We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

Butun hayvan prosedürleri, Hayvan Bakım yerel kurallarına göre gerçekleştirildi. Bu çalışmanın tüm detayları CECCAPP, bir Fransız etik komite tarafından kabul edildi. Hoechst Boya akış Tahlili tarafından bir yan Nüfus (SP) 1. Seçim <ol><li> Hoechst 33.342 boya ile 50 milyon hücrelerin boyanması. <ol><li> bir &quot;Hoechst&quot; etiketli tüp ve &quot;Hoechst ve Verapamil&quot; etiketli bir: İki 15 ml konik dipli steril tüpler hazırlayın. Steril su içinde 5 mM verapamil hidroklorür çözeltisi 10 ml hazırlayın. Kök hücreleri için kültür ortamı (CM) hazırlayın. <ol><li> Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM): F12 (1: 3, hacim: hacim) hidrokortizon, fetal buzağı serumu (% 5 FCS), 0.04 mg / L, CSC (CM-CSC) CM hazırlanması için, aşağıdakileri birleştirerek penisilin, 100 U / ml, 0.1 g / streptomisin L ve epidermal büyüme faktörü (EGFR) ve 20 ug / L&#39;dir. </li></ol></li><li> Laminer akış kaputu altında, hücreler trypsinize. s ile yıkayın, Ortamı çıkarınterile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 75 cm² şişeye tripsin-EDTA, 1 ml (0,5 g / L) ilave edilir. 37 ° C&#39;de 3 dakika kuluçkalayın. parental hücre çizgisi için kullanılan kültür ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Bir hücre sayacı kullanılarak hücrelerin sayısını. <ol><li> ana hücre hattı (CM-P) CM hazırlamak için% 10 FCS, 0.4 mg / hidrokortizon L, penisilin, 100 U / ml ve 0.1 g / streptomisin L) ile DMEM tamamlar. </li></ol></li><li> CM-P, 10 7 hücre / ml elde etmek üzere aşama 1.1.2 &#39;de elde edilen hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Hazırlanan 2 tüplerde hücre süspansiyonu bölünmüş: tüp &quot;Hoechst ve Verapamil&quot; ve tüp &quot;Hoechst&quot; 4 ml (4 x 10 7 hücre) 100 ul (10 6 hücre) koydu. </li><li> örnek &quot;Hoechst Verapamil&quot; olarak, 5 mM verapamil hidroklorür çözeltisi (nihai konsantrasyon: 0.5 mM) 10 ul ve hafifçe karıştırın. (0.1 g / L son konsantrasyon) 1 g / L Hoechst çözeltisi 5 ul ekle. Örnek &amp; # içinde34; Hoechst &quot;, 1 g 5 ul ekleyin / L Hoechst 10 6 hücre başına çözeltisi (200 ul toplam) Bundan sonra, alüminyum folyo kullanarak doğrudan ışığa maruz kalmaktan korunmuş örnekleri tutmak.. </li><li> 1 saat 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüm tüpler inkübe edin. yerleşme hücreleri önlemek için yavaşça her 15 dakikada karıştırın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Süpernatantı ve 1x PBS 2 mL her pelletini. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüj tüpleri. süpernatantı. PBS içinde seyreltilmiş yeniden süspanse &quot;Hoechst Verapamil&quot; 5 mg / L propidyum iyodür (PI) 500 ul tampon maddesiyle topak ve 5 mg / PBS tamponunda seyreltilmiş L PI 4 ml &quot;Hoechst&quot; pelet. </li><li> akış sitometresinde örnek alımı için tüplerde tek hücre agrega kaldırmak ve toplamak için 70 mikron hücre süzgecinden örnek çözümleri aktarın. buz üzerinde örnekleri tutmak ve alüminyum folyo kullanılarak doğrudan ışığa maruz kalmaktan korur. </li></ol></li><li> benHücre sıralayarak Hoechst boyası hariç Yan Nüfus solation. <ol><li> Bir aşağıdaki parametrelerle sıralayıcı flow sitometri üzerinde Hoechst negatif hücre ayrımı gerçekleştirin: UV lazer (355 nm), mavi Hoechst (BP 450/50) ve kırmızı Hoechst filtreleri (BP 610/20) UV lazer yolda 2 dedektörleri ve 2 toplayıcıları. <ol><li> Birincisi, boyama ve sitometresi set-up akış için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir örnek &quot;Hoechst&quot; analiz. </li><li> &quot;Nokta Plot&quot; tıklayın &quot;Küresel Çalışma&quot; penceresinde, sitometresinin yazılımı kullanarak (beşinci sağ resim üst) ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. Ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, FSC-A (ileri dağılım) ve apsis üzerinde, SSC-A (yan dağılım) (Şekil 1A) seçin. Aynı şekilde, SCC-lH nokta arsa karşısında SSC-W oluşturur. Bu ikinci nokta arsa üzerinde, bir P1 bölge oluşturmak için, &quot;Poligon kapısı&quot; (ondördüncü sağ resim üst) (Şekil 1B) 33 tıklatın. Not: P1 bölge olacaktek hücre kapsayacak ve ikilileri ayrımcılık. </li><li> İsteğe bağlı: P1 kapılı PI karşı bir FSC-A oluşturarak PI pozitif hücreleri hariç. Bu nokta arsa üzerinde, PI pozitif ölü hücreleri hariç PI negatif nüfus (P2) seçin. </li><li> &quot;Küresel Çalışma&quot; penceresinde, sitometresi yazılımı kullanarak, &quot;Dot Plot&quot; üzerine tıklayın ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, mavi Hoechst-A seçin ve apsis üzerinde, kırmızı Hoechst-A. nüfus bir sağ tıklama ile &quot;Show nüfus&quot; ve P1 seçin. Bu nokta arsa üzerinde, bir bölgeyi (P2) hücrelerin ana nüfus (Şekil 1C) sol yan kolu olarak görünen negatif Hoechst boya yan nüfus (SP) hücreleri seçmek için oluşturun. </li></ol></li><li> örnek &quot;Hoechst&quot; Analiz ve 10.000 olayları toplamak. SP nüfusunu temsil kapı P2, iyi konumlandırılmış emin olmak için, örnek analiz &quot;Hoechst ve Verapamil&quot; (10.000 olaylar)SP nüfus (Şekil 1D) ortadan kaybolması gözlemlemek. </li><li> 1.1.1.1 hazırlanan CM-CSC 1 ml içeren 15 ml&#39;lik bir tüp içinde SP Hoechst boya negatif hücreler toplanır. </li><li> hücre sıralama sonunda, santrifüj, 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de hücre süspansiyonu, süpernatant kaldırmak ve CM-CSC 1 ml pelletini. Bir hücre sayacı kullanılarak sıralanır hücrelerinin sayısını ve bir kültür şişesine hücrelerin uygun sayıda transferi (bakınız Tablo 1). CM-CSC ekleyin ve 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 atmosferde inkübe edin. </li><li> 5 x 10 7 hücre (aşama 3, &quot;hücre kültürü yöntemi&quot; bölümüne bakınız) en az kalana kadar 2 geçitlerin en fazla aynı koşullar altında kültür içinde hücreleri korumak. </li></ol></li></ol> Yan Nüfus&#39;e CD44 yüksek / ALDH yüksek Alt nüfusun 2. Seçim <ol><li> ALDH Algılama Kit ve C SP Hücreleri 50 milyon boyanmaD44 antikor. <ol><li> &quot;Boyanmamış&quot; (Tüp a) &quot;CD44-APC&quot; (Tüp b) &quot;IgG1-APC&quot; (Tüp c) &quot;ALDH&quot; (Tüp d) &quot;ALDH ve DEAB aşağıdaki gibidir: yedi 15 ml işaretlenmiş steril tüpler hazırlayın &quot;(Tüp e)&quot; ALDH ve CD44-APC &quot;(Tüp f)&quot; ALDH, DEAB ve CD44-APC &quot;(Tüp g). boyama esnasında 4 ° C&#39;de tüm tüpler ve reaktifleri tutun. </li><li> 4,5 (kitte bulunan) tampon 1 ml ve CD44-APC (alofikosiyanin) antikoru (: 100 seyreltme 1) 45 ul tampon A hazırlayın. tampon 1 100 ul ve IgG1-APC antikor 1 ul (: 100 seyreltme 1) ile tampon B hazırlayın. tampon 1 4 ml kiti reaktif 20 ul tampon C hazırlayın. </li><li> 10 7 hücre / ml, daha önce sıralanmış hücreleri (aşama 1.2.5) &#39;in bir hücre süspansiyonu hazırlanır. A, B ve C, ve tüp f 4 ml (4 x 10 7 hücre) tüplere hücre süspansiyonu 100 uL (10 6 hücre) ekleyin. Şu an için tüpler d, e ve g hücreleri koymayın. </li><li> 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de hücreleri içeren tüpler santrifüjleyin. dietilaminobenzaldehit 5 ul (DEAB), borular e ve g bir ALDH inhibitörü ekleme Süpernatantı ve tüpler, a, b ve tamponun 1. 100 ul Cı pelet tekrar süspansiyon. <ol><li> 4 ml reaktif C ve hemen f tüp içinde süspanse edin hücreleri tüpler d e ve g içine 100 ul aktarın. 30 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tüm tüpler inkübe ve alüminyum folyo ile doğrudan ışığa maruz kalmaktan korur. çökeltme hücreleri önlemek için 15 dakika sonra vorteks ile yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın. </li></ol></li><li> Bu andan itibaren, buz üzerinde tüpler tutmak ve alüminyum folyo kullanılarak doğrudan ışığa maruz korunmaktadır. Santrifüj Tüm 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de tüpler ve supernatant çıkarın. </li><li> 4 ml ve borular, tampon B, 100 ul tampon A süspanse boru C, 100 ul, b ve g tüpler yeniden süspanse tüpü F 1. inkübe 10 dakika 4 ° C&#39;de tampon 100 ulC. </li><li> Santrifüj Tüm 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de tüpler ve supernatant çıkarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 250 x g hızında tekrar 1 tamponu 1 ml (tüp f 4 mi) ve santrifüj ile bir kez yıkayın. süpernatantı. Yeniden askıya 4 ml tampon maddesi ile 1 ve 1 ml diğer borularda boru F pelet. </li><li> akış sitometresinde örnek alımı için uygun tüplerde tek hücre agrega kaldırmak ve toplamak için 70 mikron hücre süzgeçler ile örnek çözümleri aktarın. </li></ol></li><li> Floresan CD44 yüksek / ALDH yüksek Hücre Nüfus İzolasyon Hücre Sıralama&#39;yı Aktif. <ol><li> Gerçekleştirmek CD44 yüksek / ALDH bir aşağıdaki parametrelerle sıralayıcı flow sitometri üzerinde sıralama yüksek hücre: bir FITC filtresi (530/30), 1 ile mavi lazer yolda Mavi lazer (488 nm) ve kırmızı lazer (633 nm), 1 dedektör APC filtresi (660/20) ve 2 kolektörleri ile kırmızı lazer yolda dedektör. </li><li> sitometresi yazılımı kullanarak, Dot Plo &quot;üzerine tıklayınt &quot;(beşinci sağ üst resim) bölümünde 1.2.1.2 açıklandığı gibi, SSC-A nokta arsa karşısında FSC-A oluşturmak için hücre morfolojisi kontrol ve SSC-H karşısında SSC-W ile tek hücrelerden oluşan bir popülasyon seçmek için nokta arsa. </li><li> &quot;Küresel Çalışma&quot; penceresinde, sitometresi yazılımı kullanarak, &quot;Dot Plot&quot; üzerine tıklayın ve küresel çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak. ordinat üzerinde bir sağ tıklama ile, çift lekeli nüfusu seçmek için APC-A ve apsis, FITC-A seçin. ALDH yüksek hücreleri (Şekil 2A) seçmek için d ve e tüplerini kullanarak bir kapı oluşturun. Not: Pozitif hücreler DEAB (Şekil 2B) ile muamele boru e kaybolur. <ol><li> Aynı Grafikte, CD44 yüksek hücreler (Şekil 2C ve 2D) seçmek için tüpler b ve c kullanarak ikinci bir kapı oluşturun. Pozitif hücreler, IgG1-aPC ihtiva eden bir tüp içinde kaybolur. F ve g tüpleri analiz ve CD44 yüksek / ALDH &lt;içeren üçüncü bir kapı oluşturmaksup&gt; yüksek hücreleri (Şekil 2E ve 2F). Not: pozitif hücreler, IgG1-APC (Şekil 2D) ihtiva eden bir tüp içinde mevcut ise, hücre ve APC lekeli antikor etkileşimi spesifik değildir. </li></ol></li><li> CM-CSC 1 ml içeren 15 ml tüp içine CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreleri toplayın. CM 19 1 ml içeren 15 ml tüp içine düşük de CD44 düşük / ALDH toplayın. Not: Adım 1.1.1.1 tarif edildiği gibi CM-CSC hazırlayın. </li><li> 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj süpernatant kaldırmak ve CM-CSC 1 ml pelletini. sıralanmış hücrelerin sayısını. </li></ol></li></ol> 3. Hücre Kültürü Yöntemi <ol><li> Yukarıda tarif edildiği gibi hücre çift Ayırma işleminden sonra,% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de CM-CSC uygun bir kültür şişesi (Tablo 1) ayrılmıştır hücreler plaka. 18-24 saat sonra,Hücreler yapıştırılır kontrol ve kültür ortamı değiştirin. genişleyen koloniler% 50 konfluent daha büyük olana kadar her 3 günde bir kültür ortamı değiştirin. </li><li> Kültür şişesi hücreleri trypsinize EDTA (Tablo 1) - tripsin 0.5 g / L, uygun hacim kullanın. 37 ° C&#39;de hücreler 3-5 dakika kuluçkalayın. Tripsin hareketi durdurmak için CM-CSC (Tablo 1) uygun hacim. </li><li> Elde edilen hücreler ve plaka CM-CSC ile 175 cm² kültür şişelerinde 4 x 10 5 hücre sayısını. 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2. Bu konsantrasyonda, 24 saatlik bir ikiye katlanma süresi olan hücreler 7 gün içinde% 70 konfluent olacaktır. </li><li> Bunlar 3 pasajlar tabi önce in vitro veya in vivo deneylerde CSCS kullanın. </li></ol> Tümör Potansiyeli ve CSC Özellikleri 4. Onay <ol><li> Tümör Küre Oluşumu CD44 yüksek / ALDH tümör Potansiyeli Onaylayüksek Hücreler. <ol><li> 3.2 de tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de 15 ml&#39;lik bir tüp ve santrifüj 1 x 10 6 hücre ekleyin. Süpernatantı ve bir DMEM pelet yeniden askıya: F12 (3: 1) rhEGF orta FCS bilgilerini, 20 ng / ml heparin ve 1 x B27 4 mg / l. 37 ° C&#39;de 6, alçak ankraj plakaları kültür şişelerinde hücreleri inkübe ve% 5 CO2. Not: DMEM: F12 (3: 1) FCS% 5, rhEGF 20 ng / ml, 4 mg / heparin L ve 1 x B27 hücre FCS içermeyen büyümez halinde içeren ortam. </li><li> (Şekil 3A) tohumlama sonra 4 ila 10 gün arasında bir optik mikroskop ile tümör küre oluşumunu gözlemlemek. Not: Tümör küre çapı en fazla 35 mm olmalıdır. CD44 yüksek / ALDH yüksek hücreler CD44 düşük / ALDH düşük oranla sayısı ve büyüklüğü bakımından daha hızlı ve daha gelişmiş tümör küre oluşumunu gösterecektir. </li></ol></li><li> İn Vivo tümorijenisite Değerlendirilmesi sonraNOD-SCID Fare CD44 / yüksek ALDH yüksek hücrelerinin deri altına enjekte. <ol><li> Ayırma işleminden sonra, üç farklı konsantrasyonda (10 4 hücre / ml, 10 5 hücre / ml ve 10 6 hücre / ml) PBS içinde hücrelerin yeniden askıya. 6 farelerin sağ yan yüz bölgesi içinde deri altına 10 4 hücre / ml (10 3 hücre), 100 ul enjekte edilir. 10 5 hücre / ml (10 4 hücreleri) ve 10 6 hücre / ml (10 5 hücreleri) için de yapın. Not: 10 3 hücreleri test edilebilir daha düşük seyreltme. </li><li> Sol yan bölgede CD44 düşük / ALDH düşük hücrelerin aynı konsantrasyonu enjekte edilir. Kadar 10 hafta boyunca Monitör enjekte edilen fareler tümör ilerlemesi 19 görmek için. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Baumann, M., Krause, M., Hill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+role+of+cancer+stem+cells+in+radioresistance.">Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance.</a> Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+prostate+cancer+stem+cells.">Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells.</a> Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).</li><li>Eramo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population.">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).</li><li>Dalerba, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+human+colorectal+cancer+stem+cells.">Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).</li><li>Hermann, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer.">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).</li><li>Yang, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD90+cancer+stem+cells+in+human+liver+cancer.">Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer.</a> Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumorigenic+subpopulation+with+stem+cell+properties+in+melanomas.">A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas.</a> Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).</li><li>Prince, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+subpopulation+of+cells+with+cancer+stem+cell+properties+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).</li><li>Clarke, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+--+Perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).</li><li>Soltanian, S., Matin, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+cancer+therapy.">Cancer stem cells and cancer therapy.</a> Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).</li><li>Molyneux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1+basal-like+breast+cancers+originate+from+luminal+epithelial+progenitors+and+not+from+basal+stem+cells.">BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).</li><li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity.">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li><li>Ratajczak, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+--+Normal+stem+cells+'Jedi'+that+went+over+to+the+'dark+side.'.">Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'.</a> Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+and+chemoresistance+of+CD133++cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma.</a> Mol Cancer. 5, 67 (2006).</li><li>Moncharmont, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+cornerstone+of+radiation+resistance:+Cancer+stem+cell.">Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell.</a> Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).</li><li>Bertrand, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Head+and+Neck+Cancer+Stem+Cells+to+Overcome+Resistance+to+Photon+and+Carbon+Ion+Radiation.">Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).</li><li>Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+tumor+stemness+by+increasing+the+invasive+and+tumorigenic+side+population+fraction.">Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction.</a> Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).</li><li>Diehn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+reactive+oxygen+species+levels+and+radioresistance+in+cancer+stem+cells.">Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells.</a> Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).</li><li>Chen, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+stem+cell+concept+in+progression+of+head+and+neck+cancer.">The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer.</a> J Oncol. 2009, 894064 (2009).</li><li>Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+oral+squamous+cell+carcinoma+possesses+tumor+stem+cell+phenotypes.">Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes.</a> Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subpopulation+of+CD133(+)+cancer+stem-like+cells+characterized+in+human+oral+squamous+cell+carcinoma+confer+resistance+to+chemotherapy.">A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy.</a> Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).</li><li>Sun, S., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Head+neck+squamous+cell+carcinoma+c-Met&#8314;+cells+display+cancer+stem+cell+properties+and+are+responsible+for+cisplatin-resistance+and+metastasis.">Head neck squamous cell carcinoma c-Met&#8314; cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis.</a> Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+putative+marker+for+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cancer.">Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).</li><li>Lim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+traits+in+squamospheres+derived+from+primary+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas.">Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas.</a> Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).</li><li>Yu, Q., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface-localized+matrix+metalloproteinase-9+proteolytically+activates+TGF-beta+and+promotes+tumor+invasion+and+angiogenesis.">Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.</a> Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-initiated+signaling+promotes+the+survival+and+self-renewal+of+cancer+stem+cells.">Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).</li><li>Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+properties+of+CD44++cancer+stem-like+cells+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).</li><li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cucurbitacin+I+suppressed+stem-like+property+and+enhanced+radiation-induced+apoptosis+in+head+and+neck+squamous+carcinoma--derived+CD44(+)ALDH1(+)+cells.">Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells.</a> Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).</li><li>Clay, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-marker+identification+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+with+aldehyde+dehydrogenase.">Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase.</a> Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).</li><li>Meinelt, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , (2012).</li><li>Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+one+of+the+markers+of+cancer+stem+cells+in+Hep-2+cell+line.">CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.</a> Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).</li><li>Fukusumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD10+as+a+novel+marker+of+therapeutic+resistance+and+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).</li><li>Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+as+a+molecular+marker+to+screen+cancer+stem+cells+in+hypopharyngeal+cancer.">CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer.</a> Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).</li><li>Kanojia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+cancer+stem+cells+derived+from+primary+tumors+of+HER2/Neu+transgenic+mice.">Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice.</a> Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).</li><li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts.">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu protokol için diğer HNSCC hücre çizgileri için geçerli olan özel bir hücre soyundan CSCS başarıyla izolasyonu için güvenilir bir yöntem tarif eder. İzole baş ve boyun CSCS bağışık yetmezliği olan farelere 19 transplantasyon in vitro ve fonksiyonel doğrulama ileri moleküler karakterizasyonu için daha sonra uygundur. Ancak, bazı değişiklikler yan nüfus veya ebeveyn hücre hattında bulunan CD44 yüksek / ALDH yüksek oranda bağlı test edile...

Baş ve boyun yassı hücreli karsinom (HNSCC), tüm dünyada sık görülen ve mevcut tedavilerde kaydedilen ilerlemelere rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların prognozu kötüdür. Hastanın genel 5 yıllık sağ kalım oranı cerrahi, kemo-radyoterapi ve hedeflenen-terapiler dahil terapötik yaklaşımların kombinasyonu rağmen% 30 civarında olduğunu. Son çalışmalar antikanser tedaviler 1 Aşağıdaki kanser kök benzeri hücrelerin hayatta kalma (rulmanları) için lokal nüks ve uzak metastaz bağlıyor. Göğüs, beyin, prostat, akciğer, kolon, pankreas, karaciğer ve deri 2- dahil olmak üzere çeşitli katı tümörlerin kök hücrelerin özelliklerini (farklılaşmamış durum, kendini yenileme ve farklılaşma kapasitelerinin ve telomeraz aktivitesi) sunan hücrelerin varlığını destekleyen artan kanıtlar vardır 10. Ancak, CSCS kökeni 11,12 belirsizliğini koruyor. Normal kök hücreleri 3,13 veya dedifferen malign transformasyonu kaynaklanabilirCSCS benzeri özellikler 14,15 kazanmak tümör hücrelerinin sokan. Bu nedenle, CSCS ilişkin belirgin yollarının anlaşılmasında erken tanı ve dirençli HNSCC tedavisi konusunda bilgi verilecektir. CSCS ayrıca tümör hücrelerinin 16-19 toplu karşılaştırıldığında tümör nüks sonuçlanan standart kemoterapi ve radyoterapi kaçmasına dirençli fenotipleri, sahip ve 20 nişler hipoksik içine lokalize olduğu öne sürülmüştür. Sayısız faktör gibi sessizliğini eğilimi olarak CSCS bu dirençleri, gelişmiş DNA onarım, up-regüle hücre döngüsü kontrol mekanizmaları ve serbest radikal süpürücü 21 açıklamak için öne sürülmüştür. Dahası, çeşitli onkojenik moleküler yollar özellikle CSCS 17 aktive edilebilir. daha hedefli tedaviler için CSCS bilgi geliştirmek için, kök hücre ile ilgili markörlerin heterojen bağlı, tanımlama ve CSCS izolasyonu için güvenilir yöntemler mikanser 22 çeşitli. HNSCC olarak, kök benzeri tümör başlatan hücreleri, ilaç dışarı atım taşıyıcıları ifade 23, CD44 yüksek, CD24 düşük CD133 yüksek, c-Met + 10,24 fenotipe gibi farklı CSC biyobelirteçlerini (ifade hücreleri sıralayarak primer hasta tümörlerinden izole edilmiştir, 25 ya da ALDH yüksek aktiviteli 26) ya da CSC özelliklere sahip squamospheres oluşturmak için birincil hasta tümörü yetiştirilmesi. Bununla birlikte, squamospheres sayısı, böylece daha fazla karakterizasyon için küçük bir örneklem büyüklüğü 27 çalışmaları vererek, iki pasaj sonra dramatik azalır. Bu nedenle, in vitro deneyler, köklü hücre hatları başlayarak CSCS bilgisini geliştirmek için deney tasarımı için daha kolay bir çözümdür. Bu makalenin amacı, multiparametrik akım sitometri analizi a kullanarak HNSCC hücre hatları CSCS izole etmek için bir yöntem önermektirnd hücre sıralama. ALDH aktivitesinin dahil olmak üzere birçok CSCS özellikleri ile ilişki içinde CD44 ekspresyonu, yan Nüfus (SP) fenotipi sferoid oluşturma yeteneğine ve tümör gelişimini izole edilmesi ve CSCS bu alt-nüfusu karakterize etmek için kullanılır. CD44, bir hücre yüzeyi glikoproteini, hücre yapışması ve göçü katılır. CD44 yüksek kafa ve boyun kanseri modelleri 29-31 de dahil olmak üzere, CSCS 28 bir çok katı tümörlerin olarak ifade edilir. Ayrıca, CD44 yüksek hücreler 10 olamaz in vivo CD44 düşük hücrelerin ise heterojen bir tümör oluşturabilir. SP deney CSC zarı içinde aşırı taşıyıcı proteinlerin ATP-bağlayıcı kaset (ABC) ailesi ile Hoechst boya 22 akıttığı hücre ayırıcı potansiyeli dayanır. Bu deney, bu kontrol numunelerinde verapamil ABC transportör inhibitörlerinin kullanılmasını içerir. Aldehit dehidrogenaz (ALDH) ret için retinol dönüştürme görev yapan hücre içi enzimerken kök hücre farklılaşması 25,26 sırasında inoic asit elde edildi. Yüksek ALDH aktivite göstermek HNSCC 26 kök benzeri hücre davranışını ve ALDH yüksek hücrelerin çok az sayıda sergileyen hücreler in vivo 26,32 tümör oluşturmak edebiliyoruz. Bu belirteçlerin ve özellikleri kombinasyonu başarıyla Bertrand e t arkadaşları tarafından kullanılmıştır. Vitro ve foton bu CSCS in vivo ve karbon iyon radyasyonu 19 direncini incelemek için. Bu sonuçlar açık bir şekilde, çeşitli hücre belirteçleri ve özellikleri kombinasyonu tek markör yaklaşımlara göre HNSCC CSCS popülasyonları hakkında yararlı çalışmalar için daha seçici olduğu gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Fetal Calf Serum Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone water soluble</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>The solution must be prepared just before use because it is very unstable</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4</td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stem Cell</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, human antibody</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, human antibody</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 coulter particle</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B cell line</td><td>Gift from the John Little&amp;rsquo;s Laboratory</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FaDu cell line</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Low anchorage plates</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of a head and neck squamous cell carcinoma subpopulation having stem cell characteristics

baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom (HNSCC) ilerleme anlayışı ilerlemelere rağmen, beş yıllık sağkalım oranı nedeniyle lokal nüks ve uzak metastaz düşük kalmaktadır. bu nüksetme açıklamak için bir hipotez içsel kemo ve radyo direnci mevcut kanser kök-benzeri hücreler (rulmanları) varlığıdır. Yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için, hedeflenen tedavi etkinliğini doğrulamak deney modelleri vardır ve bu nedenle CSCS tanımlanması ve izole edilmesi için güvenilir bir yöntem olması gereklidir. Bu amaçla, flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması tarafından gerçekleştirilen iki ardışık hücre sortings (FACS) birleştirilmesine dayanır, insan HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyonu için bir protokol mevcut. İlki, diğerleri arasında, dışlamak böylece Kaset (ABC) taşıyıcı proteinler ATP-bağlama ve aşın için CSCS özelliğine dayanmaktadır gibi Hoechst 33342. hücreleri gibi hayati DNA boyalar th ile sıralanıryöntem, bir &quot;yan nüfus&quot; (SP) olarak tanımlanır edilir. SP hücreleri düşük bir yüzde ebeveyn hücrelerinin (&lt;% 5) &#39;i temsil olarak, giderek artan bir fazı ikinci hücre sıralama önce sayısını arttırmak için gereklidir. Bir sonraki adım, iki HNSCC kök hücre özellikleri hücresi yüzey markerine CD44 (yüksek CD44) ve aldehit dehidrojenaz aşırı ifadesi (ALDH yüksek) yüksek ekspresyon seviyesi, yani sahip hücrelerin seçilmesine izin verir. Tek bir belirteç kullanımı CSCS, SP kombinasyonu izolasyonu için çok sayıda sınırlamalar ve tuzaklar olduğundan, CD44 ve ALDH belirteçleri canlı hücreleri gerektiren başka analitik ve fonksiyonel testleri için CSCS izole etmek için yararlı bir araç sağlayacaktır. CSCS sap benzeri özellikleri son tumorispheres oluşumu ve β-katenin sentezlenmesi ile in vitro koşullarında doğrulanmıştır.

HNSCC hücre çizgilerinden CSCS izolasyonu ebeveyn hücre çizgisinde CSCS çok az bir kısmının birbirini takip eden iki sıralama gerekli. İlk ayırma ilaç akış taşıyıcılar nedeniyle Hoechst boya hariç tutmak için CSCS yeteneğine dayanmaktadır. Bu sıralama toplam hücre popülasyonunun (Şekil 1) 1-5% satın alınması ile sonuçlanmıştır. Hoechst boyası negatif hücre sıralama sırasında, SSC-A nokta arsa (Şekil 1A) karşı FSC-...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics at JoVE.com

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

isolation-characterization-head-neck-squamous-cell-carcinoma

Research

JoVE Journal

Medicine

8.5K Görüntüleme.  Université de Lyon. Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Video: Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains poor when metastasis has occurred. The Cancer Stem Cell (CSC) theory holds that there is a subset of tumor cells within the tumor that have stem-like characteristics, including the capacity to maintain the tumor and to resist multidrug chemotherapy. Therefore, a better understanding of OS biology and pathogenesis is needed in order to advance the development of targeted therapies to eradicate this particular subset and to reduce morbidity and mortality among patients. Isolating CSCs, establishing cell cultures of CSCs, and studying their biology are important steps to improving our understanding of OS biology and pathogenesis. The establishment of human-derived OS-CSCs from biopsies of OS has been made possible using several methods, including the capacity to create 3-dimensional stem cell cultures under nonadherent conditions. Under these conditions, CSCs are able to create spherical floating colonies formed by daughter stem cells; these colonies are termed &#34;cellular spheres&#34;. Here, we describe a method to establish CSC cultures from primary cell cultures of conventional OS obtained from OS biopsies. We clearly describe the several passages required to isolate and characterize CSCs.

The presence of cancer stem cells (CSCs) in bone sarcomas has recently been linked to their pathogenesis. In this article, we present the isolation of CSCs from primary cell cultures obtained from human biopsies of conventional osteosarcoma (OS) using the ability of CSCs to grow under nonadherent conditions.

Kanser kurulması İnsan Konvansiyonel Osteosarkom Hücre Kültürleri Kök

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

Kanser Araştırmaları

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been shown to be responsible for tumor initiation, metastasis, and drug resistance. Therefore, it is important to develop specific TIC-targeting therapy in addition to current chemotherapy strategies, which mostly focus on the bulk of non-TICs. In order to further understand the mechanism behind the malignancy of TICs, we describe a method to isolate and to characterize TICs in human sarcomas. Herein, we show a detailed protocol to generate patient-derived xenografts (PDXs) of human sarcomas and to isolate TICs by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using human leukocyte antigen class I (HLA-1) as a negative marker. Also, we describe how to functionally characterize these TICs, including a sphere formation assay and a tumor formation assay, and to induce differentiation along mesenchymal pathways. The isolation and characterization of PDX TICs provide clues for the discovery of potential targeting therapy reagents. Moreover, increasing evidence suggests that this protocol may be further extended to isolate and characterize TICs from other types of human cancers.

We describe a detailed protocol for the isolation of tumor-initiating cells from human sarcoma patient-derived xenografts by fluorescence-activated cell sorting, using human leukocyte antigen-1 (HLA-1) as a negative marker, and for the further validation and characterization of these HLA-1-negative tumor-initiating cells.

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Intramucosal Inoculation of Squamous Cell Carcinoma Cells in Mice for Tumor Immune Profiling and Treatment Response Assessment

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop better therapeutic strategies, understanding tumor microenvironmental factors that contribute to the treatment resistance is important. A major impediment to understanding disease mechanisms and improving therapy has been a lack of murine cell lines that resemble the aggressive and metastatic nature of human HNSCCs. Furthermore, a majority of murine models employ subcutaneous implantations of tumors which lack important physiological features of the head and neck region, including high vascular density, extensive lymphatic vasculature, and resident mucosal flora. The purpose of this study is to develop and characterize an orthotopic model of HNSCC. We employ two genetically distinct murine cell lines and established tumors in the buccal mucosa of mice. We optimize collagenase-based tumor digestion methods for the optimal recovery of single cells from established tumors. The data presented here show that mice develop highly vascularized tumors that metastasize to regional lymph nodes. Single-cell multiparametric mass cytometry analysis shows the presence of diverse immune populations with myeloid cells representing the majority of all immune cells. The model proposed in this study has applications in cancer biology, tumor immunology, and preclinical development of novel therapeutics. The resemblance of the orthotopic model to clinical features of human disease will provide a tool for enhanced translation and improved patient outcomes.

Here we present a reproducible method for developing an orthotopic murine model of head and neck squamous cell carcinoma. Tumors demonstrate clinically relevant histopathological features of the disease, including necrosis, poor differentiation, nodal metastases, and immune infiltration. Tumor-bearing mice develop clinically relevant symptoms including dysphagia, jaw displacement, and weight loss.

Skuamöz Hücre Karsinomu Hücre Tümörü bağışıklık profil oluşturma için fareler ve tedaviye yanıt değerlendirme intramucosal aşı

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is a debilitating and deadly disease with a high prevalence of recurrence and treatment failure. To develop ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Tıp

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Bir Baş-Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu subpopülasyonu olması Kök Hücre Özellikleri İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler