PAC kısmen Wisconsin Kök Hücre Eğitim Programı (PA Clark) University of bir NIH T32 hibesi ile desteklenmektedir. JSK kısmen HEADRUSH Beyin Tümörü Araştırma Profesörlük, Roger Loff Memorial GBM Araştırma Fonu ve UW Vakfı / Nöroşirurji Beyin Tümörü Eğitim ve Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. JCW ve YH kısmen NIH hibe NIBIB 1R01EB009103-01 tarafından desteklenmektedir.

1. BTSC cep disosiasyon BTSCs neurospheres gibi serum serbest kök hücre aracı maddesi içinde büyütülmüştür önceden mevcut olan kültürler elde edilmiştir. kültürü önceden 10, 11 tarif edilmiştir. <ol><li> BTSC türevi neurospheres hücre süspansiyonu hazırlayın. BTSC türevi neurospheres bir 15 ml&#39;lik konik bir tüp içinde toplanmış ve 5 dakika için 900 rpm&#39;de santrifüjlenir. Daha hızlı santrifüj kesme ve / veya hasar neurospheres yapabilirsiniz. Süpernatan havalandırılır ve neurosphere kültür önceden ısıtılmış Accutase 0.5 ml içinde tekrar süspanse edilir. Bu çözüm, 37, 5-10 dakika için inkübe edilir ° C neurospheres gevşetmek için izin verir. Hücreler 10-20 mekanik olarak hafif bir P100 pipet vuruş ve daha sonra kök hücre orta 1.5 ml Accutase nötralize etmek için hücrelere ilave edilir ile bozulur. </li><li> BTSCs daha sonra 5 dakika için 1300 rpm&#39;de santrifüjlenmiştir, ve kök hücre orta 1 ml içinde tekrar süspanse edilir. </li><li> Bir 50 ul alikot süspansiyon kaldırılıriyon ve hücre sayımı için bir mikrosantrifüj tüp içine yerleştirilir. Tripan mavi 50 ul Eppendorf tüpüne eklenir ve süspansiyon hücre sayımı bir hemasitometre yerleştirilir. </li><li> Hücre sayımı sonra gerekirse, ek bir kök hücre orta 20.000 canlı hücre / ul medya bir hücre yoğunluğu vermek için BTSC süspansiyonuna ilave edilir. </li></ol> 2. Iki katlı su-8 master ve PDMS damga kalıp İmalatı (bkz. Şekil 1) Biz mikroakışkan cihazların montajı için gerekli olan su-8 master ve PDMS damga, imal optik litografi ve yumuşak litografi kullanın. Standart prosedür 12 &#39;dan biraz farklı, bizim su-8 ana iki katmandan oluşur. 250 mikron boyunda tohum ve alma odaları, ikinci / üst tabakası ise 3-mikron boyunda mikrokanallar, önceki süreçte alt / ilk tabakadaki dökülür. İki kültür bölmeleri (mikrokanal arasındaki doğru bağlantı için içins ve odaları gibi), iki kat birbirine doğru konumda hizalanmış olması gerekir. Bununla birlikte, ikinci tabakanın kalınlığı ve donukluk özelliklerini alt erişmesini optik / indirgeme ortalayıcı engellemek için yeterince büyüktür. Burada konvansiyonel işaretleri uzaktan konumlandırılırken ile maskeler tasarlayabilirsiniz. Ikinci katman eğirme iken Böylece, birinci tabaka, bu belirteçler seçici olarak korunmuş olabilir. Bunun sonucu olarak, özellikleri ve her ikisi de tek bir ana tabaka halinde yapılır ve daha sonra PDMS damga kabartma halinde kalıplanması için hazırdır. <ol><li> Tasarım ve iki fotoğraf maskeler hazırlamak. Bir maske iki konvansiyonel işaretleri ve ilk kat için mikrokanallardaki bir dizi (400 mikron uzun ve 10-50 mikron geniş) oluşmaktadır. Başka mask ikinci kat için kabinler (2 mm uzunluğunda ve 600 mikron genişliğinde) tohum ve alıcı oluşur. Hem maskeleri Illustrator (Adobe, California) tasarlanmış, izopropanol ve hava-kuru temizlenebilir şeffaflık filmler (İnce Metal Parçaları, Colorado), üzerine lazer baskılı. </li><li> Birinci katman ile edinsu-8 fotorezist (MICROCHEM, Massachusetts) tedarikçiden ürün kılavuzuna göre. İlk olarak, spin-kat su-8 (5), 3-mikron kalınlığında fotorezist ile sap gofret (WRS malzemeler, California) yumuşak kabartma izledi. Fotorezist ultraviyole maruz kalan ve post-pişirme ve gelişmekte ardından yakın temas karşılık gelen maske ile kür sonra olduğunu. </li><li> Su-8 (2100) kalın 250 mikron ile Spin-kat, ikinci kat. Birinci tabaka ikinci indirgeme işaretleri bloke kalın fotorezist önlemek için amacıyla, ikinci katman bölgesinin yan kaplama öncesi içinde séloteyip bu bölgeleri kapsar. Kaset daha sonra hizalama amacıyla işaretleri soyulmuş edilir. </li><li> UV maruz ikinci maske ile ikinci kat. Hizalama işaretleri ortaya sayesinde, optik maske hizalama kullanarak ikinci maskesi olanlar onları hizalamak için basittir. Fotorezist ve ikinci kat ultraviyole maruz kalan ve yakın temas içinde tedavi sonrası pişirme ve gelişmekte izledi o zaman. &lt;/ Li&gt; <li> Anti-stick kaplama sonuçlandı ustası. Tedavi PDMS giderilmesine yardımcı olmak için, su-8 ana yüzey, bir yapışmaz-tipi kaplama yapmak için buhar çöktürme yolu ile Silanlanmış edilebilir. Bunun için birkaç damla trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) vakum altında silan çözeltisi ile, en az bir saat için bir desikatöre içine yerleştirin. </li><li> Master ile PDMS Kalıp. Prepolimerin baz ve iyice 10:1 oranını içinde PDMS Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) ve curer karıştırılır. Hiçbir hava kabarcığı görülür kadar vakumlu gaz giderme için bir desikatörde yerleştirin. Yeni hava kabarcığı geçilirse tekrar maske ve degas üzerine karışımı dökün. Oda sıcaklığına kadar soğuduktan sonra 90 C&#39;de 2 saat boyunca düz bir ocak üzerinde kalıp Cure, yavaşça PDMS damga bırakın. Böylece, kültür kanalları PDMS kazınmış ve cihaz montajı için hazırdır. O kırık veya aşınmış kadar ana kalıplama için tekrar kullanılabilir. Yapışmayı önleyici kaplama yapışkanlık kavuşur tekrar yapılması gerekmektedir. </li></ol> 3.Mikroakışkan cihazları ve hücre kültürü Meclisi (Şekil 2) Kültür hücreleri için, özelliği, oyulmuş-PDMS pul kapalı kanallar oluşturmak üzere bir cam lamel eklenir. Giriş ve çıkışları kültür / medya yükleme için oluşturulur. Bu arada, temizleme ve cam yüzey ve PDMS damgası diğer prosedürler hücre uyumluluk sağlamak için gereklidir. <ol><li> Biyopsi delgeç kullanarak PDMS damga ile rezervuarlar olun. Biz onların çapı 6 mm olarak seçin. Bu tanklar iki amaca hizmet eder. Bir hücre büyümesi için ekstra besin tutmaktır. Diğer pipet yükleme ve vakum aspirasyon erişim içindir. </li><li> 30 dakika için% 70 etanol içinde PDMS pul daldırın ve daha sonra başka bir 10 dakika süreyle de-iyonize su ile durulayın. Amacı üretim sürecinde tanıttı ve PDMS kontaminasyon Çaprazbağlanmamış potansiyel organik artıklardan temizlemek için. Gibi organik ekstraksiyonu 13 gibi daha yoğun ve kapsamlı bir temizlik işlemleri </sup&gt; Ve Soxhlet ekstraksiyonu 14 yerde kullanılmıştır. Bununla birlikte, BTSC kültür içinde gereksiz bulundu. </li><li> Otoklav (121 ° C, 35 dk) ile PDMS damga sterilize edin. Bu adım öteye PDMS kroslink reaksiyonu tamamlar. Bu adımdan başlayarak ve adım 3.6 kadar, tüm işlemler steril bir şekilde alınır. </li><li> PDMS damga sonra daha önce poli-L-lisin ile kaplanmış bir cam lamel üzerinde yerleştirilir. 15-17 cihaz daha sonra gece boyunca 37 laminin çözeltisi ile kanal ° C dolgu ile laminin ile kaplanır Laminin cihazdan aspire edilir ve cihaz kök hücre ortamı ile yıkanır. </li><li> Rezervuar ve kanal içine adım 1&#39;den hücre süspansiyonu yükleyin. Ayrılmış hücreleri 11 ul bir tohum rezervuar içine yerleştirilir. Vakum aspirasyon gerekirse, tohum odasına hücreleri zorlamak için kullanılır. Hücrelerin bir ek 7 ul bitişik tohumlama rezervuar yerleştirilmiştir. Not: Ortalama hücre yoğunluğu 20.000 hücre / mikrolitre ortamdır. Kıçtaer beş dakika, tohumlama ve alıcı rezervuarları medya ile su basmış. </li><li> Üstüne 0.5-1 mm ön otoklavlanmış PDMS yaprak yerleştirin. İki PDMS adet arasında doğal oluşmuş yüzey adezyon hücre kültürü mühürlü ve ulaşım, kuluçka ve mikroskopik görüntüleme için hazır hale getirecektir. </li></ol> 4. BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, ABD) ile BTSC göç Uzun vadeli time-lapse görüntüleme. Kamera birleştiren, yazılım ve inkübatör tek bir kutuya, bu mikroskobik sistemi gün boyunca hiçbir rahatsızlık ile görüntü hücresi kültürünü mümkün kılar. Buna ek olarak, eşsiz motor tasarımı objektif lens hareket eder ve nokta-Ziyaret özelliği sabit örnek sahne tutar. Bu high-throughput tahlil görüntü paralel deneyler ve parça hücre lokomosyon için pratik yapar. <ol><li> Pre-denge sıcaklık, nem ve hava besleme stabilize etmek için 45 dakika boyunca Biostation IM. Birçok su işletmelerinin eklenmesiörnek odası içinde ained bulaşık uygun nem sağlamak için kullanılır. </li><li> Mikroskop numune odasında hücre yeten aygıtı yükleyin ve merkezi bu mikro cımbız kullanarak. </li><li> Biostation yazılım odak, pozisyon noktaları ve zaman noktaları ayarlama ve time-lapse başlatın. </li></ol> 5. Temsilcisi sonuçları: Bir bölümlere Mikroakışkan cihaz kullanarak kanser hücresi göç görsel denetim ve karakterizasyon örnekleri Şekil 3 ve Şekil 4 de gösterilmiştir. Hücre hattı BTSC olduğunu. Mevcut kurulum sayesinde, hücre kültürü faz görüntüleri sürekli 5 gün (Şekil 3) gibi uzun ve her 2 saniyede bir (Şekil 4) gibi sık olarak için kaydedilebilir. 5 gün ötesinde, kültür ortamı kaldırıldı besin ikmal ve atıklar için değiştirilmesi gerekir. Bizim uzun vadeli time-lapse morfolojik değişikliklere göre, geçiş sırasında altı hücreli aşamadan döner bir dizi tanımlar. Illu gibiŞekil 3 &#39;de trated, (i) geçiş öncesi, (ii) başlaması, (iii)-arama yolu, (iv), (v) hedef-exloration ve (vi)-sonrası göç seyir olarak adlandırılmaktadır. Alma odası olarak, iğ şekilli hücreler, büyümek bölmek ve yavaş yavaş göç edebiliyoruz toplu tümörlerde aşama (i) içinde kalmak. Onlar mikrokanal girişinde yaklaşırken, birkaç hücre sahnelemeye devam (ii) yapışkan çıkıntı genişletmek ve oluşturduğunuzda. Sadece biri girişinde işgal ve göç yönünün keşfedebilirsiniz aşaması (iii), devam edebilir. Hücre göçü yönünü belirler sonra, tüm mikrokanal yoluyla taşınan bir sabit ve yüksek hızı, mikrokanal yoluyla seyir (iv) aşamasında ilerler. Aşama (vi) daha sonra oda alma araştırmak açık alan, ve aşama (v) mikrokanal, hücre ilerler sonunda. Mikrokanal olarak, geçiş güç çoğunlukla, şekil 4&#39;te gösterildiği gibi faaliyet blebbing ile amoeboid cel ile benzer oluşturulurl. Hücre blebbing ve membran deformasyon tam burada kaydedilir. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Mikroakışkan cihazın imalat Şemaları. Tüm süreç yumuşak litografi bir modifiye tekniği ile 3-inç silikon kolu gofret üzerinde yapılır. 3-mikron yüksekliğindeki mikro ve hizalama belirteçler birinci tabaka olarak yapılır. Hizalama işaretleri séloteyip ile örtülü iken sonra 250 mikron kalınlığında su-8 daha sonra kalın fotorezist tarafından görme engelleme olmadan ortalayıcı maskelemek için erişilebilir olabilir, öyle ki, spin-kaplamalıdır. Bu nedenle, oda özellikler i ikinci tabaka olarak yapılabilir ve doğru bir şekilde birinci katman ile hizalanır. PDMS damga sonunda çıkan ana kapalı kalıplanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Cihaz montajı ve hücre ekimi süreci Şemaları. PDMS ve gl ile çevrilieşek lamel, 3D kültür alanı odaları, rezervuarlar ve mikrokanallardaki oluşmaktadır. Alıcı bölme, başlangıçta hücre içermeyen ortam ile dolu iken tohum haznesi, hücre kültürü ile doldurulur. Aralarındaki bağlantı mikrokanallar tarafı alıcı tohumlama taraftan hücre göç rotası sağlar. <img src="/files/ftp_upload/3297/3297fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Mikrokanal yoluyla Şekil 3. BTSC göç. Üst: time-lapse anlık tek bir hücre (yeşil vurgulanır) tohumlama taraftan alıcı tarafa 400 mikron üzerinde geçirir göstermektedir. Tüm yolculuk hücrenin morfolojik değişikliklerin bir dizi içeren, yaklaşık 2 gün sürer. Ölçek çubuğu 40 mikron. Alt: Altı göç dönemlerinde bir karikatür gösterimi. Pre-migration (i): seeding odasında, iğ şeklinde ve bölünebilir hücrelerinin yavaş yavaş birbiri boyunca göç ederler. Hücre gövdesi ve e kutuplaştırıcı birbirleri ile mikrokanal girişinde yarış yakın hücreler<html> lamellipodia çıkıntı xerting. Başlatma (ii): rakiplerinden geri çekilmek olurken en yüksek kapasiteye sahip göçmen hücresi kanal girişinde kaplar. Yol keşif (iii): az polaritesi ile amoeboid moduna göçmen hücre değişiklikleri. Bu göç modu son derece hareketli ve küçük membran çıkıntılar blebbing bütün yönlerde yol keşfetmek mümkün. Normal (iv): geçiş yolu belirlendikten sonra, hücre ileri gitmeden bir ek büyük çıkıntı koruyarak bir uyarlanmış amoeboid moduna dönüşür. Bu şekilde, yüksek bir hücre hareketliliği hem de sabit bir yönü ve hızının destekler. Hedef keşif (v): yol-sona ermesinde, hücre yavaşlar ve herhangi bir işgali hedef alma odası keşfetmek filopodias geliştirir. Post-göç (vi): Alıcı odasına girdikten sonra, hücre yıldız şeklinde dönüşür ve yüksek motilite ama hiçbir yönü belirlenir korur. &quot;/&gt; . (AB): time-lapse Şekil 4 Anlık bir BTSC aktivite ve membran deformasyon blebbing döngüsünü gösteriyor. başlatılması; (BD). Genleşme; (DF). Retraksiyon. Ok ve eğri çizgiler yön ve membran deformasyon konumu, sırasıyla temsil eder. Anlık her 8 saniyede bir toplanır.

<ol>
	<li>Carke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Stem+Cells-Perspectives+on+Current+Status+and+Future+Directions.">Cancer Stem Cells-Perspectives on Current Status and Future Directions.</a> AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research. 66, 9339-9344 (2006).</li><li>Stupp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352, 987-996 (2005).</li><li>Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cancer+cell+invasion.">Mechanisms of cancer cell invasion.</a> Current Opinion in Genetics &#38; Development. 15, 87-96 (2005).</li><li>Shackleton, M., Quintana, E., Fearon, E. R., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+Cancer:+Cancer+Stem+Cells+versus+Clonal+Evolution.">Heterogeneity in Cancer: Cancer Stem Cells versus Clonal Evolution.</a> Cell. 138, 822-829 (2009).</li><li>Karnoub, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+within+tumour+stroma+promote+breast+cancer+metastasis.">Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 449, 557-557 (2007).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+Devices:+New+Tools+for+Studying+Cancer+and+Cancer+Stem+Cell+Migration.">Microfluidics-based Devices: New Tools for Studying Cancer and Cancer Stem Cell Migration.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li><li>Rolli, C. G., Seufferlein, T., Kemkemer, R., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Tumor+Cell+Cytoskeleton+Organization+on+Invasiveness+and+Migration:+A+Microchannel-Based+Approach.">Impact of Tumor Cell Cytoskeleton Organization on Invasiveness and Migration: A Microchannel-Based Approach.</a> Plos One. 5, (2010).</li><li>Chung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+scaffolds+under+co-culture+conditions+in+a+microfluidic+platform.">Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform.</a> Lab on a Chip. 9, 269-275 (2009).</li><li>Irimia, D., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+migration+of+cancer+cells+under+conditions+of+mechanical+confinement.">Spontaneous migration of cancer cells under conditions of mechanical confinement.</a> Integrative Biology. 1, 506-512 (2009).</li><li>Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells.">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85, 141-152 (1998).</li><li>Clark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+cancer+stem+cells+exhibit+decreased+dependence+on+exogenous+growth+factors+for+proliferation+and+survival.">Glioblastoma cancer stem cells exhibit decreased dependence on exogenous growth factors for proliferation and survival.</a> , .</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37, 551-575 (1998).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab on a Chip. 7, 987-994 (2007).</li><li>Regehr, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab on a Chip. 9, 2132-2139 (2009).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nature Cell Biology. 9, 1347-1347 (2007).</li><li>Hu, X. D., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Dynamic+Microtubule+Invasion+of+Dendritic+Spines.">Activity-Dependent Dynamic Microtubule Invasion of Dendritic Spines.</a> Journal of Neuroscience. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Vitzthum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+Na(+)/H(+)+exchange-mediated+pH(i)+regulations+in+neuronal+soma+and+neurites+in+compartmentalized+microfluidic+devices.">Study of Na(+)/H(+) exchange-mediated pH(i) regulations in neuronal soma and neurites in compartmentalized microfluidic devices.</a> Integrative Biology. 2, 58-64 (2010).</li><li>Clark, P. A., Treisman, D. M., Ebben, J., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+signaling+pathways+in+brain+tumor-derived+stem-like+cells.">Developmental signaling pathways in brain tumor-derived stem-like cells.</a> Developmental Dynamics. 236, 3297-3308 (2007).</li><li>Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hierarchy+of+Self-Renewing+Tumor-Initiating+Cell+Types+in+Glioblastoma.">A Hierarchy of Self-Renewing Tumor-Initiating Cell Types in Glioblastoma.</a> Cancer Cell. 17, 362-375 (2010).</li><li>Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+Stem+Cell+Lines+Expanded+in+Adherent+Culture+Have+Tumor-Specific+Phenotypes+and+Are+Suitable+for+Chemical+and+Genetic+Screens.">Glioma Stem Cell Lines Expanded in Adherent Culture Have Tumor-Specific Phenotypes and Are Suitable for Chemical and Genetic Screens.</a> Cell Stem Cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Lobo, N. A., Shimono, Y., Qian, D., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+cancer+stem+cells.">The biology of cancer stem cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 675-699 (2007).</li><li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396-401 (2004).</li><li>Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).</li><li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumorigenic,+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma.">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Research. 64, 7011-7021 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan mikroakışkan cihaz ve görüntü kayıt tekniği göç sırasında hücresel morfoloji görsel bir karakterizasyonu sağlar. Mevcut konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırıldığında, mikroakışkan platformu maliyet etkinliği, yüksek verimlilik ve tasarım esnekliği avantajları bulunmaktadır. Sunulan mikroskopik görüntüleme sistemi uzun vadeli canlı hücre göçü çalışma ve kayıt verir. Lens motorlu özelliği örnek bozmadan görüntü çözünürlüğü yüksek birden göç yolları izlemek mümkün kılar. Cihazın montaj sırasında, mühür PDMS kalıcı olmayan PDL kaplama kolaylık (adım 3.4) için cam lamel yapıştırılır. Bu protokolün başarısına için iyi bir sızdırmazlık elde etmek için çok önemlidir. Bu tür yüzey üzerine damga veya toz / enkaz içinde hava kabarcığı gibi aygıt fabrikasyonu, tanıttı Kontaminasyon Sızan sıvının içinde yapıştırma ve sonucu tehlikeye atabilir. Bu nedenle, treating tozsuz bir şekilde aygıtı başarısızlığı önlemek için önemlidir. Önceki PDL-kaplama, cam lameller nitrik asit ile tedavi edilir PDL çözelti toz / artıkları yok etmek için santrifüje tabi tutulur. Bir temiz oda erişilebilir değilse biz, alkol durulama, seloteyp bulmak ve PDMS damga toz / enkaz kaldırma su banyosu çok yararlı. PDMS damga cam lamel temas yaptıktan sonra, cımbız ile hafifçe damga vurma mühür kolaylaştırır. BTSCs 10 normal nöral kök hücre kültürüne benzer kök hücre orta alanda kültür yoluyla insan ameliyathane örneklerden zenginleştirilebilir. Bu şekilde zenginleştirilmiş BTSCs tür kök hücre belirteçlerinin ekspresyonu (CD133, nestin), birden fazla nöral soylar (glial ve nöronal) farklılaşma ve 100 gibi az bir ortotopik immünyetmezligi fare modelinde tümör başlatılması gibi kök hücre benzeri özellikler, göstermek hücreler 18. Bazı tartışmalar purifi hakkında mevcut olmasına rağmenkatyon ve BTSCs 1, 19-21 bakım, küre-yetiştirilen BTSCs iyi ebeveyn tümör 22-24 fenotip ve genotip korumak. Bölümlere alan hücre göçü için fizyolojik ortam taklit eder. Bizim cihazda, BTSC hücresel morfoloji düzenleyerek bir boyut kısıtlı uzayda göç güçlü bir kapasite gösterirler. Hücre morfolojik değişiklik gösterir karakterizasyonu bitişik beyin BTSC işgalinin bir muhtemel yeni bir ayrıntılı açıklama modellemek olabilir altı aşama sırası modu-dönüşümler gösterir. Erken evrelerde, hücre polarite önemli miktarda kazanmak ve etkili bir mikrokanal içinde kendilerini tutturmak için yapışkan çıkıntılar oluşturur. Mikrokanaldaki hücre doluluk kurulduktan sonra, bir seyir moduna dönüştürür ve bir mikrokanal yoluyla tüm yolculuk için bu modu korur. Bu aşamada, BTSC yüksek motilite ve tutarlı bir yönü korumak ancak enerji tasarrufu. Içindeterestingly, bu mikrokanal biri böyle, bir defada bir seyir hücre sınırlı olduğu göründüğünde bu aşamada tek bir hücrenin gelirleri, mikrokanal diğer hücreleri geri çekilme. Bu mekanizma olasılıkla yayılan tümör etkinliği sağlar ve mikrokanal besinlerin aşırı tüketim önler. Mikrokanal boyunca göç tamamladıktan sonra, bir hücre yönlü çıkıntılar ve işgali hedefler veya yeni göç yolları için daha ileri araştırmalar için onun eğilimi kavuşur. Bölümlere Mikroakışkan cihaz in vitro bir roman beyin parankiminde BTSC infiltrasyon çalışmak için bir mikro yaratma anlamına gelir sunuyor. Bu yöntem, kolaylıkla kanser kök hücre (CSC) ve diğer tümör tipleri türetilen göç hücre hatları çalışmaya adapte edilebilir. Mikroakışkan cihaz Kültürleme hücrelerin inkübatör ve doku kültürü uzmanlığı ile donatılmış herhangi bir modern biyoloji laboratuvarlarında yapılabilmektedir. Su-8 master, PDMS ile donatılmışdöküm ve cihaz montajı yumuşak litografi bazı temel eğitim ile mümkün bulunmaktadır. Buna ek olarak, bu platformu aynı zamanda, gradyan karıştırıcı, yüzey modelleme, sıvı kontrolü ve mikroelektrot gibi diğer işlevsel modül entegre ile diğer uygulamalar için uzatılabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Dulbecco modifiye kartal ortamı (DMEM), yüksek glukoz </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Ham&#39;ın F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 31765 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> B27 takviyesi eksi A vitamini </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 12587-010 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Antibiyotik-Antimikotik (PSA) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15240 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), rekombinant insan </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0313 &lt;/ Td&gt; <td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF), rekombinant insan </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> PHG0021 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Domuz intestinal mukozadan Heparin sodyum tuzu, </td><td> Sigma </td><td> H1027-250KU </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Laminin (doğal fare) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td> Beyin tümörü kök hücre (BTSC) kültür malzemeleri </td></tr><tr><td> Hücre orta Kök </td><td></td><td></td><td><ul><li> % 30 Hams F12 </li><li> 70% DMEM </li><li> % 1 antibiyotik antimikotik </li><li> A vitamini olmadan% 2 B27 </li><li> EGF (20 ng / ml) ve bFGF / heparin (20 ng/ Ml bFGF, 5 mg / ml heparin) Karışım maddeleri ve kullanımdan önce steril filtre </li></ul></td></tr><tr><td> Bazik Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF) / Heparin </td><td></td><td></td><td><ul><li> Tablet konsantrasyon 20 ug / ml </li><li> 25 ug için: 25 ug bFGF ile 5mg/mL, heparinin 1.25 mL ekleyin. </li><li> 250 mikrogram için: 250 mcg bFGF ile 1 ml 5mg/mL Heparin ekleyin. Konik 15 mL aktarın ve konik 11.5 ml 5 mg / ml heparin ekleyin. </li><li> -80 50 ul veya 250 ul hacimde ° C olarak Mağazası </li></ul></td></tr><tr><td> Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) </td><td></td><td></td><td><ul><li> Tablet konsantrasyon 20 ug / ml </li><li> 200 mikrogram için: 200 mikrogram EGF ile 1 ml steril DMEM (Gibco 11965-118) ekleyin. 15 ml konik aktarın ve 9 mL DMEM ekleyin. </li><li> 500 mikrogram için: 200 mikrogram EGF ile 1 ml steril DMEM (Gibco 11965-118) ekleyin. 50 ml konik aktarın ve 24 ml DMEM ekleyin. <li> 50 &amp; mu gibi saklayın; L veya -80 250 ul alikotları ° C. </li></ul></td></tr><tr><td> Heparin </td><td></td><td></td><td><ul><li> Tablet konsantrasyonu 5 mg / ml &#39; </li><li> 100 mg heparin tartılır. </li><li> 20 ml (% 70)-DMEM (% 30) F12 (% 1) PSA (14 mL DMEM, 6 mL F12, 200 ul PSA) &#39;dan 100 mg heparin ekleme </li><li> Steril filtre </li><li> -80 ° C&#39;de 50 ul veya 250 ul alikotları olarak Mağazası </li></ul></td></tr><tr><td> su-8 fotorezist </td><td> MICROCHEM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Silikon sap gofret </td><td> WRS Malzemeleri </td><td> 3P01-5SSP-INV </td><td></td></tr><tr><td> trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448931 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Sylgard 184 </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> 50 mikrogram /nihai konsantrasyon için PBS tamponu içinde mL </td></tr><tr><td> Biostation IM </td><td> Nikon aletleri </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging

Son 40 yıl içinde, ABD&#39;de ölüm oranı sadece% 5&#39;lik bir azalma ile sonuçlanan, kanser araştırmalarına 200 milyar doların üzerinde yatırım yaptı. Hasta sonuçlarını geliştirmek için önemli bir engel agresif kanser hücresi invazyonu, metastaz ve terapötik direnç 1 ile ilişkili hücresel göç yatan mekanizmaların yetersiz anlayışı. Glioblastoma multiforme (GBM), en sık görülen habis yetişkin beyin tümörü 2, bu zorluk örneğidir. Standart cerrahi, radyasyon ve kemoterapi rağmen, hastanın ortalama sağkalım komşu beyin ve hızlı kanseri nüks 2 içine agresif GBM infiltrasyonu nedeniyle sadece onbeş ay vardır. Anormal hücre göç mekanizmaları ve tümör mikroçevresinin etkileşimler 3 normal hücrelerden kanseri ayırt. Bu nedenle, GBM için terapötik yaklaşımlar iyileştirilmesi kanser hücre göçü mekanizmaların daha iyi anlaşılması gerekir. Son çalışmalar tha anlaşılacağıGBM&#39;da hücrelerin ta küçük subpopülasyonu, beyin tümörü kök hücre (BTSC), tedaviye dirençli ve nüks sorumlu olabilir. BTSC göç kapasitesinin altında yatan mekanizmaların yalnızca karakterize 1,4 olmaya başlıyor. Görsel denetim ve geometrik manipülasyon, genel migrasyon testleri 5 bir sınırlama nedeniyle genel hücre popülasyonlarının miktarının sınırlıdır. Buna karşılık, mikroakışkan cihazlar çünkü modern mikroskopi ve mikro-çevre 6-9 üzerinde kontrol ile uyumluluk tek hücre analizi izin. Biz bölümlere mikroakışkan cihazları kullanarak BTSC göç detaylı karakterizasyonu için bir yöntem mevcut. Bu PDMS yapımı aygıtları birbirine bağlı üç bölmeye doku kültürü ortamında cast:, kamara tohum haznesi alma ve mikrokanallar köprü. Biz her iki odacıkta da 4-5 için geçerli BTSC desteklemek için yeterli ortam tutun böyle cihaz tasarlandıOrtam değişimi olmadan ys. Ilk tohumlama odasına girmiş Highly mobil BTSCs paralel alıcı odasına mikrokanallardaki köprü olsa göç sonra izole edilmiştir. Bu göç beyin interstisyel boşluklar sayesinde kanserli hücre yayılmasını taklit eder. Göç sırasında hücre morfolojisi faz canlı görüntüleri birkaç gün boyunca kaydedilir. Göç eden BTSC bu nedenle, recultured izole edilmiş olabilir, ve daha fazla analiz edebilir. Bölümlere mikroakışkanları BTSCs ve diğer kanser kök hücrelerinin göç davranışlarını incelemek için çok yönlü bir platform olabilir. Gradyan jeneratörler, sıvı taşıma, mikro-elektrotlar ve diğer mikroakış modüller bir araya getirerek, bu cihazlar ayrıca, ilaç tarama ve hastalık teşhis 6 için de kullanılabilir. Göç hücreleri saldırgan bir subpopülasyonu izolasyonu moleküler mekanizmalar çalışmaları sağlayacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging at JoVE.com

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Bölümlere Mikroakışkan Cihazlar ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma Kanser Kök Hücre Göç Değerlendirilmesi

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

evaluation-cancer-stem-cell-migration-using-compartmentalizing

Research

JoVE Journal

Medicine

25.2K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. Kanser kök hücre göçü araştırılması için bir bölme oluşturan mikroakışkan cihaz tarif edilmektedir. Bu yeni platform canlı hücresel mikroçevrede oluşturur ve canlı hücre lokomosyon mikroskobik görselleştirme sağlar. Son derece hareketli kanser hücrelerinin potansiyel olarak daha etkin gelecekteki tedaviler neden agresif infiltrasyon moleküler mekanizmaları, çalışma izole edilmiştir.

Video: Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Oral Skuamöz Hücre Karsinomu Ortotopik Fare Modeli Tümör Hücre Invasion Multi-foton Görüntüleme

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Tıp

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

Tümör 4D Canlı hücre Görüntüleme için MAME Modeller: Mikroçevre etkileşimler olduğunu Etki Malign İlerlemesi

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Sıralama Kök Hücre Tahliller ve Akış Primer Beyin Tümörü Doku İşleme

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

3-Boyutlu Reçine Döküm ve Fare Portal Ven veya intrahepatik safra Sisteminin Görüntüleme

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

İnsan Hücre Lines Kemorezistans Yumurtalık Kanser Kök Hücreleri Zenginleştirme

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.