tbody><tr><td>500 ml Plastic Beakers</td><td>Fisher</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm Coverslips</td><td>Fisher</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm</td><td>Carestream-Biomax MR Film</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracin (from Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>Cardboard Sheet 8 x 11</td><td>Crescent Illustration Board #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Fisher Scientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Commercial hair dryers</td><td>Conair</td><td>Model SD6X</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Culture Tubes</td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Disodium salt, Dihydrate)</td><td>USB Corporation</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>16-100-210&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Formulary Substitute for D-19 Developer</td><td>Photographers Formulary, Inc.&amp;nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Fisher</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep/OCT</td><td>Fisher</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Film Fixer</td><td>Kodak</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>Photo flo</td><td>Kodak</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>Losartan</td><td>Fisher/Tocris</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID&amp;trade; Core 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way slide grips</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Charged Slides, Fine Ground Edge</td><td>Premiere Microscope Slides</td><td>9308W</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;125&lt;/sup&gt;I Ligands</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX- 248</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;125&lt;/sup&gt;SI-Ang II&amp;nbsp;</td><td>George Washington University</td><td>Radioiodinated by Dr. Speth</td><td></td></tr><tr><td>Slide Mailers</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4)</td><td>Fisher</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate (Anhydrous)</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Thionin&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>X-Ray Casette (10 x 12)</td><td>Spectronics Corporation</td><td>Four Square</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

receptor autoradiography protocol for the localized visualization of angiotensin ii receptors

Bu protokol Ang II reseptörleri reseptör otoradyografik haritlama özgü bir radyo-kullanarak sıçan beyninde Anjiotensin II (Ang II) için reseptör bağlanma şekilleri ile ilgili bilgiler. Doku numuneleri hasat edilmiş ve -80 ° C&#39;de saklanır. Bir kriyostat koronal bölümüne doku (beyin) kullanılır ve yüklü slaytlar üzerine bölümleri monte çözdürmeyiniz. Slayt monte doku bölümleri Ang II reseptörlerinin radyolabel 125I-sı-Ang II içerisinde inkübe edilir. Komşu slaytlar iki kümeye ayrılır: bir alıcı doyurarak radyo-etiketlenmemiş Ang II konsantrasyonu ya da varlığında (MGP) &#39;spesifik olmayan bağlanmayı&#39; 1, Ang II reseptörü alttipinin (1 r) seçici Ang II reseptör antagonisti ve 1 R antagonisti AT hiçbir ile &#39;bağlayıcı toplamı&#39;. 2, Ang II reseptörü alttipinin (2&#39;de R) doyurucu konsantrasyonu antagonisti (PD123319, 10 uM), aynı zamanda kuluçkalamadan mevcutturtampon üzerinde AT 1 R alt tipine bağlama 125l-SI-Ang II sınırlamak için. 22 ° C, MGP slaytlar 10 uM PD123319 ve losartan maruz ° &#39;de 30 dakikalık bir ön inkübasyon sırasında, slaytlar 10 uM PD123319 maruz&#39; bağları, toplam &#39;ise. Slaytlar, sonra &#39;toplam bağlanma için&#39; PD123319 mevcudiyetinde 125l-sı-Ang II ile inkübe edildi ve analiz tamponu içinde MGP için PD123319 ve losartan, birkaç &#39;yıkama &quot;, ardından tampon maddesi içinde ve su tuzunu ve non-kaldırmak edilir spesifik olarak bağlanmış radyoligandı. slaytlar uzmanlaşmış bir film ve kaset kullanarak ardından otoradyografi filmine maruz darbe kurutucular kullanılarak kurutulur. Film geliştirilen ve görüntüler, özel bir görüntüleme sistemi ve elektronik tablo kullanarak görsel ve kantitatif dansitometri için bir bilgisayara taranır. slaytlar ek olarak bir dizi histolojik karşılaştırmalar için tionin-boyanır. reseptör otoradyografi kullanmanın avantajı görselleştirmek yeteneğiAng II, bir doku numunesinin bir bölümü içinde yerinde reseptörler, anatomik bir bitişik histolojik bir referans bölümüne karşılaştırarak doku bölgesini tanımlamak.

Renin-anjiyotensin sisteminin bir metabolik yolun genel görünüşü Şekil 2&#39;de tarif edilen Şekil 1 ve (R1 Ar ve 2) anjiyotensin II reseptör alt-tipleri üzerindeki doğrudan odak gösterilmektedir. Şekil 3&#39;te bir koronal beyin transferi Şekil Şekil 4&#39;te görüldüğü gibi, daha sonra, önceden belirlenmiş bir 125I-siang II konsantrasyonu kullanılar...

Watch this Scientific Journal Video about Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors at JoVE.com

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Anjiyotensin II Reseptör lokalize Görselleştirme için Reseptör Otoradyografi Protokolü

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

receptor-autoradiography-protocol-for-localized-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K Görüntüleme.  Nova Southeastern University. Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II. 

Video: Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

NeuroStar TMS Aygıt: FDA yürütülmesi Depresyon Tedavisinde Protokolü Onaylandı

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Nörobilim

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Hayvan İletişim Araştırmaları Otomatik Etkileşimli Video Oynatma

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Omurilik Elektrofizyoloji II: Ekstrasellüler Emiş Elektrot İmalatı

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in eukaryotic cells. Precise identification of nitration sites on proteins is crucial for understanding the physiological and pathological processes related to protein nitration, such as inflammation, aging, and cancer. Since the nitrated proteins are of low abundance in cells even under induced conditions, no universal and efficient methods have been developed for the profiling and identification of protein nitration sites. Here we describe a protocol for nitropeptide enrichment by using a chemical reduction reaction and biotin labeling, followed by high resolution mass spectrometry. In our method, nitropeptide derivatives can be identified with high accuracy. Our method exhibits two advantages compared to the previously reported methods. First, dimethyl labeling is used to block the primary amine on nitropeptides, which can be used to generate quantitative results. Second, a disulfide bond containing NHS-biotin reagent is used for the enrichment, which can be further reduced and alkylated to enhance the detection signal on a mass spectrometer. This protocol has been successfully applied to the model peptide Angiotensin II in the current paper.

Proteomic profiling of tyrosine-nitrated proteins has been a challenging technique due to the low abundance of the 3-nitrotyrosine modification. Here we describe a novel approach for nitropeptide enrichment and profiling by using Angiotensin II as the model. This method can be extended for other in vitro or in vivo systems.

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Biyokimya

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen receptor -&alpha; and &beta;),estrogen receptor-&alpha; has been identified in both the smooth muscle and in endothelial cells of pial arterial segments using fluorescent staining combined with confocal laser scanning microscopy 4. Furthermore, ER-&alpha; is located in the nuclei and in the cytoplasm of rat basilar arteries 5. The receptors are abundant and fluoresce brightly, but clear visualization of discrete groups of receptors is difficult likely due to the numbers located in many cell layers of pial vessel segments. Additionally, many reports using immunohistochemical techniques paired with confocal microscopy poorly detail the requirements critical for reproduction of experiments 6. Our purpose for this article is to describe a simple technique to optimize the staining and visualization of ER-&alpha; using cross-sectional slices of pial arterioles obtain from female rat brains. We first perfuse rats with Evans blue dye to easily identify surface pial arteries which we isolate under a dissecting microscope. Use of a cryostat to slice 8 &mu;m cross sections of the arteries allows us to obtain thin vessel sections so that different vessel planes are more clearly visualized. Cutting across the vessel rather than use of a small vessel segment has the advantage of easier viewing of the endothelial and smooth muscle layers. In addition, use of a digital immunofluorescent microscope with extended depth software produces clear images of ten to twelve different vessel planes and is less costly than use of a confocal laser scanning microscope.

Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

The goal of this article is to demonstrate a method to optimize immunofluorescent detection of estrogen receptor-&#945; (ER&#945;) in rat pial arterial slices using a digital immunofluorescent microscope.

Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

Biyoloji

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The method is based on the specific binding of a radioligand to its biological target. Therefore, frozen tissue sections are incubated with radioligand solution, and the binding to the target is subsequently localized by the detection of radioactive decay, for example, by using photosensitive film or phosphor imaging plates. Resulting digital autoradiograms display remarkable spatial resolution, which enables quantification and localization of radioligand binding in distinct anatomical structures. Moreover, quantification allows for the pharmacological characterization of ligand affinity by means of dissociation constants (Kd), inhibition constants (Ki) as well as the density of binding sites (Bmax) in selected tissues. Thus, the method provides information about both target localization and ligand selectivity. Here, the technique is exemplified with autoradiographic characterization of the high-affinity &#947;-hydroxybutyric acid (GHB) binding sites in mammalian brain tissue, with special emphasis on methodological considerations regarding the binding assay parameters, the choice of the radioligand and the detection method.

The method of autoradiography is routinely used to study binding of radioligands to tissue sections for determination of qualitative or quantitative pharmacology.

Görselleştirme ve farmakolojik hedefleri karakterizasyonu için basit ve güçlü yöntemi olarak autoradiography

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Preparing a 68Ga-labeled Arginine Glycine Aspartate (RGD)-peptide for Angiogenesis

The &#945;v&#946;3 integrin is a heterodimeric adhesion molecule involved in tumor cell migration and angiogenesis. The integrin is overexpressed in angiogenic tumor endothelial cells, where it typically has a low concentration. This specific expression of &#945;v&#946;3 makes it a valid biomarker for antiangiogenic and imaging drugs. As a functional imaging modality, positron emission tomography (PET) provides information about biochemical and physiological changes in vivo, due to its unique high sensitivity at the nanomolar scale. Hence, radiometal-based PET radiopharmaceuticals have received great attention for the non-invasive quantification of tumor angiogenesis. This paper provides a systemic protocol to prepare a new radiometal-labeled peptide for the evaluation of angiogenesis. This protocol contains information about radiochemical reliability, lipophilicity, cell uptake, serum stability, and pharmacokinetic properties. The 68Ga-RGD-peptide is one of the representative PET ligands toward &#945;v&#946;3 integrin. Here, we introduce a protocol to prepare a 68Ga-RGD-peptide and the evaluation of its biological efficacy.

Preparing a 68Ga-labeled Arginine Glycine Aspartate RGD-peptide for Angiogenesis

The &#945;v&#946;3 integrin is a type of adhesion protein that is highly expressed on activated endothelial cells undergoing angiogenesis. Thus, evaluating the integrity of the integrin is of great interest in oncology. Here, we introduce a method to prepare 68Ga-labeled radiopeptides and a method to assess its biological effectiveness.

68Ga etiketli arginin glisin aspartat (RGD) hazırlama-peptid angiogenez için

The &#945;v&#946;3 integrin is a heterodimeric adhesion molecule involved in tumor cell migration and angiogenesis. The integrin is overexpressed in ...

Tıp

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

D11 scFv-alkalen fosfataz füzyon proteini ve immünofloresan kullanılarak dokulardaki izolevuglandinlerin doğrudan tespiti

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...