Bu eser eğitim ve araştırma (BMBF 01EO1003 ve BMBF 01EO1503) için Almanca bakanlık tarafından desteklenmiştir.

Deneyler erkek fareler yaş 8-12 hafta yaşlı hayvan deney Rheinland-Pfalz (yetki numarası 23 177-07/G12-1-002 ve 23 177-07/G15-1-051) üzerinden etik komitesinde onayı altında yapılmıştır.
1. anestezi ve ameliyat hazırlığı fare
<ol>
	<li>Ameliyat öncesi, iyi sağlık ve hayvanların durumunu doğrulayın. Ameliyattan önce vücut ağırlığı, gıda ve su tüketimi yanı sıra hayvanlar genel durumlarını (görünüm, duruş, kendiliğinden davranış) 2-3 gün için günde bir kez izlemek.</li>
	<li>Ana mix anestezi midazolam (5 mg/kg vücut ağırlığı), medetomidine (0.5 mg/kg vücut ağırlığı) ve fentanil (0,05 mg/kg vücut ağırlığı) için intraperitoneally hazırlamak (IP) 1 mL şırınga 200 µL/30 g fare bir 26 G iğneyle enjekte.</li>
	<li>Ozmotik pompa implantasyon ve hayvan hazırlık IVM deneyler için bir çalışma alanı platformu ısınma 39 ° C ile gerçekleştirilir. Bir dezenfeksiyon banyoda tüm araçları sterilize ve dezenfekte ısınma platformu.</li>
	<li>İşlemler sırasında göz merhem ile hayvan gözleri koruyun. Kürk ozmotik pompa İmplantasyondan önce jilet ile kaldırın. Şahdamarı ve Şah kateter implantasyon IVM deneylerde yalıtım için krem epilasyon ve pamuk temizleme bezi kullanın. Hayvan deri iki cilt Dezenfektanlar kullanarak dezenfekte: dezenfektan povidone iyot ve bir içeren ve bir antiseptik cilt çözümde alkol bazlı antiseptik içeren octenidine.</li>
	<li>Anestezi ("antisedan mix") atipamezol (0,05 mg/kg vücut ağırlığı) ve flumazenil (0.01 mg/kgbody ağırlık) ile kışkırtmak için ana karışımını ve subkutan olmak 26 G iğne ile 1 mL şırınga 200 µL/fare hazırlayın (SC) enjekte.</li>
</ol>
2. ozmotik pompa hazırlık ve implantasyon
Not: ozmotik pompaları kullanarak subkutan AngII infüzyon Lu vd tarafından ayrıntılı olarak açıklanan yapıldı. 17
<ol>
	<li>AngII steril serum fizyolojik ile lyophilized toz başlamaktan tarafından hazırlamak ve konsantrasyon ile hayvan ağırlık ve pompa teslim edilme oranını ayarlamak. Sulandırılan AngII (cam tüpler kullanmayın) plastik tüplerde tutun.</li>
	<li>Pompalar 1 mg/(kg·d) 7 gün boyunca teslim için AngII solüsyonu ile doldurun. Sonra hazırlık, pompalar için 4-6 h steril serum fizyolojik 37 ° C'de en az tutun</li>
	<li>Enjeksiyon arka ile anestezi karışımı refleksleri ayak ve sıcak işlem sahaya yerleştirin sonra fare tam anestezi sınayın. Anestezi indüksiyon 10-15 dakika sürer ve karanlık bir ortamda hayvanlar girdiyseniz daha iyi çalışır.</li>
	<li>Fare arka alt tıraş ve alkollü bir cilt antiseptik ile dezenfekte.</li>
	<li>1 cm kesi makas kullanarak omurga dik olun. Boğaz bir hemostat kullanarak pompa için bir cep oluşturmak ve pompa eklemek (moderatör ilk Debi). Cep yaranın üzerine baskı ile pompa, serbest dolaşımına izin vermesi gerekir.</li>
	<li>Dikişler ve kliplerini değil, yarayla iltihap sınırlamak için kapatır; sonra cilt antiseptik ile dezenfekte edin.</li>
	<li>Anestezi antisedan Mix 200 µL SC enjeksiyon tarafından düşman ve fareyi onun kafes için dönün.</li>
	<li>Buprenorfin ile ameliyat sonrası analjezi yürütmek (0.075 mg/kg SC) ameliyattan sonra ve isteğe bağlı olarak hayvan davranışları bağlı bir kez.</li>
</ol>
3. Şah kateter implantasyon ve şahdamarı hazırlık
<ol>
	<li>Anestezi enjeksiyonu ile arka gıda refleksleri karıştırın ve sıcaklık ve merhem koymak için bir rektal sonda ile 39 ° C cerrahi plaka üzerinde dorsal recumbence imzalat hayvan yer sonra fare tam anestezi sınayın işlem sırasında onları korumak için gözler.</li>
	<li>Boyun tüyleri saç dökücü krem kullanarak. Bir pamuklu çubukla yaymak ve tüyleri dökülmeye başlayana kadar 2 min için Krem ovmak için kullanın. Bir ek 2 dakika sonra krem ve kıllar bir spatula ile kaldırın ve deriyi alkollü bir cilt antiseptik ile dezenfekte.</li>
	<li>Bir stereomicroscope altında ameliyat. 1-1.5 cm uzun kesi boyun, Trakea yanında 1 cm boyuna deride olun. Sonra ilk insizyon her iki ekstremite için dik iki kesik yapın.</li>
	<li>Dikkatle doku cilt yanında kaldırmak ve sol juguler ven ve nefes borusunu kaplayan deri parçası kaldırın.</li>
	<li>Dikkatle parotid bezi izole; dil ve submaxillary bezleri bölgesinden 2 eğri Forseps ile ilgi. Değil kesmek ya da bezleri zarar, yer onları juguler ven ve de en iyi erişime izin vermek için.</li>
	<li>Juguler ven yalıtmak için ince forseps kullanın ve yavaşça aç ve yavaşça çevreleyen doku gemiden boşaltmak için kapatın. Damarı tamamen temiz olduğunda, forseps geminin altında konumlandırmak ve iki 7-0 dikişler altındaki her 10 cm yerleştirin.</li>
	<li>Proksimal iki deniz mili ile kafasına dikiş kapatın. Diğer dikiş bir düğüm hazır olun ama yakın değil.</li>
	<li>Tek elle Forseps ile 37 ° C steril serum fizyolojik ile dolu kateter (0,28 mm iç çapı, 0,61 mm dış çap) tutun; diğer elinizle iken, ince makas veya eğri 26 G iğne ile geminin küçük bir insizyon attım olun. Sonra kateter juguler ven yerleştirin ve düğüm iki kez kapatın. Proksimal kafasına dikiş tam immobilizasyon sağlamak için kateter kapatın.</li>
	<li>Yalıtmak ve Karotid arter hazırlamak için ince kavisli forseps kullanarak Trakea kapsayan alan incelemek.</li>
	<li>Şahdamarı dokuları çevreleyen boş olduğunda, vagus siniri (beyaz çizgi için karotis bitişik gibi görünüyor) gemisinden kaldırmak (ama işlevsel değil). İnce forseps kapalı ve yavaş yavaş yavaşça sinir harekete geçirmek için açtı.</li>
	<li>Her iki damar tamamen temiz olduğunda, ilk Karotid arter altında forseps yerleştirin ve bir küçük siyah 3 mm geniş x 2.5 cm uzunluk plastik parça geminin altında yer. Gemi overstretch yok ve kan akışını gemi sahibi yerleştirilir bir kez yüklü olduğunu kontrol etmek için çok önemli. İkinci arter gemi sahibi yerleştirin. Fareyi doğrudan altında mikroskop yerleştirilmez bezleri nefes borusu koy ve 37 ° C steril serum fizyolojik bölgenin kurutma önlemek için geçerlidir.</li>
</ol>
4. haddeleme ve lökosit kalarak değerlendirmesi / LysM + hücreleri IVM ile
<ol>
	<li>Turuncu-20 ° C'de depolanan bir 2 mg/mL stok çözümden akridin hazırlamak ve 1: 4'te 1 mL şırınga steril serum (0,5 mg/mL nihai toplama) oranında seyreltin.</li></ol>Işık--dan belgili tanımlık tenkıye korumak ve bir fare başına 200 µL kullanın.<ol>
		<li>Test farklı koşullar: akridin Şah sondayla; portakal (1) enjeksiyon (2) enjeksiyon akridin turuncu doğrudan içine kuyruk lateral damar (ile bu durum) hiçbir Şah kateter implante; (3) ölçüm akridin floresan LysMCre+IRG+ kullanarak turuncu fareler (Şah yok kateter implante burada tekrar) olmadan.</li>
	</ol>
	
	<li>Kateter yer ve iki de izole sonra mikroskop altında fare yerleştirin. Uzun mesafeli bir kondansatör ve 10 X kullanarak yüksek hızlı geniş alanlı floresan mikroskop ile ölçümleri gerçekleştirmek (NA 0,3) su daldırma amacı bir monokromatör, bir ışın ayırıcı ve bir şarj kuplajlı cihaz kamera ile. Resim alma ve gerçek zamanlı görüntüleme sistemi ile analizi gerçekleştirin.</li>
	<li>Karotid arter endotel yüzeyinde ortasında mikroskop objektif odak. Yavaş yavaş, akridin turuncu 50 µL (0,5 mg/mL) (ilk enjeksiyon için kateter ölü hacmi dikkate almak) enjekte et. Resim başına 120 milisaniye bir çekim hızı ile 100 adet fotoğraf kaydetmek için yazılım ayarlayın.</li>
	<li>Her video için arter üzerinde farklı yerlerde Karotid arter (sol ve sağ) başına dört videoları olun. Floresans sinyal azalırsa, akridin turuncu başka bir 50 µL enjekte et.</li>
	<li>Tüm videoları kayıt sonra hayvan tarafından servikal çıkığı ötenazi.</li>
	<li>Video hızı saniyede 10 kare ayarlamak ve her video için gemi ortasında yerleştirilen 200 µm x 250 µm dikdörtgen görünümü'nde çalışırken ve yapışık hücreleri ölçmek. Haddeleme ve yapışık hücreleri saymak; yapışık hücreleri taşımayın veya 10 s video içinde endotel dan ayırmak hücreleri olarak tanımlanır. Miktar kolaylaştırmak için kanal ile kırmızı Floresans kaldırmak ve sadece yeşil Floresans haddeleme ve yapışan hücreleri saymak için kullanın.</li>
	<li>Akridin turuncu kullanarak deneyler için Floresans manuel bir eşiği endotel hücreleri tarafından yapılan arka plan çıkarmak için olun.</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension.">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans.">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li><li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+monocytes+and+platelets:+implication+for+life.">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li><li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation.">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li><li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs.">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li><li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells.">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li><li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway.">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice.">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+wound+healing:+the+role+of+the+macrophage.">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).</li><li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

LysM+ monosit daha önce hipertansiyon5gelişiminde karıştığı gösterilmiştir. İşte LysM+ bağışıklık hücreleri rulo ve yanıt AngII infüzyon olarak endotel katmanı uygun göstermektedir. Bu bulgu LysMCre+IRG+ kullanarak elde edildi fareler hipertansiyon vivo içinde bağışıklık hücrelerinin rolü lökosit enjeksiyon akridin turuncu6,10ile görselleştirme tarafından keşfetmek bizim önceki çalışmalar. Böylece, ayrımcılık kalarak için endotel hücre tiplerinin mümkün değildi.
IVM damar çalışmalar ve in vivo gözlemler damarlara doğrudan hücre için çok yararlı bir araçtır, ancak hipertansiyon inflamatuar bağlamında cerrahi olarak eklenen bir kateter yardımıyla boya enjekte etkisi bilinmeyen kalır. Kateter ve akridin turuncu potansiyel etkisini değerlendirmek için enjeksiyon biz IRG+ fareler LysMCre+avantajı aldı. AngII infüzyon sayısı arttı LysM+ hücreler endotel için inişli çıkışlı. Bir kateter juguler ven içine ekleme etkisi güçlendirilmiş ve daha haddeleme ve yapışan lökosit kateter implantlar olmadan fareler karşılaştırıldığında bir kateter ile Enstrümante AngII-infüzyon farelerde tespit edildi. Bu o implantasyonu bağlamında, sistemik inflamatuar reaksiyon kaplayan hipertansiyon18' görülen bağışıklık reaksiyonu ile yaranın Karotid kateter nedenleri gösterir. Buna ek olarak, juguler ven şahdamarını için yakınlık nedeniyle ek bir bağışıklık etkinleştirme juguler ven etkileyen tarafından oluşmuş olabilir. Bu etkinin ne zaman iğne kuyruğu damar içine yapılan mevcut değildi beri biz etkisi nedeniyle varsayabiliriz boya ama kateter ekleme yordamı değil. Biz burada in vivo işlemlerle deneme sırasında karışmaması için floresan proteinler ifade transgenik muhabir fareler önemini gösterdi. Ayrıca, kuyruk ven enjeksiyon floresan izleyiciler Şah kateter enjeksiyonları olası bir alternatif olabilir.
Bir kritik yordam AngII infüzyon adımdır. Kuyruk manşet değerlendirme kan basıncı AngII teslim etkinliğini denetlemek için pompa tarafından yapılabilir. Kan basıncı infüzyon 2−3 gün sonra artırmalıdır. LysM+ hücreleri harekete geçirmek etkileyen enflamasyon sınırlamak için nerede pompa implante kesi kapatılması dikiş yerine klipleri ile yapılmalıdır. Bir sınırlama kuyruk ven enjeksiyon hakkında kaydetti: en iyi olası veri toplama yapmak için 4 video genellikle her şahdamarı için alınır. Floresan sinyal azalırsa, akridin Orange 50 µL enjekte ama kuyruk enjeksiyon ile birkaç iğne yapmak ve şahdamarı mikroskop objektif altında sabit tutmak için daha zor. Juguler ven bir kateter varlığı süresi 4 saat sonra kateter implantasyon19hazırlanan trombosit açısından zengin plazma koagülasyon aktivasyonu etkiliyor bu yana, bağışıklık hücreleri harekete geçirmek de modüle. Kateter implantasyon bu yönünü daha fazla araştırma gerekiyor.
Bile LysM+ hücre aktivasyonu AngII infüzyon sonra Şah kateter Uygulanılmasından etkisini takdir ediyoruz, son olarak, biz tam olarak hazırlık, cilt temizleme ve potansiyel bir LysM+ hücre üzerinde karotis yalıtım rolü tahmin olamaz harekete geçirmek. Biz Floresans muhabir fare kullanımı böyle sonucuna LysMCre+IRG+ fare gemi bütünlük bozulma vivo içinde görüntüleme için hayvan hazırlık sırasında önlemek için tavsiye edilir.

Arteriyel hipertansiyon kardiyovasküler hastalık ve ölüm riskini artırır ve ateroskleroz, koroner kalp hastalığı ve atardamar veya toplardamar thromboembolisms1gelişimini teşvik etmektedir. Hipertansiyon gelişimini çevresel, genetik, endokrin ve hemodinamik faktörlerin etkileşimi üzerinde bağlıdır. Şu anda, bağışıklık ve ilgili iltihap hipertansiyon2etyoloji içinde önemli bir rol oynamak için takdir edilmektedir.
Bağışıklık hücreleri arasında T lenfositler yanı sıra monosit ve makrofajlar AngII kaynaklı damar iltihabı ve hipertansiyon, kısmen Reaktif oksijen türleri3tetiklemek için yeteneklerini ilgili nedensel dahil olmak bulundu. Makrofaj koloni uyarıcı faktör eksik fareler kan basıncı artışı ve damar iltihabı4ile ilgili AngII için azaltılmış tepki gösterdi. Bir önceki çalışmada, LysM + monosit vasküler disfonksiyon ve iltihap AngII kaynaklı hipertansiyon5' te sürücü gösterebilirim. Daha yakın zamanlarda, açıkladığımız bir roman yol hangi koagülasyon faktör XI trombosit ve Trombin bağlı damar iltihabı6ikna etmek için damar duvarı ile işbirliği yapmaktadır. Hipertansiyon bağışıklık sisteminde rol hakkında güncel bilgi son zamanlarda özetledi ve Rodriguez-Iturbe ve arktarafından incelendi. 7
Bağışıklık hücreleri hipertansiyon gelişiminde katılımı oldu beri modelleri ve teknikleri gemi ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için gerekli oldu. Epifluorescence IVM kan damarlarının dolaşan kan hücreleri ve endotel8,9,10arasında vivo içinde etkileşim gözlemlemek için yararlı bir araçtır. Bu teknik ile DNA'sını (akridin turuncu gibi) enterkalasyon boyalar enjeksiyon çekirdekli hücreler (dolaşımdaki yanı sıra endotel) görselleştirebilirsiniz. İzole trombosit ex vivo ile rhodamin - 6 G lekeli veya dichlorofluorescein (DCF) trombosit açısından zengin trombüsü atardamar veya toplardamar yaralanma modellerinde görselleştirmek için enjekte edilebilir.
Genellikle, juguler ven kateteri izleyiciler enjekte için kullanılan veya işaretli trombosit. Endotel İLETİMLERİNİZE ve koagülasyon cascade, sonraki harekete geçirmek her ikisi de bilinmektedir monosit etkinleştirme üzerinde etkiler. Endotel hasarı hemen trombosit harekete geçirmek subendothelial matris molekülleri takip eden monosit cazibe ve harekete geçirmek11ile doku mühür yol açar. Aksine, bir sağlam endotel antikoagülan özellikleri (Örneğin, doku faktörü yolu inhibitörü veya thrombomodulin yoluyla)12 ve monosit, örneğin, üzerinden salgılanmasını üzerinde doğrudan inhibitör etkileri olduğu bilinmektedir hücre dışı veziküller mikroRNA'lar13içeren. Monosit bir doku faktörü, koagülasyon cascade ve Trombin tarafından etkinleştirilebilir ve monosit harekete geçirmek14' te,15 katılmak hızlı proteaz aktif reseptörleri (PARs) dışsal aktivatör üretmek bilinmektedir . Bu nedenle, herhangi bir etkinleştirme trombosit veya vasküler yaralanma nedeniyle koagülasyon cascade olabilir monosit etkinleştirme üzerinde beklenmeyen etkileri ve gözlenen fenomen ile müdahale. LysM+ bir kateter ve alternatif yöntemleri ile enjeksiyonlar etkisi ayrıntılı olarak incelemek önerdiğimiz IRG transgenik LysM Cre transgenik fareler, bir çift-floresan Cre muhabir fare (LysMCre+IRG+) sayesinde, myelomonocytic hücreleri, arteriyel hipertansiyon16bir fare modeli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Janssen-Cilag GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Hikma pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1007D</td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI fluorescence microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10X</td>
			<td>Water immersion objective with a monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 008705</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 004781</td>
			<td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

Epifluorescence intravital video mikroskobu (IVM) kan damarlarının bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve rol için yeteneklerini değerlendirmek ve endotel katmana bağlı kurulan bir yöntemdir. Hücreleri floresan boyalar veya fluorophore birleştiğinde antikorlar enjeksiyonu ile dolaşan görselleştirme yaygın olarak kullanılır. Alternatif olarak, floresan muhabir fare-ebilmek var olmak kullanılmış. + (LysM+) etkileşimleri lökositlerin, belirli lizozim M monosit, gemi duvar ile vasküler disfonksiyon ve arteriyel hipertansiyon desteklenmesinde önemli rolleri oynamak. Burada görselleştirmek ve haddeleme lökosit ve Anjiyotensin II (AngII) karotis arterlerde yapışma ölçmek için teknik mevcut-hipertansiyon farelerde IVM tarafından indüklenen.
Bir kateter implantasyonu vasküler duvar zarar ve değiştirilmiş kan hücresi yanıt-e doğru yol açar. Biz farklı enjeksiyon teknikleri ve bir LysMCre+IRG+ lökosit görselleştirmek için yönetim yolları göre fare ile kırmızı floresan protein yaygın ifade ve LysM yeşil flüoresan proteinin koşullu ifade + hücreleri. LysM+ hücre aktivasyonu, biz AngII fareler infüzyon çalışırdım içinde inişli çıkışlı ve yapışma lökositlerin endotel artar. Biz de akridin bir Şah kullanarak turuncu kateter enjekte veya doğrudan kuyruk damar ve miktarını karşılaştırıldığında haddeleme ve kalarak hücreleri. Şah kateter implantasyon başına haddeleme sayısı arttı ve yapışan LysM+ hücrelerde sham infüzyon-LysMCre+kontrollere göre IRG+ fare bulduk. Bu harekete geçirmek AngII-infüzyon farelerde artar. İlginçtir, akridin doğrudan kuyruk damar artış LysM+ turuncu hücre adezyon enjekte veya sahte-infüzyon farelerde haddeleme. Böylece vivo işlemlerle deneme sırasında karışmaması için floresan proteinler ifade transgenik muhabir fareler önemini gösterdi. Ayrıca, kuyruk ven enjeksiyon floresan izleyiciler Şah kateter enjeksiyonları olası bir alternatif olabilir.

Şahdamarı LysMCre+IRG+ AngII ile infüzyon fareler IVM kullanarak gözlendi. Akridin turuncu Şah bir kateter kullanarak enjekte ettiler. LysM+ hücreleri ile temas (açık bir ayrımcılık teknesi ile etkileşim hücre türü kaldı bu yana hangi Ayrıca gemi ile etkileşim tüm çekirdekli dolaşımdaki hücrelere kıyasla vasküler duvar oranının bakmak amaçlanmıştır soru--dan bizim önceki iş). Temel Şah bir kateter varlığı (şekil 2A, D) LysM+ hücrelerinin yapışma neden olur. Akridin turuncu enjeksiyon sonra aynı hücreleri Floresan, ama aynı zamanda endotel hücreleri floresan idi (şekil 2B, E). Endotel sınırlamak için arka plan azalma Floresans ilgili sonra verileri tüm çekirdekli yapışan hücreleri LysM+ (şekil 2C, F); olduğunu gösteriyor Bu sonuçlar bizim önceki sonuçları onaylamak ve+IRG+ LysMCre AngII LysM+ hücre aktivasyonu üzerindeki etkisini gözlemlemek için iyi bir model olduğunu gösteren AngII infüzyon sonra doğru tutun.
Biz rol akridin portakal LysM+ hücre aktivasyonu LysMCre+IRG+AngII infüzyon sonra üzerinde yönetim yollarının değerlendirildi. AngII infüzyon, lökosit endotel etkileşimleri, bir hafta sonra LysMCre+IRG+ Karotid arterler fareler görüntüsü ve ile ya da ezelî akridin turuncu enjeksiyon Şah bir kateter veya kuyruk ven yoluyla IVM tarafından görüntülenmiştir. AngII infüzyon tedavi edilmezse fareler ve yapışma göre (şekil 3) artış gösterdi sonra herhangi bir kateter veya iğne olmadan LysM+ hücrelerinin haddeleme önemli ölçüde arttı. Enjeksiyon akridin Şah kateter arttı yapışma ve AngII içinde haddeleme ile turuncu fareler fare olmadan bir kateter (şekil 3) ile karşılaştırıldığında büyük ölçüde tedavi. Akridin kuyruk damarda turuncu enjeksiyon benzer yapışma sağlar yol açar ve haddeleme akridin turuncu (şekil 3) enjeksiyon almadı fareler karşılaştırıldığında.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
Şekil 1. Düzeni Anjiyotensin II infüzyon ve LysM+ değerlendirilmesi için haddeleme ve yapışma farelerde hücreleri. LysMCre+IRG+ fare AngII ile 7 gün infüzyon ve kalarak hem de LysM+ haddeleme şahdamarı hücreye veya enjeksiyon akridin turuncu Şah bir kateter ile mi yoksa kuyruk ven olmadan sayısal enjeksiyon. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
Şekil 2. LysM+ hücre adezyon ve LysMCre+Karotid arterler IRG+ fare haddeleme değerlendirilmesi. LysM yapışma+ hücreleri LysMCre+IRG+ fareler (A, D) önce ve sonra (B, E) akridin enjeksiyon yolu ile Şah bir kateter. Kırmızı ve yeşil Floresans kaydedildi, LysM+ hücrelerinde (yeşil) ve düz kas hücrelerinde (kırmızı) görünür. Enjeksiyon akridin Orange sonra endotel hücreleri de yeşil görülebilir ama arka plan Floresans tek dolaşan hücre görselleştirme (C, F) parçalanmayabilir mümkün kılar. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
Şekil 3. Anjiyotensin II floresan boyalar olarak yönetim yolları değerlendirilmesi IRG+ fareler LysMCre+infüzyon. Miktar haddeleme(a)ve (B) LysM+ kalarak hücreleri ve işletilen sahte veya AngII-infüzyon hayvanlar veya enjeksiyon akridin Orange Şah bir kateter kullanarak veya kuyruk ven enjeksiyonla olmadan. Farklı koşullarda (C) temsilcisi resimleri. Ortalama ± standart hata ortalamaya sonuçlarıdır. 2 yönlü ANOVA gerçekleştirilen ve Bonferroni'nın post hoc testi, n = 3-12/gruplar; p &#60; 0,05. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls at JoVE.com

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.

Lökosit haddeleme ve yapışma Anjiyotensin II-infüzyon farelerde görselleştirme: teknikleri ve Püf noktalar

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

visualizing-leukocyte-rolling-adhesion-angiotensin-ii-infused-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.6K Görüntüleme.  University Medical Center Mainz. Bu el yazması transgenik muhabir fare kullanımı ve bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu değerlendirmek için kan damarlarının intravital video mikroskobu kullanılarak Anjiyotensin II kaynaklı hipertansiyonda floresan boyalar farklı yönetim yollarını açıklar ve onların yetenek rulo ve endotel için uygun.

Video: Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Alexa Fluor Etiketleme Dang Virüs görselleştirme

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...