We would like to thank Ms. Ji Hyun Park and Ji Yeon Park for their technical assistance in the animal experiments. This work was supported by a grant from the Seoul National University Bundang Hospital Research Fund (grant number: Grant No. 14-2014-022) and from a grant (CCP-13-02-KIST) from the Convergence Commercialization Project of the National Research Council of Science and Technology, Seoul, Korea.

Bizim protokol Bu protokolde yer alan hayvan usul ve hayvan bakım yöntemleri tüm onaylı Seul Ulusal Üniversitesi Bundang Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), kuralları takip eder. IACUC Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım (2011) için Kılavuz sekizinci sürümü ile tam bir uyum içindedir. Bütün işlemler hayvanlarda Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği kurallarına bağlılık ile yapıldı. Ayrı ayrı kafeslerde tavşan konut kullanılmıştır. Ek cerrahi veya hazırlık bu deneyi yapmadan önce (yani, sterilizasyon) gerekmeyebilir. Tavşan Gözlerinde içine İlaç 1. Göz içi enjeksiyon <ol><li> tiletamine hidroklorür ve zolazepam bir karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile 1.5-2 kg ağırlığındaki sağlıklı Yeni Zelanda beyaz tavşanları anestezisihidroklorür (15 mg / kg) ve ksilazin hidroklorür (5 mg / kg). Palpebral (göz kırpma) refleksi izleyerek veya kulak tutam ile anestezi doğrulayın. NOT: göziçi ilaç göz pigmentleri bağlarsa, bağlanma derecesi ilacın göz farmakokinetik değişiklik neden olabilir. Örneğin, pigmentli tavşan vitröz ve sulu humors bir pigment-bağlama ilacın yarı ömrü yüksek albino tavşanlarda 14 edilene karşılaştırılabilir. insan gözü, insan meslektaşları temsil etmeyebilir pigmentasyon ve albino tavşan gözlerine farklı derecesine sahip olarak, bu durumda, pigmentli tavşan gözlerine elde edilen veriler insan gözü daha benzer ve uygulanabilir. Böylece, ilaç pigment etkileşimini dikkate alarak, pigmentli veya albino tavşan kullanımı dikkatle düşünülmelidir ve sonuçları tavşan suşu (pigmentasyon) ile birlikte yorumlanmalıdır. Ancak, albino tavşan d olarak farmakokinetik özelliklerini karşılaştıran çalışmalarda kullanılmak üzere tavsiye edilirkilim-pigment etkileşim karşılaştırıldığında karıştırıcı faktör olabilir. <ol><li> % 1 proparacaine hidroklorür oftalmik göz damlaları ile topikal anestezi uygulayın. anestezi kurtarma kadar göz kuruluğu önlemek için veteriner merhemi (% 2 hidroksipropil metil) kullanın. NOT: anestezi sırasında gözetimsiz tavşan bırakmayın. </li></ol></li><li> fenilefrin hidroklorid ve tropikamid, bir veya iki damla öğrenci dilate. </li><li> Göz içi enjeksiyon öncesi cerrahi hazırlığı için, bir pamuklu çubukla 5 ile Perioküler cilde% 5-10 povidon-iyot uygulanır. gözün konjonktiva üzerinde% 5-10 povidon-iyot bir damla yerleştirin. </li><li> Aseptik teknikler 5 kullanarak ya intravitreal veya intrakameral göz içi ilaç yönetmek. NOT: sistemik dolaşımda absorbe ilaç da adam göz nüfuz edebilir. ilaç her iki göze tatbik edildiğinde, bir göz ilaç konsantrasyonu enjekte ilaç etkilenebilirdiğer göz. o kontralateral enjeksiyonun etkisi diğer gözünü nüfuz edemez sistemik dolaşımda ilaç olarak ihmal edilebilir teyit edilirse, göz içi enjeksiyon için iki gözün kullanımı, ekonomik olduğu gibi kabul edilir ve hayvanların sayısı için feda minimize edilebilir farmakokinetik çalışmalar. Göz içi enjeksiyonu takiben sistemik konsantrasyonuna bağlı farmakokinetik çalışma için, sadece bir göz kullanımı uygundur. <ol><li> Intravitreal enjeksiyonlar için sklera yüzeyi 5 dik bir 30 G iğne ve ya ticari 1 ml şırınga, insülin şırınga veya cam şırıngalar kullanılarak intravitreal 1 mm üst temporal kadranda cerrahi limbusta arkasında ilaç enjekte edilir. NOT: intrakamaral ve intravitreal enjeksiyon için kullanılan ilacın hacmi soruşturma altında uyuşturucu bağlı olarak değişir. tavşan gözlerini kullanarak anti-VEGF ajanlar farmakokinetik deneyler için, önceki çalışmalarda 0.025, 0.05 (en yaygın) veya 0.1 m kullanılanintrakamaral veya intravitreal enjeksiyon için bevacizumab veya ranibizumabın l. Anti-vasküler endotelyal büyüme faktörü, 0.05 bevacizumab 15 mi, VEGF tuzağı 16 0.025 ranibizumabın ml veya 0,03 ml intraoküler farmakokinetik önceki çalışmalarda kullanılmıştır. Bu 17 desteklemek için çok az kanıt olmasına rağmen parasentez olmadan büyük güvenli hacim, 0.1 ml olduğuna inanılmaktadır. Aşırı ses ya intrakameral veya intravitreal olarak enjekte edilirse, göz içi basıncı önemli ölçüde artmıştır. IIOP beyinde inme benzerdir bozulmuş göz perfüzyon ve santral retinal arter tıkanıklığı, neden aşırı durumlarda doğrudan artmış göz içi basıncı (IIOP) neden optik sinir hasarı, yani glokomatöz optik sinir hasarı, ek olarak. </li><li> intrakameral enjeksiyonlar için, yukarı eğim ile korneoskleral limbus aracılığıyla 30 G iğne ekleme ve bunu pa ilerleterek ön kamaraya ilacı enjekteiris veya lens travma riskini en aza indirmek için iris düzlemine rallel. Not: İlaç formülasyonuna bağlı olarak, daha büyük 30 G kullanılabilir iğneler. Daha büyük ölçek iğne gerektiren durumlar ilaçları içeren mikrosferler, büyük protein ilaçları, ve yüksek viskoziteli formülasyonlar bulunmaktadır. </li><li> Enjeksiyondan sonra, yara iyileşmesini sağlamak için steril bir pamuk uçlu aplikatör ile enjeksiyon bölgesini sıkıştırmak. NOT: Normalde, 30 saniye, 30 G iğne göziçi enjeksiyon için kullanılan yara iyileşmesi için yeterlidir. Daha büyük bir gauge iğne içi enjeksiyon için kullanıldığı takdirde, ancak, daha uzun bir zaman sklerotomi yaradan sızmasını en aza indirmek için sızdırmazlık yara için uygun olacaktır. sklerotomi yara sızıntısı kontrol etmek için daha büyük bir iğne kullanıldığı, özellikle göz içi enjeksiyondan sonra derhal kullanılmalıdır göz içi ilaç miktarı enjekte miktarı aynı olduğundan emin olmak için önemlidir. </li></ol></li><li> günlük tedavi tavşan için gözlemleyinBir hafta ve daha sonra haftada bir kez, şiddetli göz içi iltihabı (konjunktival enjeksiyon ve hipopiyon) herhangi bir işaret için ötenazi kadar. NOT: enjeksiyondan sonra analjezikler, 30 G iğne ameliyat sonrası ağrı eşlik etmediği bir minimal invaziv bir işlemdir kullanarak göz içi enjeksiyon olarak gerekli değildir. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. </li></ol> 2. Numune Hazırlama <ol><li> Enükleasyonunu için, göz içi ilaç enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında tavşan (örn., 1 saat ve 1, 2, 5, 9, 14 veya 30 gün önce) euthanize. Not: Bu zaman noktaları ilgi ilaç ve bilinen farmakokinetik profilleri bağlıdır. Her bir zaman noktası için, en az iki gözleri 13 kullanır. Güvenilir veri kalitesi için, zaman örnekleme ilacın 13 iki yarı-ömürleri en az bir zaman dilimi için dengeli örnekleme ile, özenle en az dört kez noktaları seçilmelidir </&gt; Sup. Biz dengeli örnekleme ile 6-8 kez noktaları uygun olabilir inanıyoruz. Özellikle küçük moleküller (≤1,000 Da) 18 için, ilk 24 saat içinde en fazla 1 zaman noktası çok önemlidir. Buna göre de, makromoleküller (&gt; 1000 Da) 18, bir numune alma süresi gibi 1 saat karıştırıldı ve 1, 2, 5, 9, 14 ve 30 gün 19 iyi bir seçenek olabilir. Küçük moleküller (≤1,000 Da), 1, 2, 4 ve 8 saat ve 1, 3, ve 7 gün boyunca bir seçenek 20 olabilir. molekül ağırlığına bağlı olarak, numune alma süresi ise değiştirilebilir. <ol><li> ötenazi için, hızlı bir şekilde tiletamine hidroklorür, zolazepam hidroklorür (15 mg / kg) ve ksilazin hidroklorid (5 mg / kg) karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile anestezi tavşan sonra 15% intravenöz KCI 10 mi tatbik. </li></ol></li><li> bir göz kapağı retraktörü ile palpebral fissür açın. limbus için 360 ° konjunktival kesi 2-3 mm posterior yapın ve c diseksiyon bunu posteriorde uzatmakonjunctiva ve dünyadan Tenon kapsülü. </li><li> dünya onların ekleme yakın ekstraokuler kasları kesti. kavisli bir forseps ile optik siniri Kelepçe ve daha sonra forseps ve dünyanın arasındaki sinir kesti. bozulmamış çevre dokulara bırakarak gözün kendisini kaldırmak. Enükleasyondan sonra, hemen gözbebekleri dondurmak ve -80 ° C&#39;de saklayın. NOT: Acil donma için iki seçenek söz konusu olabilir. Ilaç konsantrasyonu çok erken aşamada ölçülür (yani. 1 saat daha az), sıvı azot gözün daha iyi zamanında dondurma sağlamak için daha uygun olabilir. Ancak, sonraki dönemlerde, buz hemen gözü soğutmak için kullanılabilir, ve daha sonra derin dondurucu, -80 ° C&#39;de gözleri depolamak için kullanılabilir. </li><li> zaman noktalarının tümü için gözbebekleri alındıktan sonra, üç bölmeli, vitreus sulu mizah, ve retina / koroid içine donmuş gözbebekleri ayırın. defros önce bu bölmelerini ayırmakting. Not: üç bölmeye ayrılması için en önemli nokta prosedürü hızıdır. gözün defrost önce çok hızlı bir şekilde ayrılabilir ve prosedür çözülme geciktirmek için buz üzerinde gerçekleştirilebilir. <ol><li> dünya açmak için, bir neşter bıçağı ile kornea limbusta (300 ° veya daha fazla) bir kesi yapmak. iris, sulu mizah önünde donmuş bölmesini alın. </li><li> çekerek ve doku forseps kullanarak excoriating dondurulmuş iris ve lensi çıkarın. vitreus erişilebilir hale geldiğinde, geri kalan dokularda (retina / koroid / sklera) ayrılarak dondurulmuş vitrözü edinin. </li><li> Bir No. 15 neşter bıçak kullanarak, arka plandaki skleradan retina / koroid doku ayırın. </li></ol></li><li> immünoassay sulu mizah örnekleri defrost ve her numunenin hacmini ölçmek. Tüp içeren T bu boş bir tüp ağırlığı çıkartılarak donmuş örneklerin ağırlığı ölçmekO örneği dondurulmuştur. Not: Dondurulmuş numuneler özgül ağırlığı yaklaşık olarak 1 olduğu, her bir örnek ağırlığı, numunenin hacmi hesaplamak için kullanılabilir. </li><li> Camsı örnekleri tartın örnekleri defrost ve gece boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde% 1 sığır serum albümini ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su içinde 1.0 ml bunları çözünür. Daha sonra, 10 dakika 21 387 x g&#39;de santrifüj örnekleri. </li><li> Homojenizasyon dondurulmuş retina / koroid örnekleri tartın. 1:10 oranında (1 gram doku / reaktif 10 mi) reaktif doku oranında protein ekstraksiyon reaktifi ekleyin. önceden soğutulmuş bir microhomogenizer kullanılarak doku homojenize edilir. 12,000-20,000 x g&#39;de 10 dakika süre ile lize örnek santrifüj ve soğutulmuş EPP tüp süpernatantı aktarın. </li></ol> 3. İmmunoassay NOT: Birkaç analitik yöntemler protein konsantrasyonu ölçümü için kullanılabilir. d Uygun bir nicel bir yöntem seçinalgılama mesafesine epending. LC-MS / MS, sırasıyla, MRM / PRM modu ile profil için protein nanogram ve pikogram düzeyini algılar ise Kısaca, HPLC seçilmiş iyon izleme modu molekülün pikogram düzeyini algılar. ELİSA&#39;nın tespit limiti pikogram düzeyinde olduğu düşünülmektedir. <ol><li> Dolaylı enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) için, bir anti-VEGF maddelerin konsantrasyonlarını ölçmek için, ilgilenilen ilacın tespit ve bilinen ilaç konsantrasyonları standart eğri oluşturmak için 96-yuvalı plakalar içinde ELISA kitleri kullanın. <ol><li> camsı, aköz hümör, ve lineer aralığında konsantrasyonlarda 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 0.1 büyükbaş hayvan serum albümini ile retina / koroid örnekleri seyreltilir ve tahlil için bu kullanım. </li></ol></li><li> iyi / 100 ul plaka üzerinde kısma örnekleri bölün. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe ve sonra plaka 0 yıkama çözeltisi 200 ul kullanılarak üç kez yıkayın.1x PBS içinde% 05 Tween20. Not: ELISA için birincil antikor olarak Örnek eylemlerine, anti-VEGF, bu; Bu nedenle, bir birincil antikor ilave kullanımı gerekli değildir. </li><li> 1x PBS içinde 20.000,% 0.1 BSA, ve de her seyreltilmiş çözeltisi 100 ul: 1 sekonder antikoru ile seyreltilir. 4 ° C de bir gece seyreltilmiş sekonder antikor ile kuluçkaya yatırılarak sonra 450 nm dalga boyunda optik yoğunluk ölçülür. Her standart ve numune için yinelenen okuma ortalamasından ortalama sıfır standart optik yoğunluk çıkarın. </li><li> örneğin, SoftMax Pro bir dört parametreli lojistik (4-PL) eğri üretme etkisine sahip bilgisayar yazılımı kullanılarak veri azaltarak bilinen konsantrasyonlarda ilacın çözeltilerinden nispi ışık sinyaline dayalı bir standart eğri oluşturmak. [Fit] - standart bir eğri oluşturmak için, 4-PL eğri [Standart Eğrisi] [4-parametre] tıklayarak elde edilebilir. </li><li> Numuneler fr ilaç konsantrasyonunu hesaplamakstandart eğri om. Not: Anti-VEGF ilaçların algılama sınırları (LOD) bizim etkileri araştırılmıştır. bevacizumab LOD mi 0,024-3,125 ng / ve aflibercept bu 0,039-10 ng / ml olmuştur. </li></ol> 4. Farmakokinetik Analiz Yöntemleri NOT: PK analizi için, bir kompartman veya non-kompartman analizini kullanabilirsiniz. kompartman analizde, moleküllerin eğilim davranışı bir denklem (model) ile açıklanabilir. kompartmanlı olmayan modeli görselleştirmek veya diğer doz rejimleri için konsantrasyon-zaman profilleri tahmin edemez ise Böylece, kompartman PK analizi, herhangi bir t anındaki konsantrasyonu tahmin edebilirsiniz. Ancak, kompartman modelleri uydurma karmaşık ve uzun bir süreç olabilir. Buna karşılık, varsayımlar olmayan kompartman modelde daha az kısıtlayıcı bulunmaktadır. kompartmanlı olmayan basit bir uygulama ve bu yarı ömür, temizliği ve dağılım hacmi farmakokinetik parametreleri hesaplamak için yaygın olarak kullanılır.Biz anti-VEGF ajanlar farmakokinetik çalışmalar için bölmeli model seçti. <ol><li> Böyle Phoenix WinNonlin&#39;in yazılımı gibi modelleme yazılımı kullanarak bölmeli modelleri ile ilaç konsantrasyon verileri analiz edin. <ol><li> [WNL5 klasik modelleme] içinde [PK modeli] tıklayın ve [Ayar] menüsü gözlem süresi, uygulanan doz ve ilaç konsantrasyonu harita. </li><li> [Model seçimi] sekmesinde (örneğin, bölmelerin sayısı) kompartman modeli seçin ve model parametreleri hesaplamak için [Yürütme] düğmesine tıklayın. </li></ol></li><li> (. Örneğin, standart hata) (1) Akaike Bilgi Kriteri, (2) parametre tahminlerinin hassasiyet, ve (3) grafik analizi: analizler sonucunda, en iyi aşağıdaki kriterlere dayalı ilaç konsantrasyon verileri tanımlayan son bölme modelini seçin (örn., uyum araziler iyiliği). </li><li> Bu tür zaman konsantrasyonları altında yarılanma ömrü (T 1/2) ve alanı olarak ilgi farmakokinetik parametrelerini hesaplamakkompartman modeli ile tahrik model parametreleri ve denklemlerden yon eğrisi (AUC). </li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

With the increasing use of intraocular drugs, such as anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) agents, for the treatment of diverse ocular diseases, knowledge of the tissue distribution and clearance of the drug after the intraocular injection is important. Understanding the pharmacokinetics of intraocular drugs is important for understanding the efficacy and safety of drugs, determining the optimal dosage of the drugs, and minimizing systemic or intraocular complications. However, detailed pharmacokinetic studies ...

Göz içi ilaç dağıtım gelişiyle önce, göz içi hastalıkların tıbbi tedavinin ana endişe ilaç göz içine nüfuz olabilir hangi ile etkinlik oldu. Kan-göz bariyer göz içine yayılmasını, ilaçlar dahil pek çok maddeyi önler. Bu nedenle, terapötik seviyelerin üzerinde olan ilaçların konsantrasyonu kolayca elde edilemez. İlaçların tedavi edici konsantrasyonları göz 4,5 elde edilebilir ve böylece intrakamaral ve intravitreal enjeksiyonlar da dahil olmak üzere göz içi ilaç uygulama yöntemi, can doğrudan kan-göz bariyerini 1-3 atlayabilir. Buna göre, intravitreal ilaç dağıtım birkaç göziçi hastalıkların 5,6 tedavisinde popüler bir yöntem haline gelmiştir. Örneğin, içi enjeksiyon yaygın yaşla ilgili maküler dejenerasyon, diyabetik retinopati, retinal ven tıkanıklığı ve göz içi enfeksiyonlar 7-10 için gerçekleştirilir. Özellikle, çünküAnti-VEGF ilaç tanıtımı, intravitreal enjeksiyonlar sıklığı oldukça retina hastalıklarının tedavisi için artmıştır. Bu nedenle, tıbbi tedavinin etkinliğini ve güvenliğini değerlendirmek için bu ilaçların içi farmakokinetik anlamak önemlidir. İlaçların içi yönetim küresi içindeki ilaç konsantrasyonunu izleme göz hastalıkları tıbbi tedavide önemli bir atılım olarak kabul edilmesine rağmen, teknik olarak talep ediyor. İnsan gözü, sulu humor (yaklaşık 200 ul) ve camsı (yaklaşık 4.5 mi, Tablo 1), sadece az miktarda için, ilaç konsantrasyonunu ölçmek için, okular akışkan yeterli miktarda elde edilmesi için teknik olarak zordur. Ayrıca, bu tür vitreus dokunarak veya ön kamara parasentez olarak göz sıvısı elde etmek için kullanılan yöntemler, göz dokusuna zarar ve bu tür katarakt endoftalmi, ya da ciddi komplikasyonlara yol açabilirretina dekolmanı 11,12. Bu duruma göre, hayvan modelleri yaygın olarak kullanılan göz içi ilaç 13 farmakokinetik çalışmalarda kullanılmıştır. Bu hayvan modellerinde arasında, tavşan veya maymun en sık kullanılan hayvanlardır. Aile Leporidae sırayla Lagomorpha küçük memeli tavşan, dünyanın çeşitli yerlerinde bulunmaktadır. tavşan agresif olmadığından, bunlar ele bir deneyde kullanmak ve gözlemlemek kolaydır. Düşük maliyet, insanlara hayvan, benzer göz büyüklüğü hazır durumu ve karşılaştırma iyilik tavşan gözlerini kullanarak farmakokinetik çalışmaları gerçekleştirmek için bilgi büyük bir veritabanı. Bu yazıda, tavşan göziçi ilaçların farmakokinetik çalışmalar için bir protokol tanımlanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:213px;">Zoletil</td>
			<td style="width:143px;">Virbac Laboratories, Carros Cedex, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:213px;">Xylazine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:213px;">Proparacaine hydrochloride (Alcaine)</td>
			<td style="width:143px;">Alcon laboratories, Fort Worth, TX</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:213px;">Phenylephrine hydrochloride and tropicamide</td>
			<td style="width:143px;">Santen Pharmaceutical, Co., Osaka, Japan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:119px;">293-VE-050</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Carbobate-Bicarbonate buffer</td>
			<td style="width:143px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C3041-50CAP</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">NUNC MICROWELL 96F&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; W/LID NUNCLON D SI&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:119px;">167008</td>
			<td style="width:173px;">96 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Bovine Serum Albumin (BSA) 25grams(Net)</td>
			<td style="width:143px;">BOVOGEN</td>
			<td style="width:119px;">BSA025</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) pH7.4 (1X), 500mL</td>
			<td style="width:143px;">gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Sheep anti-Human IgG Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td style="width:143px;">Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:119px;">PA1-28652</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Goat Anti-Human IgG Fc(HRP)</td>
			<td style="width:143px;">abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97225</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:213px;">Goat anti-Human IgG, Fab&#39;2 Secondary Antibody, HRP conjugate</td>
			<td style="width:143px;">Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:119px;">PA1-85183</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">CelLytic MT&#160; Cell Lysis Reagent</td>
			<td style="width:143px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C3228-50ML</td>
			<td style="width:173px;">lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">100 Scalpel Blades</td>
			<td style="width:143px;">nopa instruments</td>
			<td style="width:119px;">BLADE #15</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">100 Scalpel Blades</td>
			<td style="width:143px;">nopa instruments</td>
			<td style="width:119px;">BLADE #10</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">FEATHER SURGICAL BLADE STAINLESS STEEL</td>
			<td style="width:143px;">FEATHER</td>
			<td style="width:119px;">11</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">1-StepTM TMB-Blotting substrate solution, 250mL</td>
			<td style="width:143px;">Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:119px;">34018</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:213px;">Stable Peroxide Substrate Buffer (10X), 100mL</td>
			<td style="width:143px;">Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:119px;">34062</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Softmax Pro</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">v.5.4.1</td>
			<td style="width:173px;">software for generating standard curve</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">SAAM II&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Saam Institute, Seattle, WA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;">software for pharmacokinetic modeling</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Phoenix WinNonlin</td>
			<td style="width:143px;">Pharsight, Cary, NC</td>
			<td style="width:119px;">v. 6.3</td>
			<td style="width:173px;">software for pharmacokinetic modeling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Avastin (bevacizumab)</td>
			<td style="width:143px;">Genentech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of rabbit eyes in pharmacokinetic studies of intraocular drugs

sistemik emilimi en aza indirerek ilaç uygulama içi yolu, tedavi edici ilaçlar, yüksek konsantrasyonlarda aktarılmasını sağlar. Çeşitli ilaçlar ön kamaraya ya da vitreus içine uygulanır ve göz içi enjeksiyon çeşitli göz içi hastalıkları tedavi etkili olmuştur. Hayvan diğer memelilere göre kullanımı kolay ve ekonomik bir şekilde Tavşan gözü yaygın oftalmik araştırma için kullanılmıştır ve bir tavşan göz büyüklüğü, insan gözünün benzerdir. 30 G iğne kullanılarak, uyuşturucu tavşan gözlerin intrakamaral ve intravitreal alanlara enjekte edilebilir. gözbebekleri sonra analize kadar dondurulur ve sulu mizah, vitreus ve retina / koroid ayrılabilir. vitröz ve retina / koroid örnekleri homojenize edildi ve analizden önce çözündürülebilir. Daha sonra, bağışıklık her bölme intraoküler ilaç konsantrasyonlarını ölçmek için gerçekleştirilebilir. Uygun farmakokinetik modelleri olabilirBu tür yarı-ömürlere ve maksimum ilaç konsantrasyonu gibi çeşitli parametreler hesaplamak için kullanılır. Tavşan gözü içi ilaçların farmakokinetik çalışmalar için iyi bir model olabilir.

Steril teknikleri ile Tavşan gözlerinde bir ilgi ilacın intravitreal enjeksiyonlar yapmak için kullanılan prosedür Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Işlenmiş gözler planlanmış bir zamanda çıkartılmış ve -80 ° C&#39;de saklanır. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, analiz üç bölmeli, sulu salgı, vitröz, ve retina / koroid için, dondurulmuş tavşan gözler ayrılır. Bölmeleri numuneleri ELISA için hazırlanır. Bir ikincil antik...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs at JoVE.com

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Göziçi İlaçların Farmakokinetik Çalışmaları Tavşan Gözlerinde Kullanımı

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

use-of-rabbit-eyes-in-pharmacokinetic-studies-of-intraocular-drugs

Research

JoVE Journal

Medicine

31.6K Görüntüleme.  Seoul National University Bundang Hospital. Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

Video: Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Farelerde Taksanlar Farmakokinetik ve Farmakodinamik Analiz Karotis Arter İnfüzyonlar

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Tıp

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and controllable animal models that simulate both conditions are presently uncommon. Therefore, new models are needed in order to mimic human pathophysiological conditions resulting from SAH.
This report describes the technical nuances of a rabbit blood-shunt SAH model that enables control of intracerebral pressure (ICP). An extracorporeal shunt is placed between the arterial system and the subarachnoid space, which enables examiner-independent SAH in a closed cranium. Step-by-step procedural instructions and necessary equipment are described, as well as technical considerations to produce the model with minimal mortality and morbidity. Important details required for successful surgical creation of this robust, simple and consistent ICP-controlled SAH rabbit model are described.

The experimental intracranial pressure-controlled blood shunt subarachnoid hemorrhage (SAH) model in the rabbit combines the standard procedures &#8212; subclavian artery cannulation and transcutaneous cisterna magna puncture, which enables close mimicking of human pathophysiological conditions after SAH. We present step-by-step instructions and discuss key surgical points for successful experimental SAH creation.

Subaraknoid Kanama Akut ve Geç sekeli Çalışmaları Tavşan Kan şant Modeli: Teknik Yönleri

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key element is the quantitative determination of a tumor-specific genetic alteration in relation to a universal sequence using a dual-probe digital PCR assay and the subsequent calculation of the proportion of tumor cells. The assay is carried out on a culture containing tumor cells of an established line and spiked-in non-tumor cells. The mixed culture is treated with a test drug at various concentrations. After the treatment, DNA is prepared directly from the survived adhesive cells in wells of 96-well plates using a simple and inexpensive method, and subjected to a dual-probe digital PCR assay for measuring a tumor-specific genetic alteration and a reference universal sequence. In the present demonstration, a heterozygous deletion of the NF1 gene is used as the tumor-specific genetic alteration and a RPP30 gene as the reference gene. Using the ratio NF1/RPP30, the proportion of tumor cells was calculated. Since the dose-dependent change of the proportion of tumor cells provides an in vitro indication for specificity of the drug, this genetic and cell-based in vitro assay will likely have application potential in drug discovery. Furthermore, for personalized cancer-care, this genetic- and cell-based tool may contribute to optimizing adjuvant chemotherapy by means of testing efficacy and specificity of candidate drugs using primary cultures of individual tumors.

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

The goal of this protocol is to assess specificity of anticancer drugs in vitro using mixed cultures containing both tumor and non-tumor cells.

Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

Göz İçi Basıncı Yükselmesi ile Retina İskemi-Reperfüzyon Hasarı Fare Modeli

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce sepsis with the use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration to mimic the human clinical setting. Critically ill patients require intensive medical support in order to survive. While the majority of patients will recover within a few days, about a quarter of the patients need prolonged intensive care and are at high risk of dying from non-resolving multiple organ failure. Furthermore, the prolonged phase of critical illness is hallmarked by profound muscle weakness, and endocrine and metabolic changes, of which the pathogenesis is currently incompletely understood. The most widely used animal model in critical care research is the cecal ligation and puncture model to induce sepsis. This is a very reproducible model, with acute inflammatory and hemodynamic changes similar to human sepsis, which is designed to study the acute phase of critical illness. However, this model is hallmarked by a high lethality, which is different from the clinical human situation, and is not developed to study the prolonged phase of critical illness. Therefore, we adapted the technique by placing a central venous catheter in the jugular vein allowing us to administer clinically relevant supportive care, to better mimic the human clinical situation of critical illness. This mouse model requires an extensive surgical procedure and daily intensive care of the animals, but it results in a relevant model of the acute and prolonged phase of critical illness.

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce sepsis with the use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration to mimic the human clinical setting.

Kritik Hastalık Fare Modeli Sıvılar, Uyuşturucu ve Besin İdaresi için Santral Venöz Hattı Kullanımı

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Ultrahigh çözünürlük fare optik koherens tomografi göz içi enjeksiyon Retina gen terapisi araştırma yardımcı olmak için

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

Kolesterol parçacıkları morfolojisi oransal olarak Lipid düşürücü ilaçlar farklı etkileri

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Transthoracic Echocardiographic Examination in the Rabbit Model

Large animal models such as the rabbit are valuable for translational preclinical research. Rabbits have a similar cardiac electrophysiology compared to that of humans and that of other large animal models such as dogs and pigs. However, the rabbit model has the additional advantage of lower maintenance costs compared to other large animal models. The longitudinal evaluation of cardiac function using echocardiography, when appropriately implemented, is a useful methodology for preclinical assessment of novel therapies for heart failure with reduced ejection fraction (e.g. cardiac regeneration). The correct use of this non-invasive tool requires the implementation of a standardized examination protocol following international guidelines. Here we describe, step by step, a detailed protocol supervised by veterinary cardiologists for performing echocardiography in the rabbit model, and demonstrate how to correctly obtain the different echocardiographic views and imaging planes, as well as the different imaging modes available in a clinical echocardiography system routinely used in human and veterinary patients.

Here we describe, step by step, a detailed protocol for performing echocardiography in the rabbit model. We show how to correctly obtain the different echocardiographic views and imaging planes, as well as the different imaging modes available in a clinical echocardiography system routinely used in human and veterinary patients.

Tavşan modelinde transtortik ekokardiyografi sınavı

Large animal models such as the rabbit are valuable for translational preclinical research. Rabbits have a similar cardiac electrophysiology compared to ...

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

Kıprimal Bezlere Concanavalin A Enjeksiyonu ile Indüklenen Sulu-Eksik Kuru Göz Hastalığının Tavşan Modeli: İlaç Etkinliği Çalışmalarına Uygulama

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

Self-Administration of Drugs in Mouse Models of Feeding and Obesity

Preclinical studies in mice often rely on invasive protocols, such as injections or oral gavage, to deliver drugs. These stressful routes of administration have significant effects on important metabolic parameters including food intake and body weight. Although an attractive option to circumvent this is to compound the drug in rodent food or dissolve it in water, these approaches also have limitations as they are affected by drug stability at room temperature for extended periods of time, the drug's solubility in water, and that the dosing is highly dependent on timing of food or water intake. The constant availability of the drug also limits translational relevance on how drugs are administered to patients. To overcome these limitations, drugs can be mixed with highly palatable food, such as peanut butter, allowing mice to self-administer compounds. Mice reliably and reproducibly consume the drug/peanut butter pellet in a short time frame. This approach facilitates a delivery approach with minimal stress compared with an injection or gavage. This protocol demonstrates the approach of drug preparation, animal acclimatization to placebo delivery, and drug delivery. The implications of this approach are discussed in studies related to timing of drug administration and the circadian rhythm.

The overall goal of this procedure is to describe a method for self-administration of drugs that can be used in mouse models of feeding and obesity.