Kök hücre izolasyonu, mevcut yöntemlerle progenitor hücrelerinin birlikte izole edilmesi nedeniyle büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Karışık atalardan gelen kusan kök hücreleri izole etmek için yeni bir biyomarkeriçermeyen bir titre geliştirdik. Bu küresel tabanlı, etiket tutma testinin en büyük avantajı, CFSE veya Far Red etiketleme kullanarak FACS tarafından kızlarının atalarından canlı kök hücreleri genişletebilir ve izole edebilir.
Konvansiyonel tedaviler en prostat kanseri hücrelerinin ortadan kaldırmak iken, kanser kök hücreleri terapötik direnç nedeniyle kalır, böylece hastalığın ilerlemesini sürüş. Kök benzeri hücre izolasyonu, etkili hastalık remisyon için terapötik olarak eş hedeflenebilir yeni genlerin belirlenmesine izin verecektir. Bizim etiket tutma tsay çeşitli doku ve hücrelerden normal kök hücre izolasyonu için geçerli, ve kanser kök hücre araştırma için.
Daha da önemlisi, bu sataşme diğer epitel hücreli kanserler için geçerli, meme ve kolorektal kanserler gibi. 100 milimetrelik kültür yemeklerini 2,5 mikrogram fibronektin çözeltisi ile iki mililitre kaplayarak başlayın ve oda sıcaklığında bir gecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra çözeltiyi aspire edin ve kültür yemeklerinin biyogüvenlik kabininde 45 dakika kurumasına izin verin.
Bir fibronektin kaplı çanak prostat epitel hücre büyüme orta dokuz mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece karbondioksit inkuvöz sıcak tutmak. 37 santigrat derece su banyosunda dondurulmuş insan prostat epitel hücrelerinin bir şişe çözülme ve sıcak ortamda 10 mililitre hücreleri resuspend. Hücre süspansiyonuna 500 kez 5 dakika santrifüj edin.
Sonra aspire ve supernatant atın. Sıcak kültür orta bir mililitre hücreleri resuspend ve önceden ısıtılmış orta ile fibronektin kaplı çanak doğrudan süspansiyon bir mililitre aktarın. Sonra 37 santigrat derece karbondioksit kuvözde çanak kuluçka.
Hücreleri birlikte etiketliyorsanız, metin el yazmasında açıklandığı gibi BrdU etiketli hücreleri 10 günlük 2B kültürde hazırlayın. Sonra beş mikromolar CFSE veya Far Kırmızı ekleyin ve 30 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, orta yı dikkatlice boya ile aspire edin ve hücreleri beş mililitre sıcak PBS ile iki kez yıkayın.
Daha sonra, el yazması yönlere göre% 05 tripsin EDTA ile enzimatik sindirim gerçekleştirin. Hücreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Hücreler buz gibi, bire bir bazal membran matris ve kültür orta karışımı 3D prostasphere oluşumu için resuspended edildi.
3D bodrum matris sisteminde prostasphere kültürünü hazırlamak için, bir gecede dört santigrat derecede bodrum membran matris eritme ve kullanmadan önce buz üzerinde tutmak. Sonra yavaşça buz gibi kültür ortamı eşit hacimli içine buz gibi bodrum membran matris bir mililitre ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, hava kabarcıkları tanıtmak değil dikkat.
500 mikrolitre toplam hacmi için buz gibi bire bir bazal membran matris ve kültür medya karışımı beş kez 10 ila 1/4 insan prostat epitel hücreleri resuspend. Pipet her kuyunun alt kenarına çözüm ve eşit karışımı dağıtmak için plaka girdap. Matrisin katılaması için plakayı 37 derece lik karbondioksit kuvöze 30 dakika yerleştirin.
Sonra iyi başına sıcak kültür ortamı bir mililitre ile kaplayın, halka rahatsız değil emin olun. CFSE etiketli prostaspheres hasat için iki mililitre dispase ve pipet yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırmak için orta değiştirin. Matrisi sindirmek için 37 derecede 37 santigrat derecede plakayı kuluçkaya yatırın, sonra küre karışımını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne koyun.
Küreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. 500 mikrolitre sıcak %05 tripsin EDTA'daki peleti yeniden askıya alın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Küreleri 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından %10 FBS ile 500 mikrolitre sıcak PBS ekleyin.
Küreleri tamamen ayrıştırmak için 26 kalibrelik bir iğneyle mililitrelik bir şırıngadan geçirin. Hücreleri 500 kez g beş dakika santrifüj edin. Sonra aspire ve supernatant atın.
Ölü hücreleri lekelemek ve oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yaslamak için mililitre propidium iyodür başına bir mikrogram ile sıcak kültür ortamının bir mililitre hücreleri resuspend. Santrifüjtekrarlayın ve supernatant atın. Sonra sıcak orta bir mililitre ile hücreleri yıkayın.
Santrifüjtekrarlayın ve supernatant atın. Sıcak kültür orta bir mililitre hücreleri resuspend ve 35 mikron gözenek boyutu hücre süzgeç snap kapaklar ile filtreleyerek beş mililitre polistiren yuvarlak alt tüpler hücreleri toplamak. Tripsin dağılmış CFSE etiketli prostasphere hücrelerinFACS analizini yapın.
Negatif kontrol olarak etiketlenmemiş hücreleri ve kapıları ayarlamak için pozitif kontrol olarak CFSE etiketli hücreleri kullanmak, kısmi CFSE-yüksek ve CFSE-düşük hücrelerin alt popülasyonlarını sıralamak ve toplamak için örneği çalıştırın. Primer normal insan prostat epitel hücreleri fibronektin kaplı kültür yemeklerine yerleştirildi ve hücre büyümesi 2D kültüründe sürdürüldü. Bir bazal membran matris ile 3D kültüre transfer üzerine, farklılaşmış epitel hücreleri yavaş yavaş öldü ve sadece prostat kök hücreleri kaldı.
Prostat epitel hücrelerinin 2B kültüründe çift etiketlemesi ve ardından 3D kültürde küresel oluşum, aynı etiket tutma hücrelerinde BrdU, CFSE ve Far Red'in birlikte lokalizasyonunu göstermiştir. Çift immünboyama etiket istinat hücreleri sitokeratin protein keratin 14 daha düşük seviyelerde sergileyen gösterdi, hücre kavşak proteinE-kadherin azalmış, artmış kök hücre erken marker proteinleri Wnt10b ve ALDH1A1, artmış otofaji proteinLC3, ve artmış miyozin IIB. Ayrıca, küresel tabanlı, etiket tutma testi başarıyla prostat kanseri örneklerinde kanser kök benzeri hücreleri algılar.
CFSE etiketli istinat kök benzeri kanser hücreleri ve insan prostat kanseri örneklerinden elde edilen küresel ler, etiketsiz progenitor hücrelere göre azaltılmış E-kadherin proteini sergilemiştir. Bu protokolü denerken, kültür orta hazırlık için sıvı formda matris korumak önemlidir. Bir gecede dört derecede saklayın ve pipet uçlarını matris dağıtmadan önce buz gibi PBS'de soğutun.
Sferoid bazlı etiket tutma tahlilleri kullanılarak kök hücrelerin izole edilmesinin ardından kök hücrelerde belirli genleri ve yeni biyobelirteçleri belirlemek için tek hücreli RNA dizilemesi ve proteomik analiz yapılabilir. Canlı kanser kök hücrelerinin küresel tabanlı etiket tutma testi ile izole edilmesi, araştırmacıların kanser kök hücre kaynaklı tümöroidleri in vitro olarak yetiştirmelerini ve yeni anti-kanser ilaçlarını taramalarını mümkün kılabilir.
