The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.

1. Hücre Kültürü <ol><li> Tohum 3x10 75 cm bir şişe içinde, tam büyüme ortamında 10 10 ml 5 HUVEC hücreleri. </li><li> 70-80% konfluansa CO2,% 5 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li></ol> 2. borucuk oluşumu Deneyi <ol><li> 4 ° C &#39;de bir gece boyunca buz üzerinde büyüme faktörü azaltılmış (GFR) hücre dışı matrisi veya normal hücre dışı matrisi ya da çözülme. Not: &#39;ekstraselüler matriks&#39; kısalık uğruna bundan sonra GFR ve normal hücre dışı matriks hem başvurmak için kullanılır. bunları hazırlamak için proses ile aynıdır. </li><li> Buz üzerinde 96 oyuklu kültür plakaları tutmak ve de önceden soğutulmuş ipuçlarını kullanılarak göz başına soğutulmuş hücre dışı matrisin 50 ul ekle. Yalnızca normal hücre dışı matriks içeren 5 kuyu üç kopya hazırlayın. Sadece GFR hücre dışı matriks içeren 5 kuyu başka üç nüsha hazırlayınız. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de 96 oyuklu plaka inkübe edin. </li><li> HUVECler yıkayınbir kez fosfat tamponlu kalsiyum ve magnezyum (PBS) olmadan çözelti ve 1 ml% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. En Hücreler kadar yuvarlak kadar hücreleri her dakika kontrol 1-5 dakika süreyle 37 ° C&#39;de çanak inkübe edin. bir kez balon dokunarak hücreleri çıkarmak. <ol><li> 5 ml bazal ortamı ekleme% 1 Fötal Sığır Serumu (FBS) ile (herhangi bir şey, yani endotelyal hücre büyüme ortamı (örneğin, ek) ilave edildi). pipetleme şişede hücreleri toplamak ve 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer. 5 dakika boyunca 200 xg&#39;de hücreleri Santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 2 ml bazal ortam ile yeniden askıya hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 2-3 x 10 5 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlanır. </li></ol></li><li> bazal ortamda CXCR2 önleyicisi SB225002 aşağıdaki 10x konsantrasyonlarda 100 ul hazırlanması: 11 uM, 5.6 uM, 1.1 uM, 0.56 uM ve 0 uM (kontrol). </li><li> Her 5 MICR içine HUVEC süspansiyon 300 ul pipetocentrifuge borular. inhibitör konsantrasyonu 33 ul ekle (11 uM, 5.6 uM, 1.1 uM, 0.56 uM ve 0 uM), bir tüp içine HUVECler ve vorteks içeren. </li><li> Pipet hücre dışı matrisin ayrı ayrı gözlere hücre süspansiyonları (1-1.5 x 10 4 hücreleri) her birinin 50 ul. Üç kez, her süspansiyon plaka ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 seviyesinde 4-16 saat süreyle inkübe edin. </li><li> 4-16 saat sonra, iyi bir ters mikroskop kamera 11 (orijinal büyütme x 100) ile başına oluşan tüplerin 4 fotoğraf çekmek. </li></ol> 3. tübül bozulması Testi <ol><li> Tüp Oluşumu Testi (2.3 2.1 adımları) ile aynı özelliklere göre hücre dışı matriks ve tabak hazırlayın. </li><li> &#39;Deki gibi 2.4- tüp formasyonu deneyi ve kısım 2.4.2 hücre dışı matris içeren bir 96-çukurlu plaka içinde göz başına 50 ul olmak HUVEC süspansiyonu hazırlanır. Not: Yeterince kuyu s PlakalıBu o ilaç tedavisine başına 3 kuyu vardır. </li><li> 37 ° C&#39;de 4 saat hücre dışı matris üzerinde hücreler büyümek,% 5 CO2. İlaç tedavisine başlanmadan önce görüntüleri çekin. </li><li> Tüp formasyonu deneyi Aşama 2.5 de tarif edildiği gibi CXCR2 önleyicisi SB225002 2x konsantrasyonları hazırlamak ve HUVECler içeren 96 çukurlu bir levhanın her çukuruna Her konsantrasyondan 50 ul ekle. üç nüsha halinde her konsantrasyon Plate. </li><li> 37 ° C&#39;de bir 2-12 saat boyunca inkübasyona bırakılır,% 5 CO2. Iyi 11 (100 × orijinal büyütme) ters bir mikroskop kamera kullanarak her birinde oluşan tüplerin 4 fotoğraf çekmek. </li></ol> 4. ükler Verileri <ol><li> mikroskop kamera yazılımı kullanarak dört rastgele mikroskobik alanlarda boruların toplam boru uzunluğu ölçülerek görüntülerde yakalanan tüp oluşumunu değerlendirin. </li><li> mikroskop kamera yazılımı görüntüyü açın ve &#39;Annotations ve Ölçümleri tıklayın9 ;. &#39;Uzunluk&#39; bölümü altında, &#39;basit çizgi&#39; aracını seçin. daha sonra sağ tıklayın, tüpün uzunluğu boyunca bir çizgi çizin, resmin üzerine tıklayın. Not: Yazılım otomatik piksel hattının uzunluğunu hesaplamak ve bir dosyaya veri koyacağız. </li><li> &#39;Basit çizgi&#39; aracını seçerek görüntüdeki tüm boru hatları için aynı işlemi tekrarlayın. daha sonra sağ tıklayın, tüpün uzunluğu boyunca bir çizgi çizin, resmin üzerine tıklayın. Not: Yazılımın her satırın uzunluğunu kaydetmek ve ekranda verileri görüntüler. </li><li> Resimde her tüp ölçüldükten sonra, daha sonra, &#39;Export&#39; tık &#39;e-tabloya Uzunluğu&#39; seçti. Not: uzunluk verileri bir elektronik tablo ihraç edilecek. </li><li> Toplam tüp uzunluğunu almak için e-tablodan boru uzunlukları tüm ekleyin. Hesaplayın ve tüplerin ortalama uzunluğu kaydedin. Not: Dört çoğaltır ortalama ve belirlenen standart sapma ile tavsiye edilir. </li></ol> Ekstrasellüler Matriks Kültür 5. kurtarma hücreler <ol><li> Kültür ve bir tüp formasyonu deneyi gerçekleştirmek yeterli hücre sayısını vermez, 96 gözlü bir levha olarak daha büyük bir ölçekte (bakınız bölüm 2). 12 gözlü levhalar için, hücre dışı matrisin 500 ul ve HUVEC hücre süspansiyonu 500 ul (1.5x10 5 hücreleri) kullanın. </li><li> tüpler oluşturmak üzere 4-16 saat boyunca inkübe hücreleri. Daha sonra, hücre kültür ortamı aspire. kalsiyum ve magnezyum içermeyen soğuk 1 x PBS, 1 ml hücre durulayın. </li><li> Kültür üzerine soğuk PBS-2.5 mM EDTA tampon 1 ml ilave edilir ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tutulur. </li><li> yıkama, ucu kesilmiş bir 1000 ul pipet kullanarak çanak hücreleri ve hücre dışı matris karışımı yerinden çıkarır ve daha sonra soğuk bir 15 ml tüp transferi de 4 ml buz gibi soğuk PBS-2.5 mM EDTA ve tüp içine yerleştirilmiş . </li><li> 1-4 saat boyunca buz üzerinde tüpler koyun ve hücre dışı her kadar tüpü birkaç kez ters çevirinMatris çözündürülür. </li><li> 0 ° C&#39;de 1.620 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüj </li><li> Buz üzerinde bir 1.ml tüpüne 1 ml soğuk PBS ile hücre pelletleri yeniden askıya. </li><li> Yine 0 ° C&#39;de 3,000 x g&#39;de 5 dakika boyunca, daha sonra üstte kalan sıvı kısmın bertaraf santrifüjlenir. </li><li> -80 ° C hücreleri saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CXCR2+enhances+chemotherapeutic+response,+inhibits+mammary+tumor+growth,+angiogenesis,+and+lung+metastasis.">Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis.</a> Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type-2+pericytes+participate+in+normal+and+tumoral+angiogenesis.">Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor-1+as+a+novel+target+for+the+antiangiogenic+treatment+of+breast+cancer.">Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer.</a> PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).</li><li>Gu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apurinic/Apyrimidinic+Endonuclease+siRNA+Inhibits+the+Angiogenesis+Induced+by+X-Ray+Irradiation+in+Lung+Cancer+Cells.">Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).</li><li>Manjunathan, R., Ragunathan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+chorioallantoic+membrane+as+a+reliable+model+to+evaluate+osteosarcoma-an+experimental+approach+using+SaOS2+cell+line.">Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line.</a> Biol Proced Online. 17, 10 (2015).</li><li>Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+inhibitor,+pentoxifylline+enhances+anticancer+activity+of+histone+deacetylase+inhibitor,+MS-275+in+human+breast+cancer+in+vitro+and+in+vivo.">Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo.</a> Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+improves+the+anti-angiogenic+activity+of+disulfiram+through+the+EGFR/src/VEGF+pathway+in+gliomas.">Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas.</a> Cancer Lett. Aug. , (2015).</li><li>Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+offer+new+insights+into+the+relationship+between+lipid+metabolism+and+angiogenesis.">Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis.</a> Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).</li><li>de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR+for+retrovirus-like+particle+quantification+in+CHO+cell+culture.">Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture.</a> Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+for+derived+from+umbililcal+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu tahlilin gerçekleştirilmesi, aksi belirtilmediği sürece, her zaman buz ya da 4 ° C&#39;de bir hücre dışı matris tutmak esastır. hücre dışı matris 4 ° C&#39;nin üzerinde ısınmaya bırakıldı, bu polimerize olur, ve deney harap. Bu temas edecek bir şey temin etmek de önemlidir (ör pipet uçları, plaka) hücre dışı matris ile önceden soğutulmuş bahsedilen nedenle içindir. Her bir oyuk tohumlandı hücre sayısı önemlidir, çok az sayıda hücre, kontrol örneğinde beklenen ağ-vermeyecektir Çok fazla sayıda hücre, büyük hücre kümeleri ya bir tek tabaka oluşturacak ve deney geçerli olmayacaktır. Bu deneyde başarısında bir başka önemli faktör, HUVEC hücre kanalı sayısıdır. geçit numarası her zaman aksi takdirde sağlam tüp oluşumu oluşabilir, on daha düşük olmalıdır. Buna ek olarak, tek bir kullanılan hücre kültürü ortamı süresi henüz sağlamalıdır veya hücreler canlı değildir. Alternatively, bir orta ve bileşenlerini kısım ve son kullanma tarihi sonra belli bir süre için muhafaza -20 ° C &#39;de saklayabilir. Tabii ki, son kullanma tarihine kadar orta kullanmak için hala tercih edilir Tüm prosedürler gibi, endotelyal hücre tüp formasyonu deneyi yürütmek için bazı dezavantajları da vardır. Önemli bir sorun, endotel hücreleri ve destek matrisi farklı olduğundan, Analizin sonuçları hücre ve matris türü kullanıldığı bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir olmasıdır. kullanılan endotel hücreleri (HUVECler, HAECs ya HMVECs) da ölümsüzleştirilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında değişkenlik alma ve için pahalı, primer hücrelerdir. Birincil hücreler, kullanım için sınırlı bir geçitler vardır ve bu nedenle, uzun dönemli anjiyojenez deneyler 14 için uygun değildir. güvenilir veri, bir zaman tayini için aynı tip kullanmalıdır. In vitro deneyler, diğer gibi bir tüp formasyonu deneyi sonuçları con olmalıdıriki boyutlu doku kültürü kontrollü ve yapay koşullarda elde edilen sonuçlar her zaman yaşayan bir organizma karmaşık biyosistemde yansıyan olmayabilir çünkü, in vivo güçlendi. Tüp oluşturan hücreler Bu tür testlerde, sadece endotel hücre tüp oluşumunu göstermek için kullanılabilir akılda tutmak önemlidir ve diğer non-endotelyal test etmek için kullanılmamalıdır. Bu tahlil, bir bileşiğin anjiyojenik potansiyelini ölçmek için oldukça basit ve hızlı bir yöntemdir. Ayrıca, tek başına olarak, bileşim henüz kabı oluşturan işlemi etkiler belirli bir mekanizma ile ilgili bilgiler elde etmez, daha başka deneyler için bir platform oluşturur. Ancak, çeşitli hücre dışı matris kullanımı ayrıca yaygın kullanılmaz araştırma sorularına yönelik bir çerçeve oluşturmak için nasıl bir örnektir. bileşenlerini hedef spesifik inhibitörleri de dahil olmak üzere bileşiğin spesifik biyo-kimyasal mekanizmaları incelemek için yaklaşımlar vardıranjiyogenez yolu. Bir başka yaklaşım ise endotel hücrelerinden RNA çıkarmak ve deneyde gözlemlenen büyüme çalışmasına yol açabilir gen ekspresyonu değişiklikleri analiz etmek için RT-PCR (Real Time PCR) 12 kullanmak olabilir. Bu yöntemin gelecekte uygulamaları anjiyogenez yolun belirli adımlar için knock-down deneyleri oluşturmak için HUVECler transfekte içerir. lenfanjiogenetik yolunu incelemek için bu yaklaşımı uygulamak için potansiyel var. hücre-dışı matris bileşenlerini değiştirerek, matris ve kanserde anjiyogenez destek veren selüler işlemin etkileşimi ortaya çıkarılabilir olabilir. Bu özel şartlar altında endotel hücrelerinden RNA ekstraksiyonu ve proteinler, ek ölçülebilir veriler veri görüntüleme karşılık gelen sağlar.

hayatta kalmak için besin gerekli elde etmek için, habis tümörler hastanın kan akışına erişim gerektirir. Bu erişim elde etmek için, tümör hücreleri böylece anjiyogenez 2 olarak bilinen normal fizyolojik süreç kaçırma, tümörün yeni kan damarlarının büyümesini teşvik kimyasal sinyalleri bırakın. Bu metastazı (yani, diğer organlara kanser yayılması) oluşabilir anjiyogenez ile oluşturulan kan damarları aracılığıyla da. Anjiyogenez süreci, kanser gibi çeşitli ilerlemesi için çok önemli olduğu için, anti-kanser terapisi araştırmaları 3 çekici bir hedeftir. anjiyojenezi ölçmek için kullanılan bir yöntem, hücre dışı bir matris üzerine yerleştirildiğinde tüpler oluşturmak üzere endotelyal progenitör hücre yeteneğini ölçmektir. Bu tüplerin oluşumu çevre koşullarına (belirli bir co örneğin, varlığı ya da eksikliği test anjiyogenez kritik bir erken adımdır, çünkümpound) teşvik veya inhibe edebilir tüp oluşumu anjiogenezisi inhibe hedeflenebilir belirli adımlar içgörü sağlar. Endotel hücre tüp oluşumu tahlil tüpleri oluşturmak üzere hücrelerin yeteneğini ölçen en yaygın olarak kullanılan 4, in vitro yöntemlerden biridir. Nispeten az sayıda bileşen ve kısa bir kültür dönemi 5 gerektiren basit bir tahlilidir. Belki de en önemlisi, tahlil bu tür elde edilen veriler ölçülebilir olmasıdır. tüp formasyonu deneyi kullanımı için bir örnek, indirgenmiş gelişme faktörü (GFR) hücre dışı matrisin genel hücre dışı matrisin üzerinde büyümüş vasküler endotel hücrelerinden tüplerin gelişmesini karşılaştırılmaktadır. laminin, tip IV kolajen, büyüme faktörleri ve proteoglikanlar hücre dışı matris sarkoma hücreleri ve ana bileşenlerinin izole edilen bir bazal membran-benzeri malzeme olduğu bulunmaktadır. Bazı bileşikler, tüpler oluşturmak için hücre yeteneği üzerinde farklı etkileriAzaltılmış büyüme faktörleri ve düşük heparan sülfat proteoglikan (HSPGs) ile bir ortam. HSPGs anlamlı GFR hücre dışı matris içinde azalır hücre dışı matrisin bir bileşenidir. Bir örnek olarak, hipotez bu HSPGs bol tüp oluşumunu durdurmak için önemli ölçüde daha zayıf yeteneğine sahip blok CXCR2 reseptörü SB225002 gibi anjiyojenez inhibitörleri, daha sonra hücre dışı matris ve GFR, hücre dışı matris içinde tüp oluşumu aktivitesi arasında bir karşılaştırma bu ise, HSPGs kontrolü yoluyla anjiyogenez inhibisyonu olasılığını keşfetmek önemlidir. Genel olarak angiogenesis üzerinde bileşiklerin etkisini belirlemek için kullanılan diğer deneyler, in vivo yöntemlerde bulunmaktadır. Bu kayda değer örnekleri tavuk yumurtası kullanılarak civciv koriyoallantoik membran (CAM) deneyi 6, ve in vivo Matrigel fareler kullanılarak anjiyogenez tahlil 7 takın. In vivo yöntemler t anjiyogenez ölçmek ikenHREE boyutları ve in vitro olarak tüp formasyonu deneyi ile karşılaştırıldığında, insan vücudunun fazla temsilcisi, önemli ölçüde daha fazla zaman gerektiren kusur acı ve önemli ölçüde daha fazlasını gerçekleştirmek zordur. CAM tahlil ve hücre dışı fiş tahlil Hem karşılaştırıldığında, tüp oluşumu tahlil tek bir gün içinde yapılabilir iken, yapmak için en az bir hafta 8 almak ve hayvan kullanımını gerektirmez. Raporda kullanılan endotelyal hücreleri, insan göbek damarı endotelial hücreleri (HUVEC) olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu hücreler, vasküler filiz ve kan damarlarının büyümesi önemli bir rol oynar, ve yeterince in vitro ve in vivo deneylerde 9 anti-anjiyojenez etkinliğini değerlendirmek için kullanılan kanserlerinde endotel hücrelerine benzer şekilde yapılır. primer mikrovasküler endotel hücreleri gibi diğer hücreler de kullanılabilir. Alt taşımasının yanısıra dikkat etmek de önemlidirNormal hücre dışı matris ile karşılaştırıldığında HSPGs düzeyleri de GFR hücre dışı matris bir çok bileşenlerinin seviyelerinin azalttı. Dahil, ancak bunlarla sınırlı değildir: EGF, IGF-1, PDGF ve TGF-beta. anjiyogenez ile ilgili bu bileşiklerin önemini okuyan performans deneyleri GFH hücre dışı matriks kullanarak ilginizi çekebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9525043</td>
			<td>HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-&#946; (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin.&#160; Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40230&#160;</td>
			<td>Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC , warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40234&#160;</td>
			<td>extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB225002</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>559405</td>
			<td>CXCR2 inhibitor, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in room temperature&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)&#160;</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories&#160;</td>
			<td>8000</td>
			<td>culture it according reference&#160; 10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%-EDTA phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>keep in 4 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph-pad Prism 5</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>scientific 2D graphing and&#160;statistics software, to calculate IC50.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategic endothelial cell tube formation assay: comparing extracellular matrix and growth factor reduced extracellular matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

Önemli, sağlıklı endotel tüp oluşumu kolayca mikroskopi görüntüleri inhibe tüp oluşumuna tezat olabilir. Sağlıklı tüp oluşumu kılcal geçiş benzeri yapılar (Şekil 1) bir organize ağ gibi görünür. Buna karşılık, inhibe tüp oluşumu dağınık hücreleri (Şekil 2) olarak tezahür eder. Tüp formasyonu deneyi verileri kılcal tüpler (Tablo 1) toplam tüp uzunluğunu ölçerek belirlenir. Toplam boru uzunluğunun dışında, branş noktası ortalama boru uzunluğu, tüplerin sayısı veya toplam sayısı ölçülebilir. Yapılandırılmış tüp oluşumu dağınık inhibe tüp büyüme daha fazla net tüp uzunluğunu verir. Şekil 3&#39;te, bir doz yanıt eğrisi GFR hücre dışı matrisin bir CXCR2 inhibitörü SB225002 ilgili HUVEC&#39;lerin deney koşulları altında IC50 hesaplanmasını mümkün kılar. Ekstrasellüler matriks ve büyüme faktörü-azaltılmış (GFH) ekstraselüler matriks Şekil 1. Endotelyal t ube oluşumu. İki görüntü ekstrasellüler matriks (A) ve GFR ekstrasellüler matriks (B) başarılı tüp oluşumunu göstermektedir. tüpler ağından açık borular büyümesi bu HUVEC sağlıklı olduğunu göstermektedir. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> Faktörün indirgenmiş (GDH) CXCR2 önleyicisi SB225002 (5.6 uM) ile hücre dışı matris hücre dışı büyüme. Tüp oluşumu Şekil 2. önlemesi, iki resim tüpü göstermektedirhücre-dışı matrisi (A) ve GFR hücre dışı matrisin (B) üzerindeki bir CXCR2 önleyicisi SB225002 (5.6 uM) ile inhibe edilmiştir oluşumu. Bu görüntü gösterisinde görülen HUVEC hücrelerinin izole kümeleri hücreleri birbirine bağlamak için gerekli tüpler oluşturmak mümkün değildi. Ölçek çubuğu = 10 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> Büyüme faktörü indirgenmiş (GFR) hücre dışı matrisin Şekil 3. Doz-yanıt eğrisi. X-ekseni boru uzunluğunu ve Y-ekseni bir CXCR2 inhibitörü konsantrasyonunu göstermektedir. Doz-yanıt eğrisi GFR hücre dışı matris üzerinde CXCR2 inhibitörüne HUVEC yanıtı doza bağlı olduğunu göstermektedir. IC50 (yarı-maksimum engelleyiciY konsantrasyon), örneğin, yazılım 13 ile ve hücre dışı matris için bir doz-yanıt eğrisi ile mukayese edilebilir hesaplanmıştır. IC50% 50 yanıt azaltır inhibitör konsantrasyonudur. Hata çubukları, standart sapmayı temsil ederler. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFH) ekstraselüler matriks ve inhibitör (4 adet çoğaltır) </td><td> Toplam Tüp Uzunluğu Ortalama (piksel) (1 piksel = 0.34 um) </td><td> Standart sapma </td><td> P Değeri </td></tr><tr><td> GFR hücre dışı matris kontrolü </td><td> 2447 </td><td> 168,174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR hücre dışı matris + 0.56 uM SB225002 </td><td> 1422,5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>GFR hücre dışı matris + 1.1 uM SB225002 </td><td> 1004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2.14 x 10 -5 </td></tr><tr><td> GFR hücre dışı matris + 5.6 uM SB225002 </td><td> 519,25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4.19 x 10 -6 </td></tr><tr><td> GFR hücre dışı matris + 11 uM SB225002 </td><td> 393,75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1.21 x 10 -5 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. değişen koşullar altında büyüme faktörü indirgenmiş (GFR) hücre dışı matrisin toplam boru boyları nicel. CXCR2 bir inhibitörü değişken konsantrasyonlarda GFR hücre dışı matris üzerinde yetiştirilen örneklerde kaydedilen toplam boru boyları kullanılarak bir tablonun bir bölümü. Veri CXCR2 önleyicisi tüp oluşumunu inhibe etmediğine de işaret etmektedir. Böyle dört suretin, standart sapmanın ortalama ve P değeri olarak ilişkili değerler bulunuyor. göstermek için piksel cinsinden ölçülürihraç edilmektedir verileri. IC 50 istatistiksel yazılım 13 kullanılarak hesaplanabilir. (1 piksel = 0.34 um)

Watch this Scientific Journal Video about Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix at JoVE.com

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Stratejik Endotel Hücre Tüp Oluşumu Testi: Azaltılmış Ekstrasellüler Matrix Ekstrasellüler Matrix ve Büyüme Faktörü Karşılaştırılması

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

strategic-endothelial-cell-tube-formation-assay-comparing

Research

JoVE Journal

Medicine

13.3K Görüntüleme.  Wayne State University School of Medicine. This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Video: Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Tıp

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated cartilage lesions lead to ongoing pain, negatively affect the quality of life and predispose for osteoarthritis. During the last decades, several surgical techniques have been developed to treat such lesions. However, until now it was not possible to achieve a full repair in terms of covering the defect with hyaline articular cartilage or of providing satisfactory long-term recovery 2-4. Therefore, articular cartilage injuries remain a prime target for regenerative techniques such as Tissue Engineering. In contrast to other surgical techniques, which often lead to the formation of fibrous or fibrocartilaginous tissue, Tissue Engineering aims at fully restoring the complex structure and properties of the original articular cartilage by using the chondrogenic potential of transplanted cells. Recent developments opened up promising possibilities for regenerative cartilage therapies.
The first cell based approach for the treatment of full-thickness cartilage or osteochondral lesions was performed in 1994 by Lars Peterson and Mats Brittberg who pioneered clinical autologous chondrocyte implantation (ACI) 5. Today, the technique is clinically well-established for the treatment of large hyaline cartilage defects of the knee, maintaining good clinical results even 10 to 20 years after implantation 6. In recent years, the implantation of autologous chondrocytes underwent a rapid progression. The use of an artificial three-dimensional collagen-matrix on which cells are subsequently replanted became more and more popular 7-9.
MACT comprises of two surgical procedures: First, in order to collect chondrocytes, a cartilage biopsy needs to be performed from a non weight-bearing cartilage area of the knee joint. Then, chondrocytes are being extracted, purified and expanded to a sufficient cell number in vitro. Chondrocytes are then seeded onto a three-dimensional matrix and can subsequently be re-implanted. When preparing a tissue-engineered implant, proliferation rate and differentiation capacity are crucial for a successful tissue regeneration 10. The use of a three-dimensional matrix as a cell carrier is thought to support these cellular characteristics 11.
The following protocol will summarize and demonstrate a technique for the isolation of chondrocytes from cartilage biopsies, their proliferation in vitro and their seeding onto a 3D-matrix (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Switzerland). Finally, the implantation of the cell-matrix-constructs into artificially created chondral defects of a rabbit's knee joint will be described. This technique can be used as an experimental setting for further experiments of cartilage repair.

An experimental technique for the treatment of chondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of autologous chondrocytes seeded on a matrix is a well-accepted method for the remodeling and repair of articular cartilage lesions providing satisfying long-term results. Matrix-assisted autologous chondrocyte transplantation (MACT) offers a standardized and clinically established implantation method.

Bir Tavşan Modelinde Kondral Kusurların Tadilat ve Onarım için matris destekli Otolog Kondrosit Nakli

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

İnsan Dupuytren en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Miyofibroblastların Çalışması ve Ekstrasellüler Matriks Etkileşimleri Kültür

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage and that carries factor VIII in the circulation. VWF is synthesized by endothelial cells and is either released constitutively into the plasma or is stored in specialized organelles, called Weibel-Palade bodies (WPBs), for on-demand release in response to hemostatic challenge. Procoagulant and proinflammatory stimuli can rapidly induce WPB exocytosis and VWF release. The majority of VWF released by endothelial cells circulates in the plasma; however, a proportion of VWF is anchored to the endothelial cell surface. Under conditions of physiological shear, endothelial-anchored VWF can bind to platelets, forming a VWF-platelet string that may represent the nidus of thrombus formation. A flow chamber system can be used to visually observe the release of VWF from endothelial cells and the subsequent platelet capture in a manner that is reproducible and relevant to the pathophysiology of VWF-mediated thrombus formation. Using this methodology, endothelial cells are cultured in a flow chamber and are subsequently stimulated with secretagogues to induce WPB exocytosis. Washed platelets are then perfused over the activated endothelium. The platelets are activated and subsequently bind to elongated VWF strings in the direction of fluid flow. Using extracellular histones as a procoagulant and proinflammatory stimulus, we observed increased VWF-platelet string formation on histone-treated endothelial cells compared to untreated endothelial cells. This protocol describes a quantitative, visual, and real-time assessment of the activation of VWF-platelet interactions in models of thrombosis and hemostasis.

In this paper, we describe a method to assess endothelial von Willebrand factor release and the subsequent platelet capture under fluid shear stress in response to inflammatory stimuli using an in vitro flow chamber system.

Soruşturma von Willebrand faktör patofizyolojisi kullanarak bir akışı odası Model von Willebrand faktör-trombosit dize oluşumu

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular respiration, oxidative metabolism, signal transduction, and apoptosis. Consequently, mitochondrial dysfunction is reported to play an important role in the antifungal drug tolerance and virulence of pathogenic fungi. Recent data have also led to the recognition of the importance of the mitochondria as an important contributor to fungal pathogenesis. Despite the importance of the mitochondria in fungal biology, standardized methods to understand its function are poorly developed. Here, we present a procedure to study the basal oxygen consumption rate (OCR), a measure of mitochondrial respiration, and extracellular acidification rates (ECAR), a measure of glycolytic function in C. albicans strains. The method described herein can be applied to any Candidaspp. strains without the need to purify mitochondria from the intact fungal cells. Furthermore, this protocol can also be customized to screen for inhibitors of mitochondrial function in C. albicans strains.

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Here, we present a stepwise protocol to investigate the mitochondrial respiration and glycolytic function in Candida Albicans using an extra flux analyzer.

Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Parafin-Gömülü Dokuda İnsan ve Mürin Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklarının İmmünofloresan Etiketlemesi

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...